分子標(biāo)記物在禽類糞便污染溯源中的研究及應(yīng)用進(jìn)展

梁紅霞,余志晟,*,劉如銦,張洪勛,吳 鋼

1 中國科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 北京 100049 2 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心, 北京 100085

近年來,家禽的出欄量和存欄量在我國所有畜禽中排第一位[1],這導(dǎo)致了大量禽類糞便的產(chǎn)生。大量的禽類糞便排入環(huán)境水體中,造成水質(zhì)的不斷惡化[2- 4]。將家禽糞便作為肥料用于土地中的事件也屢有報(bào)道,這也會(huì)增加土壤污染的風(fēng)險(xiǎn)[5]。而且,禽類糞便中攜帶的各種細(xì)菌和病毒也會(huì)威脅人類的身體健康[6-7]。禽類糞便可能會(huì)對(duì)水體和土壤環(huán)境以及人類健康造成的不利影響,因此快速準(zhǔn)確的識(shí)別糞便污染并及時(shí)控制污染源對(duì)于環(huán)境保護(hù)和人類健康至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的糞便污染指示菌,如大腸桿菌、腸球菌等在人和溫血?jiǎng)游锬c道微生物群落中為優(yōu)勢(shì)菌,因此常用于指示水質(zhì)狀況[8]。但是,它們?cè)谒w污染溯源檢測(cè)方面存在一定的局限性[9]。比如,對(duì)宿主特異性低導(dǎo)致不能準(zhǔn)確指示污染來源[10-11],可以在體外繁殖而無法反映水體近期的污染情況等[12-13]。為了準(zhǔn)確判斷糞便污染物的來源,研究人員利用人和動(dòng)物胃腸道中的微生物設(shè)計(jì)出具有特異性的標(biāo)記物以檢測(cè)糞便污染的來源,并稱之為微生物溯源技術(shù)(Microbial source tracking, MST)[14-15]。微生物溯源標(biāo)記物開發(fā)的基本前提為,(1)糞便源指示微生物在特定的宿主腸道內(nèi)為優(yōu)勢(shì)菌且與宿主密切相關(guān)；(2)這些微生物存在宿主特異性序列且該序列可以設(shè)計(jì)為宿主糞便污染的標(biāo)記物[16]。另外,指示標(biāo)記物在排放環(huán)境中的賦存周期、行為也是需要考慮的因素[17]。

為了快速準(zhǔn)確地檢測(cè)來自禽類糞便的污染以減少其對(duì)環(huán)境和人類健康的影響,針對(duì)不同禽類的糞便污染標(biāo)記物已經(jīng)被開發(fā),包括家禽(如雞(Gallusgallus)[18]、鴨(Aixsponsa)[5]和鴿子(Columbalivia)[19])和野鳥(如加拿大雁(Brantacanadensis)[20]、海鷗(Laruscanus)[3]和沙丘鶴(Gruscanadensis)[21]等)。但是,隨著禽類標(biāo)記物種類和數(shù)目的增加,研究人員難以快速準(zhǔn)確地選擇出指示效果最好的禽類標(biāo)記物用于糞便污染的檢測(cè)。本文在前人研究基礎(chǔ)上,對(duì)禽類微生物溯源標(biāo)記物的開發(fā)和研究進(jìn)展進(jìn)行歸納和總結(jié),為禽類標(biāo)記物的快速選擇提供一定的理論支持,為禽類微生物溯源技術(shù)在我國的發(fā)展和應(yīng)用提供參考。

1 禽類微生物溯源標(biāo)記物的性能評(píng)價(jià)

目前,多種禽類標(biāo)記物已經(jīng)被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)來自家禽(如雞、鴨和鴿子等)和野鳥(如海鷗、加拿大雁和沙丘鶴等)的糞便污染(表1)。禽類標(biāo)記物可分為通用標(biāo)記物和特異性標(biāo)記物,通用標(biāo)記物用于檢測(cè)所有禽類的糞便污染,而特異性標(biāo)記物用于特定禽類的檢測(cè)。一般地,可使用敏感性(Sensitivity)和特異性(Specificity)來衡量標(biāo)記物的指示效果[14]。敏感性指標(biāo)記物在目標(biāo)宿主糞便樣品中的陽性率；特異性指標(biāo)記物在非目標(biāo)宿主糞便樣品中的陰性率。敏感性和特異性的數(shù)值越大,表明該標(biāo)記物的指示效果越可信。敏感性和特異性的計(jì)算公式如下：

(1)

(2)

式中,TP(True positive)指標(biāo)記物顯示陽性的目標(biāo)宿主糞便樣品的數(shù)量；FN(False negative)指標(biāo)記物顯示陰性的目標(biāo)宿主糞便樣品的數(shù)量；TN(True negative)指標(biāo)記物顯示陰性的非目標(biāo)宿主糞便樣品的數(shù)量；FP(False positive)指標(biāo)記物顯示陽性的非目標(biāo)宿主糞便樣品的數(shù)量。

表1 家禽和野鳥的微生物溯源標(biāo)記物

2 禽類微生物溯源標(biāo)記物的發(fā)展

禽類微生物溯源標(biāo)記物的設(shè)計(jì)來源主要為細(xì)菌16S rRNA基因、線粒體DNA和功能基因等(圖1)。以細(xì)菌16S rRNA基因?yàn)樵O(shè)計(jì)來源的分子標(biāo)記物具有廣泛的應(yīng)用,但有些禽類特別是野鳥會(huì)隨季節(jié)的變化發(fā)生遷徙,其腸道微生物組成隨宿主地理位置的變化而變化,使得設(shè)計(jì)出的標(biāo)記物在不同區(qū)域的指示效果存在差別；線粒體DNA設(shè)計(jì)的禽類標(biāo)記物多表現(xiàn)出高敏感性和高特異性的特征,且受宿主所在地理區(qū)域的影響較小,可廣泛用于禽類的微生物溯源研究；盡管目前基于功能基因設(shè)計(jì)出的禽類標(biāo)記物指示效果較差,但是使用功能基因設(shè)計(jì)禽類標(biāo)記物的思路值得參考和借鑒。

2.1 細(xì)菌16S rRNA基因

在禽類微生物溯源研究中,最常使用的細(xì)菌是厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌目(Bacteroidales)及其家族成員,其次是放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)及其家族成員。此外,也有一些種屬信息尚未確定的源指示菌的16S rRNA基因用于禽類分子標(biāo)記物的開發(fā),如E2[33]和AV216[23]等。

2.1.1厚壁菌門及其家族成員

厚壁菌門及其家族成員在禽類的糞便樣品中具有較高的相對(duì)豐度[23, 36]。Ohad等[23]基于家禽和水鳥糞便樣品的16S rRNA基因高通量測(cè)序數(shù)據(jù),針對(duì)在門水平上相對(duì)豐度為94%的厚壁菌設(shè)計(jì)出高特異性(99%)的禽類通用標(biāo)記物AV43；針對(duì)在科水平上相對(duì)豐度為90%的乳酸桿菌(Lactobacillus)設(shè)計(jì)出敏感性和特異性分別為93%和97%的禽類通用標(biāo)記物AV4143。

Catellicoccusmarimammalium屬于腸球菌科(Enterococcaceae)。有研究表明C.marimammalium為海鷗糞便微生物群落中的優(yōu)勢(shì)菌,且在海鷗糞便中存在特異性序列[3]。研究人員基于C.marimammalium16S rRNA基因開發(fā)出的海鷗標(biāo)記物Gull2[3]、Gull4[34]和Sketa[2],其敏感性和特異性均分別在71%和91%以上。但是,利用同屬于厚壁菌門的鏈球菌(Streptococcusspp.)16S rRNA基因設(shè)計(jì)出的海鷗標(biāo)記物Gull3,其敏感性僅為28%[34]。Green等[22]根據(jù)C.marimammalium16S rRNA基因開發(fā)的禽類通用標(biāo)記物GFC,在64%的海鷗糞便樣品中檢出,但在其他禽類樣品中的陽性率均不足5%。因此,C.marimammalium16S rRNA基因設(shè)計(jì)的標(biāo)記物對(duì)海鷗表現(xiàn)出較高的宿主特異性,能夠用于海鷗的微生物溯源研究中。

柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)屬于瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)。因其嚴(yán)格厭氧,在體外不能繁殖且存活周期短的特點(diǎn)逐漸用于糞便污染研究中[37]。Shen等[30]通過比較不同動(dòng)物糞便中的柔嫩梭菌屬16S rRNA基因,在雞糞便中發(fā)現(xiàn)一段特異性序列,并據(jù)此設(shè)計(jì)出敏感性和特異性分別為76%和100%的雞糞源標(biāo)記物IVS-p。另外,柔嫩梭菌屬通用標(biāo)記物和特異性標(biāo)記物對(duì)雞糞便污染的檢測(cè)在我國珠江三角洲地區(qū)都得到了很好的驗(yàn)證[37-38]。目前,美國政府機(jī)構(gòu)已經(jīng)把Faecalibateriu檢測(cè)方法納入飲用水的輔助檢測(cè)項(xiàng)目之中[39],說明柔嫩梭菌屬在水質(zhì)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用正逐漸受到重視。

圖1 禽類微生物溯源標(biāo)記物的分類Fig.1 Classification of avian markers for microbial source tracking

2.1.2擬桿菌目及其家族成員

擬桿菌(Bacteroides)是人和溫血?jiǎng)游锛S便微生物中的優(yōu)勢(shì)菌,其16S rRNA基因經(jīng)常被用于設(shè)計(jì)人、哺乳動(dòng)物和反芻動(dòng)物的微生物溯源分子標(biāo)記物[14],也有研究者將擬桿菌用于雞[18]、鴨[18]和加拿大雁[20]等禽類微生物溯源研究中。但是,擬桿菌標(biāo)記物在禽類微生物溯源研究中的指示效果一般,如在加拿大雁糞便樣品中的敏感性低于60%[20],在雞糞便中的檢出率也低于75%[18, 25]。

擬桿菌在禽類糞便污染研究中指示效果差的原因可能如下, (1)擬桿菌在不同種類禽類的糞便微生物相對(duì)豐度差異較大,使得擬桿菌禽類通用標(biāo)記物的設(shè)計(jì)很困難。Ohad等[23]發(fā)現(xiàn)擬桿菌在母雞糞便細(xì)菌群落中的相對(duì)豐度為9.56%,但在水鳥中僅為0.1%；(2)擬桿菌在有些禽類腸道微生物群落并不是優(yōu)勢(shì)菌。有研究表明擬桿菌在部分禽類腸道和排泄物樣品中幾乎不存在,如水鳥[23]和海鷗[3]等。 Nshimyimana等[40]在新加坡的研究發(fā)現(xiàn),通用擬桿菌標(biāo)記物BacUni在人和哺乳動(dòng)物糞便樣品均有檢出,但在鳥類糞便中均表現(xiàn)為陰性?？傊?擬桿菌并不能準(zhǔn)確地指示來自禽類的糞便污染。

2.1.3放線菌門、變形菌門和梭桿菌門及其家族成員

短桿菌(Brevibacterium)屬于放線菌門,短桿菌科(Brevibacteriaceae)。Lu等[41]發(fā)現(xiàn)短桿菌在雞墊料中為優(yōu)勢(shì)菌,且該菌暫未在其他禽類,如海鷗[41]、雪雁[21]和沙丘鶴[21]等糞便樣品中發(fā)現(xiàn)。研究者利用短桿菌在雞糞便中的16S rRNA特異性基因開發(fā)出雞糞源標(biāo)記物CL-TaqMan[28]和LA35[29]。Ryu等[28]使用雞墊料和糞便樣品對(duì)這兩種標(biāo)記物的指示效果進(jìn)行測(cè)試,發(fā)現(xiàn)LA35和CL-TaqMan的敏感性在雞糞便樣品中均≤23%,但在雞墊料樣品中均≥98%。有研究報(bào)道雞糞便和墊料樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異[41-42],短桿菌屬在雞墊料樣品是相對(duì)豐度最高的菌屬之一[43],但在雞的糞便和腸道樣品中不存在或者少量存在[44-45],這可能解釋了LA35和CL-TaqMan 在雞墊料和糞便樣品中的檢出差異?？傊?利用短桿菌屬16S rRNA基因開發(fā)出的這兩種標(biāo)記物能夠很好地指示雞墊料的污染。

禽類通用標(biāo)記物AV163[23]和GFD[22]分別由變形菌門分類下的卡氏桿菌屬(Gallibacterium)和幽門螺旋桿菌屬(Helicobacter)16S rRNA基因設(shè)計(jì)而來。其中,標(biāo)記物GFD在中國、美國、新西蘭和澳大利亞等多個(gè)國家進(jìn)行過溯源研究[22, 46-47],但該標(biāo)記物在不同國家的指示效果有所不同。比如,在美國的糞便樣品中顯示30%的敏感性[47],而在中國顯示70%的敏感性[46]。對(duì)于在不同區(qū)域敏感性表現(xiàn)不同的標(biāo)記物,使用前應(yīng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以判斷其在本地的適用性。

圖2 線粒體DNA的基本分子結(jié)構(gòu)[48]Fig.2 The basic molecular structure of mitochondrial DNA[48]

禽類通用標(biāo)記物GFB[22]、AV13[23]和AV24[23]均來自梭桿菌科(Fusobacteriaceae)16S rRNA基因。在引物設(shè)計(jì)者的研究中[22-23],這3個(gè)標(biāo)記物的特異性均為100%,但是它們的敏感性均低于10%,或許其所對(duì)應(yīng)的基因序列在禽類糞便微生物中相對(duì)豐度較低?？傊?這些標(biāo)記物不適用于禽類的微生物溯源研究中。

2.2 線粒體DNA

人類和動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞在腸道內(nèi)脫落的過程中,腸道上皮細(xì)胞中的線粒體DNA會(huì)隨腸道內(nèi)容物以糞便的形式排出體外,所以人和動(dòng)物糞便中均含有大量的線粒體DNA[48-49]。另外,線粒體DNA對(duì)宿主具有高度特異性[50-51],因此其逐漸運(yùn)用于糞便污染溯源研究中[52- 54]。2005年,Martellini等[55]將線粒體DNA首次用于糞便污染微生物溯源中,實(shí)現(xiàn)了流域污染源的快速判斷。

在禽類微生物溯源研究中,線粒體DNA的cytb基因常用于設(shè)計(jì)禽類標(biāo)記物,其次是ND5基因、16S rRNA基因和ND2基因(圖2)。Zhuang等[24]分別利用線粒體ND5和cytb基因開發(fā)出雞和鴨糞便污染標(biāo)記物,且設(shè)計(jì)出的標(biāo)記物敏感性和特異性分別達(dá)到100%和≥85%,表現(xiàn)出良好的指示效果。Kortbaoui等[27]使用巢式PCR技術(shù)對(duì)線粒體16S rRNA基因設(shè)計(jì)的雞糞源標(biāo)記物進(jìn)行指示效果評(píng)估,結(jié)果表明該標(biāo)記物的特異性和敏感性均達(dá)到100%。

禽類特別是野鳥因季節(jié)性遷徙或覓食等因素,不會(huì)在同一區(qū)域長(zhǎng)期停留。有研究表明飲食的改變和地理區(qū)域的差異會(huì)顯著影響動(dòng)物的腸道微生物群落組成[56-57],禽類所處的高度多樣性的環(huán)境可能會(huì)影響其腸道微生物組成,使得禽類微生物溯源標(biāo)記物的發(fā)展存在一定困難。但是,許多研究表明線粒體DNA不易受宿主的飲食狀況和所在地理區(qū)域的影響[35, 50]。Liang等[58]使用中國5個(gè)不同區(qū)域的糞便樣品對(duì)已有雞源標(biāo)記物進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估后發(fā)現(xiàn),以線粒體DNA為設(shè)計(jì)來源的雞源標(biāo)記物表現(xiàn)出最好的指示效果。本文歸納總結(jié)的標(biāo)記物中(表1),利用線粒體DNA開發(fā)出的禽類標(biāo)記物大多表現(xiàn)出高敏感性和特異性,所以線粒體DNA比細(xì)菌16S rRNA基因更適用于禽類微生物溯源標(biāo)記物的開發(fā)。

2.3 功能基因

有研究表明與細(xì)胞有關(guān)的功能基因是宿主特異性實(shí)驗(yàn)的良好標(biāo)記物[59],所以功能基因也能應(yīng)用到糞便微生物溯源研究中。樊麗華等[60]發(fā)現(xiàn)能夠編碼某些細(xì)菌表面蛋白、膜分泌蛋白及碳水化合物代謝蛋白的相關(guān)基因可作為豬特異性分子標(biāo)記物設(shè)計(jì)的目標(biāo)序列。

在禽類微生物溯源中,也有將功能基因作為特異性標(biāo)記物的相關(guān)研究。Lu等[32]利用與細(xì)胞新陳代謝,細(xì)胞進(jìn)程和信息的儲(chǔ)存與處理等有關(guān)的基因設(shè)計(jì)禽類特異性標(biāo)記物。比如,部分標(biāo)記物對(duì)應(yīng)的基因與新陳代謝有關(guān),這些基因負(fù)責(zé)編碼的細(xì)胞膜功能蛋白參與運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì),包括碳水化合物(CP1- 26)、無機(jī)離子(CP1- 24 和 CP2- 9)和氨基酸(CP1- 55和CP3- 49)等。Hamilton等[61]基于宏基因組數(shù)據(jù)開發(fā)出加拿大雁特異性標(biāo)記物GB2和GE11,這些標(biāo)記物對(duì)應(yīng)的基因負(fù)責(zé)編碼粘附素細(xì)菌表面蛋白,該蛋白能夠介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)上皮細(xì)胞粘附、侵襲、細(xì)菌的自動(dòng)聚集和生物膜的形成[62],為細(xì)菌在宿主腸道內(nèi)的定殖起關(guān)鍵作用。

已開發(fā)的功能基因標(biāo)記物對(duì)宿主的敏感性普遍較低。Lu等[32]利用21種動(dòng)物的糞便樣品對(duì)功能基因標(biāo)記物的性能進(jìn)行測(cè)試。在測(cè)試的雞糞源標(biāo)記物中,效果最好的標(biāo)記物為CP2- 9,其敏感性僅為40%。Hamilton等[61]使用135份加拿大雁樣品對(duì)標(biāo)記物的敏感性測(cè)試,結(jié)果表明其敏感性均在20.7%到48.1%之間。雖然這些禽類功能基因標(biāo)記物的敏感性較低,但是將功能基因設(shè)計(jì)為禽類標(biāo)記物的研究思路具有很大的參考價(jià)值。

3 總結(jié)與展望

近年來,禽類微生物溯源的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展,針對(duì)家禽(如雞、鴨和鴿子)和野鳥(如海鷗、加拿大雁和沙丘鶴)均設(shè)計(jì)出了相應(yīng)的標(biāo)記物。部分細(xì)菌16S rRNA基因標(biāo)記物表現(xiàn)良好,如禽類標(biāo)記物AV4143[23]和海鷗標(biāo)記物Sketa[2]等；線粒體DNA不受宿主飲食和地理環(huán)境的影響,其對(duì)應(yīng)的標(biāo)記物大都表現(xiàn)出較高的敏感性和特異性,可重點(diǎn)用于禽類標(biāo)記物的開發(fā)；利用功能基因進(jìn)行標(biāo)記物的設(shè)計(jì)也為禽類微生物溯源研究提供了新思路。

但是,禽類微生物溯源仍然面臨較大的挑戰(zhàn)。(1)許多禽類標(biāo)記物并不是在我國發(fā)展而來,這些標(biāo)記物在我國的指示效果并不可知,因此需要將現(xiàn)有禽類標(biāo)記物在我國進(jìn)行系統(tǒng)的比較以選擇指示效果較好的標(biāo)記物。(2)現(xiàn)有禽類標(biāo)記物多表現(xiàn)為敏感性較低,所以應(yīng)設(shè)計(jì)更多禽類標(biāo)記物以準(zhǔn)確檢測(cè)禽類糞便污染。(3)現(xiàn)有溯源技術(shù)手段多表現(xiàn)為低通量,可將高通量數(shù)據(jù)溯源分析平臺(tái)(如SourceTracker[63]和FEAST[64]等)應(yīng)用到禽類糞便污染檢測(cè)中。

致謝：中國科學(xué)院大學(xué)王波波博士幫助寫作,特此致謝。