淺淡水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物檢測能力驗證體會

○楊惠宇 潘發(fā)林

能力驗證是通過各實驗室之間的比對，來對一個實驗室的能力進行考核。能力驗證是檢驗實驗室檢測水平的有效手段，也是保證實驗室質(zhì)量管理體系得到有效改進的措施之一，有利于實驗室自我完善，它不僅體現(xiàn)檢測人員的技術(shù)水平，更是實驗室檢驗能力的一種體現(xiàn)。為了提高實驗室檢測能力，在做好實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制的同時，我實驗室自2016年通過硝基呋喃類代謝物檢測認證后每年都積極參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村局組織的能力驗證。單位需要在樣品簽收后96 h之內(nèi)完成檢測工作并上報結(jié)果，報告需附稱樣記錄、標準溶液配制記錄、譜圖以及標準曲線等，回收率在70%-120%之間判定結(jié)果為滿意。

1 準備工作

1.1 實驗人員

檢測人員在檢測前要做好個人防護，按照檢測方法要求準備相應的檢測試劑、器皿、儀器設(shè)備等，并按照標準方法配制試劑、標注溶液等。檢測人員要充分了解實驗原理、熟悉實驗步驟、能夠正確處理實驗中每個環(huán)節(jié)，將操作誤差降到最低，使整個檢測過程的質(zhì)量有所保障。

1.2 環(huán)境條件要求

在實驗之前將實驗室溫度調(diào)節(jié)到適宜溫度，實驗前處理室以及儀器室的溫度應控制在22-25℃。

1.3 準備器皿

準備實驗中將要用到的器皿，配制溶液時要使用經(jīng)過檢定計量合格的移液器或器皿，所有器皿在使用之前需要驗證是否漏液，新的器皿用純水清洗，用過的器皿用甲醇清洗，確保沒有殘留；必要的時候用甲醇等試劑超聲清洗。

1.4 標準溶液的配置

檢查標準物質(zhì)證書，確認標準物質(zhì)是否在有效期內(nèi)，根據(jù)標準物質(zhì)的純度以及分子量進行換算。將8種標準物質(zhì)按照標準的要求進行配置，分別配置成濃度為100μg/mL的同位素內(nèi)標溶液，以及濃度為1.0 mg/mL的標準儲備溶液待用，4℃條件下保存期為180天。難溶的物質(zhì)可通過超聲幫助溶解。將同位素內(nèi)標溶液和標準儲備液分別用純水逐級稀釋成濃度為10 ng/mL和100 ng/mL的工作溶液。稀釋時徐將儲備液放置至室溫，觀察是否有晶體析出，如果有晶體析出需要重新?lián)u勻至溶解后再進行稀釋。

1.5 所需藥品及配制

鹽酸溶液：0.2 mol/L；

二硝基苯甲醛（2-NBA衍生化試劑）：0.05 mol/L；

乙酸銨溶液：0.002 mol/L；

二甲基亞砜（國產(chǎn)）、磷酸氫二鉀（國產(chǎn)）、甲酸、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）等。

1.6 儀器條件優(yōu)化

儀器設(shè)備的準確性是影響實驗結(jié)果的關(guān)鍵性因素之一，對實驗中所需的儀器設(shè)備進行核查，確認儀器檢定校準是否在有效期內(nèi)，是否能夠滿足實驗要求，可通過新配置的標準溶液進行驗證，確保準確無誤。若新配置的標準溶液靈敏度不夠高，需要優(yōu)化儀器和檢測條件，可更換色譜柱、清洗離子源等，且控制液質(zhì)室溫度為22-25℃?？商崆皩x器優(yōu)化到最佳狀態(tài)待用。

1.7 質(zhì)控樣品制備與練習

按照檢測方法提前準備質(zhì)控樣品，將陰性控制樣品（空白樣品）中加入已知濃度的標準物質(zhì)冷凍過夜，可作為回收率試驗、平行試驗練習樣品。按照作業(yè)指導書要求將質(zhì)控樣品作為待測樣品進行前處理練習，并上機檢測，進一步熟練檢測步驟。

2 樣品處理

2.1 核驗樣品

檢查樣品編號是否正確，確認樣品是否有效，如考核樣品呈完全解凍狀態(tài)或者運輸時間超過72 h則為無效樣品，需安排重新領(lǐng)取樣品。有效樣品需要立即開展實驗，不可放置過夜。樣品操作過程中盡量避光。

2.2 標準曲線的建立

本實驗選擇六個濃度點，分別為0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL，由于硝基呋喃類代謝物的標準曲線需要進行衍生化處理，因此標注曲線與待測樣品同時進行前處理。

2.3 樣品衍生化

待樣品自然解凍后，按照能力驗證文件要求，稱取3個平行待測樣品和空白樣品，檢測過程試劑空白和樣品空白需同步進行。質(zhì)控樣品可選擇空白樣品加標，添加濃度一般為2-5倍定量限，也可選擇購買已知濃度的質(zhì)控樣品，同時確保質(zhì)控樣品和待測樣品在相同條件下進行前處理，保證操作步驟的一致性，將誤差降到最低。分別稱取2.00 g空白樣品于50 mL離心管中備用。首先加入50 μL同位素混合內(nèi)標工作液，渦旋混合器混合50 s，再加入5 mL鹽酸溶液，300 μL二硝基苯甲醛溶液，渦旋混合器混合50 s，然后置于超聲清洗儀中超聲2 h，水溫控制在35℃左右，以上操作過程盡量避光操作。超聲結(jié)束后將樣品置于搖床中，溫度設(shè)置為37℃，恒溫震蕩17h。

2.4 樣品前處理

取出樣品，冷卻至室溫，首先加入磷酸氫二鉀溶液調(diào)pH值到7.4（±0.2），再加入4 mL乙酸乙酯，渦旋混勻60 s，4 000 r/min離心5 min，重復提取一次，合并上清液直接過Prime HLB固相萃取小柱，收集濾液至10 mL離心管中，38℃水浴氮氣吹干。準確加入1 mL甲醇（20%）-水溶液，渦旋混勻60 s，如果樣品油脂過多，可用低溫高速離心機13 000 r/min離心10 min，取下層溶液過0.22 μm濾膜，準備上機檢測。

2.5 上機檢測

本方法采用ACQUITY UPLC?BEH C 18柱；柱溫：35℃；流動相：A為2 mol/L乙酸銨水溶液，B為甲醇溶液；流速為0.3 mL/min；進樣量為10 μL。

ESI正離子化模式；儀器型號：Waters Xevo TQS；離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應檢測（MRM）；錐孔電壓：40 V；毛細管電壓：0.9 kV；脫溶劑氣溫度：50℃。

3 結(jié)果分析

首先檢查譜圖，看是否有積分不準確的情況，在積分準確的情況下通過對質(zhì)控樣品回收率的分析，判斷此次實驗的質(zhì)量控制情況，通過對質(zhì)控樣品的分析，判斷此次能力驗證的結(jié)果偏高還是偏低。其次比較試劑空白和樣品空白譜圖，判斷是否在操作過程中有雜質(zhì)引入以及基質(zhì)干擾。最后仔細分析待測樣品的數(shù)據(jù)以及譜圖，判斷三個平行樣品之間重復性是否良好，計算質(zhì)控RSD以及品行待測樣品RSD并上報結(jié)果。根據(jù)能力驗證文件要求及時在網(wǎng)站上報數(shù)據(jù)，并郵寄原始記錄等，原始記錄要求手寫并簽字。檢測結(jié)果見下表。

2020年水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物能力驗證情況(ND表示未檢出)

4 能力驗證體會

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖面積的擴大，水產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題日益凸顯，食品安全問題成為老百姓越來越關(guān)注的問題。作為檢測機構(gòu)，提高檢測能力、熟練掌握檢測方法、保證檢測質(zhì)量是關(guān)鍵。只有提高檢測機構(gòu)的檢測能力，才能更有效的保障水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。而能力驗證結(jié)果是實驗室管理水平和檢測人員檢驗能力的綜合體現(xiàn)，積極參加能力驗證對實驗室技術(shù)水平、檢驗人員的操作水平都有一定程度的提高。通過對能力驗證結(jié)果的分析，可發(fā)現(xiàn)自身與其他實驗室之間的差距與不足，以及實驗室在技術(shù)管理上的缺陷，從而保證實驗室與其他檢測結(jié)構(gòu)檢測能力持平。能力驗證結(jié)果為滿意，在一定程度上增強了檢測人員的信心，進一步提高了本實驗室出具數(shù)據(jù)的可信度。對于水產(chǎn)品硝基呋喃類代謝物能力驗證掌握前處理方法和上機操作是關(guān)鍵，要加強檢測人員的技術(shù)水平，從實驗前期開始準備，把能力驗證作為實驗室的基本要求，只有檢測水平提高了，監(jiān)管水平才會提高，水產(chǎn)品的質(zhì)量安全才會得到保障，我們的檢測才是有意義的。

（通聯(lián)：130033，吉林省長春市水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心）