‘酒紅’礬根離體快繁技術(shù)研究

張新玉，許 栩

（北京安海之弋園林古建工程有限公司，北京 102607）

礬根為多年生草本花卉，是虎耳草科礬根屬植物的通稱。礬根品種眾多，一些品種對土壤的重金屬有較強(qiáng)的吸收，在生態(tài)修復(fù)和環(huán)境保護(hù)方面具有一定作用。礬根因其多變的葉形及葉色，被稱為“花園調(diào)色板”，在美國園林景觀中應(yīng)用較廣泛。近幾年來，才開始將礬根引進(jìn)國內(nèi)。礬根耐寒喜蔭，在園林造景中可以作為林下陰生彩葉植物使用，或者用作室內(nèi)高端盆景，其開發(fā)利用前景廣闊，特別是北京百萬畝大造林后，隨著林木蔥郁，林下土壤裸露成為需要解決的課題，而具有推廣應(yīng)用潛力的林下地被植物礬根受到重視。

礬根分株繁殖成活率較低，且繁殖速度較慢；部分品種可以播種繁殖，但種子發(fā)芽慢且不整齊。植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)礬根的快速大量繁殖。本研究從我們近年來引種的品種中，篩選出能夠在北京地區(qū)露地越冬、正常生長的品種‘酒紅’礬根，研究建立完整的離體組培快繁技術(shù)體系，可引用于‘酒紅’礬根種苗規(guī)?；a(chǎn)，并為其他礬根的組培研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為北京安海之弋園林古建工程有限公司引種的‘酒紅’礬根。

1.2 外植體制備及消毒

4 月于溫室內(nèi)取材，選擇生長旺盛、無明顯病蟲害、大小在3cm×3cm 左右的幼葉作為外植體。

用毛筆蘸取洗潔精溶液，洗刷葉片表面灰塵，再用自來水沖洗30min。將葉片轉(zhuǎn)移至帶蓋無菌瓶中，在超凈臺(tái)內(nèi)，先用75%乙醇浸泡外植體30s，期間輕輕搖晃；然后再用2%次氯酸鈉溶液浸泡2min，期間輕輕搖晃；最后用無菌水清洗4 次。在無菌紙板上，用無菌剪刀在葉片主葉脈處剪成約1cm×1cm 的葉片圖1（A）所示，貼在誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面，葉背面朝上。

圖1 礬根‘酒紅’的組培擴(kuò)繁體系

表1 不同激素濃度對礬根‘酒紅’愈傷組織誘導(dǎo)的影響

1.3 培養(yǎng)基

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基均以MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基中的激素（6-BA，NAA）設(shè)置相同，濃 度 分 別 為（0.5mg/L，0.05mg/L）、（1.0mg/L，0.05mg/L）、（1.5mg/L，0.3mg/L），糖含量為3%。增殖培養(yǎng)基中的激素（6-BA，NAA）濃度設(shè)置分別為（0.1mg/L，0.01mg/L）、（0.3mg/L，0.03mg/L）、（0.5mg/L，0.05mg/L）、（0.6mg/L，0.02mg/L），糖含量為3%。生根培養(yǎng)以1/2MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的NAA 或IBA，NAA 濃度設(shè)置為0.1mg/L 和0.2mg/L，IBA 濃度設(shè)置為0.1mg/L，同時(shí)設(shè)置添加活性炭（0.5g/L）和不添加活性炭的對比，觀察活性炭對生根的影響。以上所有培養(yǎng)基，均添加4g/L 的瓊脂粉，糖含量均為2%，pH 均調(diào)至5.9～6.0，121℃滅菌17min。

1.4 培養(yǎng)條件與方法

1.4.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

將消毒后的葉子，圖1（A）所示，在接近葉柄處的主葉脈處剪切成1cm×1cm 大小的葉片，接種至不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基接種2 個(gè)外植體，每個(gè)處理接種20 瓶。培養(yǎng)條件為：室溫24±2℃下，先暗培養(yǎng)7d，后轉(zhuǎn)入LED 白光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000lux，光照周期為10h/d，一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.4.2 繼代培養(yǎng)與不定芽分化

誘導(dǎo)培養(yǎng)40d 左右，外植體產(chǎn)生大量愈傷組織。將愈傷組織切割成1cm×1cm 左右的組織塊，再轉(zhuǎn)入與誘導(dǎo)培養(yǎng)基一致的繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每瓶培養(yǎng)基接種2 個(gè)愈傷組織塊，每個(gè)處理接種10 瓶。培養(yǎng)條件為：室溫24±2℃，光照強(qiáng)度為2000lux，光周期為10h/d。繼代培養(yǎng)1 個(gè)月后，各培養(yǎng)基中的愈傷組織均分化出不定芽，觀察不定芽的生長情況。

糖尿病患者由于代謝紊亂，其陰道內(nèi)糖原水平明顯提高,不僅導(dǎo)致陰道環(huán)境的變化，也會(huì)給陰道清潔度帶來很大影響，直接誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[4]。上述變化也增加了老年糖尿病合并陰道炎患者的治療難度。

1.4.3 增殖培養(yǎng)

以繼代培養(yǎng)基中生長正常的不定芽為材料，切除不定芽基部的愈傷組織，以單株形式轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基。每瓶培養(yǎng)基接種10株，每個(gè)處理接種10 瓶。培養(yǎng)條件為：室溫24±2℃，光照強(qiáng)度為2000lux，光周期為10h/d，50d 后觀察苗長勢及增殖情況。

1.4.4 生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)基中的小苗轉(zhuǎn)入含有不同激素及濃度的生根培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基接種10 株小苗，每個(gè)處理接種10 瓶，15d 后統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基的生根狀況。

1.4.5 煉苗移栽

當(dāng)不定根長約1cm 時(shí)，將瓶苗放在溫室內(nèi)煉苗7d。前4 天不打開瓶塞，光照強(qiáng)度保持在3000～6000lux 之間，溫度保持在20～27℃之間；第5 天、第6 天不打開瓶塞，光照強(qiáng)度保持在6000～10000lux 之間，溫度保持在20～27℃之間；第7 天將瓶塞打開一半，光照強(qiáng)度保持在6000～10000lux 之間，溫度保持在20～27℃之間。第8 天取出瓶苗，用水清洗掉根部粘連的培養(yǎng)基，栽入草炭土:蛭石:珍珠巖=2:2:1 的混合基質(zhì)中。移栽后的礬根苗，前10 天需要保持環(huán)境較高的空氣濕度（90%以上），光照強(qiáng)度控制在6000lux 以下，溫度保持在20～27℃之間，10d 后慢慢減少濕度和增加光照強(qiáng)度，15d 后進(jìn)入正常管理。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

增殖率（%）=單瓶苗總數(shù)/單瓶接種苗數(shù)×100

生根率（%）=生根苗總數(shù)/接種苗總數(shù)×100

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

表1 中列出了不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基下愈傷組織的誘導(dǎo)情況。在誘導(dǎo)初期，三種培養(yǎng)基的愈傷組織均為綠色，水澤化，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，愈傷組織變得疏松，顏色有綠色、乳白色及淡紅色如圖1（B）所示。根據(jù)表1，可以看出，在培養(yǎng)基里添加1.5mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA 時(shí)可快速誘導(dǎo)愈傷組織的形成，愈傷組織生長較好。

2.2 愈傷組織的繼代培養(yǎng)

將愈傷組織轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的新培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1 個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)在添加了1.5mg/L 6-BA 與0.3mg/L NAA 的培養(yǎng)基中，可快速誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生出大量不定芽，且生長健壯，僅發(fā)現(xiàn)個(gè)別芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。表2 中列出繼代培養(yǎng)基中不同的激素濃度對礬根繼代培養(yǎng)及不定芽分化的影響。

表2 不同激素濃度對礬根‘酒紅’愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

2.3 增殖培養(yǎng)基的篩選

將單芽轉(zhuǎn)入含有不同激素濃度的增殖培養(yǎng)基中一個(gè)月后，觀察發(fā)現(xiàn)6-BA 濃度過高易導(dǎo)致玻璃化，濃度過低，增殖效果不好。當(dāng)6-BA 的濃度為0.3mg/L，NAA 的濃度為0.03mg/L 時(shí)，可明顯觀察到增殖現(xiàn)象，一個(gè)月后增殖系數(shù)為4，當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)50d 后，增殖系數(shù)可達(dá)到7，如圖1（C）、表3 所示。

表3 不同激素濃度對礬根‘酒紅’增殖培養(yǎng)的影響

2.4 生根培養(yǎng)基的篩選

將單芽轉(zhuǎn)入含有不同激素濃度的生根培養(yǎng)基中，觀察各培養(yǎng)基中生根速度及生根狀況。表4 列出不同生根培養(yǎng)基處理下，礬根的生根狀況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：①當(dāng)生根培養(yǎng)基中的NAA 的濃度為0.2mg/L 時(shí)，加入活性炭會(huì)延緩生根時(shí)間，這可能是因?yàn)榛钚蕴繒?huì)吸附培養(yǎng)基中的NAA，有效NAA 濃度減少導(dǎo)致生根時(shí)間稍微長一些；②生根培養(yǎng)基用的1/2MS 指僅大量元素濃度為MS 的一半，而鐵鹽、微量元素、有機(jī)元素的濃度不變。如果將MS 培養(yǎng)基中的所有元素都減半，礬根生根速度明顯很慢；③對于礬根‘酒紅’，NAA 的生根效果要優(yōu)于IBA。從節(jié)約生根時(shí)間考慮，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2mg/L NAA，生根率可達(dá)100%，如圖1（D）所示。其次生根培養(yǎng)基可選擇1/2MS+0.1mg/L NAA，生根率也可達(dá)100%。

表4 不同激素濃度及培養(yǎng)基處理對礬根‘酒紅’生根的影響

2.5 煉苗移栽

將根長約1cm 長的礬根組培苗，進(jìn)行煉苗處理，如圖1（E）所示，煉苗7d 后移栽至預(yù)先澆透水的草炭土:蛭石:珍珠巖=2:2:1 的混合基質(zhì)中。最終移栽成活率可達(dá)95%，如圖1（F）所示。

3 討論

陳錦等[3]在對美洲礬根‘紫色宮殿’的組織培養(yǎng)及快速繁殖的研究中，分別以礬根的幼芽、葉柄和葉片為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果表明以幼芽為外植體時(shí)繁殖率最高，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，生根培養(yǎng)基為4/5MS+0.2mg/L NAA+0.2g/L AC。陳宏等[2]以礬根的帶莖尖幼嫩莖段為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，最佳誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA，生根培養(yǎng)基為4/5MS+0.2mg/L NAA+1.0g/L AC。以上兩者研究均建立完整的快繁體系，但是外植體不易消毒，且以莖段為外植體，會(huì)損害植株。本研究以葉子為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)效果可能不是最佳，但是取材不損害原植株，且消毒比較容易，2%的次氯酸鈉消毒2min 中即可達(dá)到消毒效果，后期利用少量分化出來的芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，在短時(shí)間內(nèi)也可實(shí)現(xiàn)快速繁殖。