基于Rho/Rock通路的三七茜草有效組分宮腔給藥對(duì)IUD模型大鼠子宮血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化機(jī)制研究＊

丁 楠，師 偉，王雁飛，刁翰林，王 新，程文秀，陳思儒，徐 麗

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 濟(jì)南 250014；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 濟(jì)南 250014；3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 濟(jì)南 250014；4. 山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院 濟(jì)南 250021）

宮內(nèi)節(jié)育器（Intrauterine device，IUD）是我國(guó)育齡婦女主要的避孕措施，使用比例高達(dá)49.79%[1]，具有安全、有效、經(jīng)濟(jì)、可逆等優(yōu)點(diǎn)。但育齡婦女放置IUD后，常引起子宮局部免疫因子、激素、子宮內(nèi)膜血管活性物質(zhì)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子異常，從而導(dǎo)致子宮異常出血[2]，且發(fā)病率為放環(huán)婦女的20% - 50%[3]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量與使用IUD避孕的接受度。

表1 引物名稱序列

課題組前期研究表明，IUD 出血副反應(yīng)與子宮血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cell，VSMC）表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[2]，宮寧顆?？捎行е委烮UD 出血副反應(yīng)[4,5]，可使子宮VSMC 合成型轉(zhuǎn)化成收縮型[6,7]，而目前公認(rèn)Rho/Rock 通路為VSMC 表型調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。以此為基礎(chǔ)，考慮到長(zhǎng)期服用中藥的患者依從性較低，為探索更簡(jiǎn)便的給藥途徑，選取宮寧顆粒主要有效藥物三七和茜草，制成三七茜草緩釋系統(tǒng)藥棒置入宮腔，觀察含有三七茜草有效成分的IUD 對(duì)治療IUD出血副反應(yīng)的療效，同時(shí)檢測(cè)三七茜草有效成分對(duì)血小板源性生長(zhǎng)因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）、Rho/ROCK 信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子、子宮VSCM 中收縮表型標(biāo)志基因SM22α的影響，以此探討三七茜草有效成分通過(guò)Rho/Rock 通路治療IUD 出血副反應(yīng)的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 雌性已生育大鼠40 只（購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：NO.370092000009759），體質(zhì)量（250 ± 20）g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及器材

三七茜草緩釋系統(tǒng)藥棒（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制備）；宮寧顆粒（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20010155）；大鼠血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGFA）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號(hào)JYM0640Ra）；RhoA mRNA引物，ROCKⅡ mRNA引物，SM22αmRNA，引物（武漢塞維爾生物科技有限公司）（表1）；總RNA 提取試劑盒（成都福際生物，批號(hào)RE-03011）；水合氯醛；大鼠宮內(nèi)節(jié)育器及宮內(nèi)放器[8]；大鼠固定式陰道窺器；離心機(jī)；酶標(biāo)分析儀；外科手術(shù)器械（眼科剪、眼科直鑷及彎鑷、鼻腔異物鉗）、1 mL 醫(yī)用注射器、碘伏、青霉素鈉、自制大鼠無(wú)菌單等（均由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供）。

2 方法

2.1 IUD制作

2.1.1 SQ-IUD制作

按照課題組前期研究，提取宮寧顆粒功效的主要有效藥物——三七和茜草中的三七總皂苷和茜草總醌，使用相同方法制作SQ-IUD[8]。制作完畢后，使用環(huán)氧乙烷消毒。

2.1.2 普通IUD制作

制作無(wú)藥材加入的空白緩釋藥棒，其余操作與SQ-IUD 相同，使普通IUD 與SQ-IUD 規(guī)格相同。制作完畢后，使用環(huán)氧乙烷消毒。

2.2 動(dòng)物分組

常規(guī)飼養(yǎng)1 周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白對(duì)照組（空白組）、IUD組、三七茜草有效組分宮腔給藥組（SQ-IUD 組）、宮寧顆粒灌胃組（宮寧顆粒組），每組各10 只，稱重，每組間大鼠的平均體質(zhì)量差控制在20 g 以內(nèi)，同時(shí)對(duì)每只實(shí)驗(yàn)大鼠分別標(biāo)記相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)編號(hào)。

2.3 造模方法

空白組自然飼養(yǎng)，其余各組大鼠用10%水合氯醛麻醉固定后，采用無(wú)創(chuàng)式大鼠IUD 放置方法[9]，將SQIUD 放入SQ-IUD 組大鼠的一側(cè)宮腔內(nèi)，IUD 放入IUD組及宮寧顆粒組大鼠的一側(cè)宮腔內(nèi)。各組造模后連續(xù)3 天注射2 萬(wàn)單位的青霉素，同時(shí)造模第2 天，宮寧顆粒組給予灌胃給藥，用生理鹽水按照28 g·100 mL-1配置，每日1次2 mL，連續(xù)14天。觀察造模后，大鼠飲食、精神、活動(dòng)度、陰道分泌物情況。

2.4 標(biāo)本采集及保存

造模14 天后，采集IUD 放置一側(cè)的大鼠子宮組織。使用10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后固定大鼠，將大鼠腹中部皮膚去毛，常規(guī)消毒，鋪巾，開(kāi)腹暴露子宮，觀察大鼠腹腔及子宮情況，剪取IUD 放置一側(cè)的子宮，用生理鹽水反復(fù)沖洗宮腔，并收集沖洗液，置于-80℃中保存；剪取IUD接觸區(qū)的一部分子宮組織立即投入裂解液中，嚴(yán)格按照總RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA 并將提取液及組織置于-80℃中保存；另一部分子宮組織立即放在10%中性緩沖甲醛固定液中固定，做石蠟包埋和切片。

圖1 空白組

圖2 IUD組

圖3 宮寧顆粒組

圖4 SQ-IUD組

圖5 空白組

圖6 IUD組

圖7 宮寧顆粒組

圖8 SQ-IUD組

2.5 檢測(cè)指標(biāo)

常規(guī)HE 染色，觀察子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)改變；采用免疫組化法，檢測(cè)RhoA 蛋白表達(dá)水平；檢測(cè)大鼠采用ELISA 法，檢測(cè)大鼠 PDGF 的含量；采用 PCR 法，檢測(cè)RhoA mRNA、ROCK Ⅱ mRNA 及 SM22αmRNA 的含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）形式表示，多組間比較符合正態(tài)分布的采用方差分析，不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠造模后狀態(tài)

空白組大鼠一般狀態(tài)良好，子宮無(wú)明顯水腫；IUD組一般狀態(tài)良好，子宮炎癥水腫、充血情況嚴(yán)重；宮寧顆粒組與SQ-IUD 組一般狀態(tài)與空白組無(wú)差別，宮寧顆粒組子宮水腫、充血情況較空白組嚴(yán)重，較IUD 組減輕。SQ-IUD 組子宮無(wú)明顯水腫，輕微充血（圖1-圖4）。

3.2 子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)改變

空白組上皮細(xì)胞由大量纖毛上皮和少量分泌細(xì)胞構(gòu)成，胞漿內(nèi)可見(jiàn)核下空泡。腺體由大量分泌細(xì)胞及少量纖毛細(xì)胞構(gòu)成，胞漿呈空泡狀，管腔擴(kuò)張，可見(jiàn)少量嗜酸性分泌物。間質(zhì)細(xì)胞無(wú)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。血管豐富，輕度擴(kuò)張。內(nèi)含少量紅細(xì)胞，內(nèi)皮輕度增生。IUD組上皮細(xì)胞部分脫落、粘連。腺體擴(kuò)張，內(nèi)充少量中性粒細(xì)胞。間質(zhì)重度水腫，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量含鐵血黃素，大量嗜酸粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞散在浸潤(rùn)。宮寧顆粒組表面上皮與空白組無(wú)明顯差異，部分腺體中度水腫，可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞，管腔擴(kuò)張，可見(jiàn)少量嗜酸性分泌物，間質(zhì)輕度水腫，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)中性粒細(xì)胞，較IUD 組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度輕。SQ-IUD組表面上皮細(xì)胞、腺體與空白組比較無(wú)明顯異常，間質(zhì)輕度水腫，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，較宮寧顆粒組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度輕（圖5-圖8）。

3.3 免疫組化結(jié)果

與空白組相比，各組大鼠子宮VSMC 中Rho/Rock通路相關(guān)蛋白R(shí)hoA 表達(dá)均明顯增加（P= 0.00）；與IUD 組相比，宮寧顆粒組與SQ-IUD 組的RhoA 表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）。同時(shí)，SQ-IUD組顯著低于宮寧顆粒組（P=0.00）（圖9-圖12、表2）。

圖9 空白組

圖10 IUD組

圖11 宮寧顆粒組

圖12 SQ-IUD組

表2 RhoA免疫組化結(jié)果

表3 PDGF結(jié)果（pg·mL-1）

表4 RhoA mRNA結(jié)果

表5 RockⅡ mRNA結(jié)果

3.4 ELISA法結(jié)果

與空白組相比，IUD 組、宮寧顆粒組PDGF 的含量顯著高于空白組（P=0.00；P=0.033），SQ-IUD組略高于空白組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.505）；與IUD 組相比，宮寧顆粒組與SQ-IUD 組PDGF 含量顯著降低（P= 0.00），SQ-IUD 組與宮寧顆粒組無(wú)差別（P=0.131）（表3）。

表6 SM22α mRNA結(jié)果

3.5 PCR法結(jié)果

3.5.1 RhoA mRNA

與空白組相比，IUD 組、宮寧顆粒組、SQ-IUD 組RhoA 的含量顯著高于空白組（P= 0.00）；與IUD 組相比，宮寧顆粒組與SQ-IUD 組RhoA 含量顯著降低（P=0.00）；同時(shí)SQ-IUD 組顯著低于宮寧顆粒組（P=0.00）（表4）。

3.5.2 ROCKⅡmRNA

RockⅡ mRNA 方面，與空白組比較，IUD 組的含量明顯增高（P=0.00），宮寧顆粒組與SQ-IUD 組含量升高，但結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.231；P=0.405）；與IUD 組比較，宮寧顆粒組與SQ-IUD 組均明顯降低（P=0.00）；與宮寧顆粒組比較，SQ-IUD 組降低，但結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.712）（表5）。

3.5.3 SM22αmRNA

與空白組相比，IUD 組與宮寧顆粒組中SM22α含量顯著減少（P= 0.00），SQ-IUD 組含量無(wú)明顯差異（P=0.166）；與IUD 組相比，宮寧顆粒組與SQ-IUD 組含量顯著增加（P= 0.02；P= 0.00）；與宮寧顆粒組相比，SQ-IUD組含量顯著增加（P=0.016）（表6）。

4 討論

子宮內(nèi)膜周期性變化是一種生理性創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程，子宮內(nèi)膜及其血管的發(fā)育不良和功能異常是導(dǎo)致子宮異常出血的主要原因[10,11]。課題組的前期研究證實(shí)[2,12,13]，IUD 出血副反應(yīng)患者存在子宮內(nèi)膜、血管功能異常，IUD模型大鼠存在子宮血管構(gòu)筑形態(tài)學(xué)改變，并且與VSMC 表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，表明VSCM 表型轉(zhuǎn)化可能是導(dǎo)致IUD出血副反應(yīng)的關(guān)鍵性起始步驟。

VSMC 表型可分為收縮型和合成型，當(dāng)血管受到損傷或在血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）和其他細(xì)胞因子刺激下，內(nèi)側(cè)血管平滑肌細(xì)胞將遷移到內(nèi)膜，加劇內(nèi)膜的擴(kuò)張，VSMC 由靜止-收縮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫w移-增殖-合成狀態(tài)，從收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，這個(gè)過(guò)程稱為表型轉(zhuǎn)化[14,15]。特異性標(biāo)記物的表達(dá)是描述VSMC 表型的最重要的特征之一[16]。SM22α是VSMC 的標(biāo)志基因，且僅在收縮型VSMC 中表達(dá)[17]，與VSMC 的收縮功能有直接關(guān)系，而IUD 模型大鼠VSMC 表型以合成型為主[18]，由此可見(jiàn) IUD 出血副反應(yīng)與SM22α表達(dá)為負(fù)相關(guān)。Rho/Rock 信號(hào)通路可介導(dǎo)多種平滑肌功能異常的疾病，并被公認(rèn)為VSMC 表型調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。RhoA/ROCK 信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)VSMC 的收縮，進(jìn)行一系列磷酸化/脫磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞骨架重組[19-20]。PDGF 被認(rèn)為是血管早期發(fā)育的主要因素[21]和不可或缺的調(diào)節(jié)因子[22,23]。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷或者炎癥時(shí)，其表達(dá)水平明顯增高[24]，可側(cè)面反映出炎癥反應(yīng)程度。同時(shí)，PDGF 可活化Rho，激活Rho/Rock 信號(hào)通路，引起細(xì)胞骨架重組[25]。而細(xì)胞骨架重組是細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，因此Rho/Rock 信號(hào)通路與VSMC表型轉(zhuǎn)化具有密切關(guān)系。曹飛鵬[26]等實(shí)驗(yàn)表明，使用Rho/Rock信號(hào)通路抑制劑可減少大鼠頸動(dòng)脈VSMC表型轉(zhuǎn)化，增加收縮表型VSMC 的標(biāo)志蛋白SM22α的表達(dá)。顏建英[27]發(fā)現(xiàn)，Rho/Rock 通路與子宮平滑肌收縮性及產(chǎn)后出血密切相關(guān)。綜上所述，PDGF 等生長(zhǎng)因子可刺激Rho/Rock 信號(hào)通路激活，從而引起VSMC 表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而造成放置IUD后出血的發(fā)生。

多項(xiàng)研究表明，中藥通過(guò)調(diào)控Rho/Rock 信號(hào)通路治療平滑肌細(xì)胞功能異常的疾病具有良好療效[28]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“環(huán)臥胞宮，金刃損傷”是IUD 出血副反應(yīng)的主要病因，其核心病機(jī)為“血瘀”[3]，并且易久瘀化熱。宮寧顆粒具有祛瘀清熱、止血調(diào)經(jīng)的功效，從而使“瘀血得化，血能循經(jīng)”。課題組前期研究證明，宮寧顆粒治療IUD 出血副反應(yīng)具有良好療效[4,5]，并可使子宮內(nèi)膜VSMC 合成型轉(zhuǎn)化成收縮型，抑制子宮內(nèi)膜VSMC增殖，減少出血[6,7]，影響IUD出血的相關(guān)機(jī)制。宮寧顆粒的主要成分為三七和茜草，三七具有“止血不留瘀”的特點(diǎn)，茜草可以涼血止血、活血化瘀?，F(xiàn)代藥理研究表明，三七、茜草提取物具有抗炎、止血、抗氧化等藥理作用，并且在免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等方面發(fā)揮重要作用[29,30]。吳震宇[31]等臨床觀察發(fā)現(xiàn)，三七能有效促進(jìn)玻璃體切除術(shù)后再出血患者的積血吸收，說(shuō)明三七止血效果顯著。薛露[32]等實(shí)驗(yàn)表明，茜草可有效緩解子宮內(nèi)膜增厚，達(dá)到止血效果。因此選用三七茜草制成三七茜草緩釋系統(tǒng)藥棒置入宮腔，以觀察對(duì)IUD副反應(yīng)出血的療效。

在本實(shí)驗(yàn)中，在三七茜草緩釋系統(tǒng)干預(yù)后，觀察到SQ-IUD 組較其他組子宮炎癥水腫充血情況明顯減輕（圖1～圖4），SQ-IUD 組PDGF 的含量較IUD 組顯著降低（P=0.00），但與宮寧顆粒組無(wú)差別（P=0.131），而PDGF 的含量可側(cè)面表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)程度，反映出三七茜草有效組分可明顯減少宮內(nèi)節(jié)育器造成的局部炎癥反應(yīng)，且與口服宮寧顆粒療效無(wú)明顯差別（表3）。據(jù)前文所述，PDGF 的降低會(huì)減少Rho/Rock 信號(hào)通路的激活。因此在Rho/Rock 信號(hào)通路方面，SQIUD 組的RhoA 蛋白含量顯著低于IUD 組與宮寧顆粒組（P= 0.00）（圖 9-圖 12、表 2），SQ-IUD 組 RhoA mRNA 的含量較IUD 組與宮寧顆粒組顯著降低（P=0.00），ROCKⅡmRNA的含量顯著低于IUD組，較宮寧顆粒組降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.712），反映出宮內(nèi)放置三七茜草緩釋系統(tǒng)可顯著下調(diào)Rho/Rock 通路，也與PDGF的降低減少了激活Rho/Rock信號(hào)通路有關(guān)（表4、表5）。在表型轉(zhuǎn)化方面，SQ-IUD 組的SM22αmRNA 含量顯著高于宮寧顆粒組與IUD 組（P=0.00），與空白組無(wú)明顯差別（P= 0.166）（表6），說(shuō)明宮內(nèi)放置三七茜草緩釋系統(tǒng)明顯增加了收縮表型VSMC標(biāo)志基因的含量，有將VSMC 合成型逆轉(zhuǎn)化為收縮型的可能。綜上所述，在宮腔內(nèi)放置三七茜草緩釋系統(tǒng)療效總體上優(yōu)于口服宮寧顆粒，且避免了長(zhǎng)期給藥繁瑣的不足，減少了炎癥反應(yīng)的發(fā)生，可能通過(guò)抑制Rho/Rock 信號(hào)通路的激活干預(yù)子宮內(nèi)膜VSMC 的表型轉(zhuǎn)化，從而減少VSMC 合成型的表達(dá)，減少放置IUD 后出血量，可能是預(yù)防IUD 出血副反應(yīng)的作用機(jī)制之一。為今后放環(huán)婦女出現(xiàn)出血副反應(yīng)的給藥途徑提供了新的思路，從而改善帶環(huán)婦女的生活質(zhì)量，提高患者的依從性。但本課題后續(xù)還需要應(yīng)用Rho/Rock 信號(hào)通路抑制劑進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。