雙孢蘑菇濕泡病抗病性鑒定方法研究*

張春蘭，孫 燦，金正文，曾云霞，徐瑋琦，周 晨，李 玉

（1.長春大學(xué)園林學(xué)院，吉林長春130000；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林長春130118）

雙孢蘑菇濕泡病（wet bubble disease of Agaricus bisporus） 是由有害疣孢霉（Hypomyces perniciosus Magnus Delacr）的病原真菌引起的。有害疣孢霉可產(chǎn)生分生孢子和厚垣孢子[1]，至今未見其有性生殖階段的報(bào)道。受侵染后的雙孢蘑菇菇床中通?？捎^察到3種不同形狀的罹病子實(shí)體：一種為菌蓋、菌柄分化正常，但菌蓋表面有病斑；另一種為菌蓋較小，菌柄粗大的畸形病菇；最后一種為無菌柄、菌蓋及子實(shí)層分化的似馬勃狀菇包狀病菇。

目前關(guān)于雙孢蘑菇對(duì)濕泡病的感抗病情況的研究報(bào)道較少，截止目前其抗病評(píng)價(jià)的方法一直沿用著Flecher等[2]的方法，具體為：在常規(guī)栽培雙孢蘑菇的環(huán)境條件下，待雙孢蘑菇菌絲即將長滿覆土層而未形成原基前，向覆土層表面噴施 1×105個(gè)/mL～1×106個(gè)/mL的有害疣孢霉菌懸液，待雙孢蘑菇子實(shí)體長至采收期，以雙孢蘑菇發(fā)病率（發(fā)病子實(shí)體數(shù)/所調(diào)查的子實(shí)體總數(shù)） 作為雙孢蘑菇感抗病情況的評(píng)價(jià)依據(jù)。但此評(píng)價(jià)方法存在一些問題，首先其在接種時(shí)間選擇上，由于每個(gè)雙孢蘑菇品種間的產(chǎn)量上存在區(qū)別，產(chǎn)生原基數(shù)目不同，因此若于原基形成前的菌絲體階段接種病原菌，不能夠保證所有待評(píng)價(jià)的雙孢蘑菇品種形成子實(shí)體后其數(shù)目一致，導(dǎo)致于此生長階段接種得到品種間抗病性結(jié)果存在較大誤差。另外此方法單純的只是依賴發(fā)病率作為感抗病評(píng)價(jià)參考標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性差，結(jié)果不夠可靠。

科學(xué)的抗病評(píng)價(jià)體系應(yīng)同時(shí)包括質(zhì)量性狀及數(shù)量性狀的評(píng)價(jià)參數(shù)，研究制定科學(xué)的雙孢蘑菇濕泡病的抗病性評(píng)價(jià)的方法是進(jìn)行病原菌的致病性研究、寄主的抗病性研究等的基礎(chǔ)工作和核心技術(shù)。研究并建立一套操作簡便、鑒定結(jié)果可靠準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的抗病鑒定技術(shù)體系是決定抗病育種成敗的關(guān)鍵。

因此，應(yīng)篩選出用于雙孢蘑菇濕泡病抗病性評(píng)價(jià)的最佳接種方式、接種時(shí)間、接種量、接種后培養(yǎng)濕度以及評(píng)價(jià)時(shí)間。根據(jù)以上試驗(yàn)所得的最佳環(huán)境條件下雙孢蘑菇的發(fā)病病癥，建立科學(xué)的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算病情指數(shù)，最終建立田間雙孢蘑菇濕泡病抗病評(píng)價(jià)體系。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

為了增強(qiáng)所得的雙孢蘑菇濕泡病抗病性評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定性與可靠性，在雙孢蘑菇品種的選擇上，使用前期Fu[3]研究工作中已初步篩選出的形態(tài)差異較大且抗病性有差別的3個(gè)雙孢蘑菇品種；有害疣孢霉菌株使用本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的來自中國不同雙孢蘑菇產(chǎn)區(qū)的，形態(tài)差異較大的4株有害疣孢霉菌株。

試驗(yàn)中3個(gè)雙孢蘑菇品種分別為：1） 美國Sylvan公司的A15菌株，白色品種；2） 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的閩秀2號(hào)菌株（A40），棕色品種；3）福建省食用菌研究所的As2796菌株，奶白色品種。菌種均保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種保藏中心。供試的有害疣孢霉菌株均采用組織分離的方法，經(jīng)純培養(yǎng)后獲得純種。有害疣孢霉菌種編號(hào)為H1-12、WH1、H3-4、HN0015-8，供試的4株有害疣孢霉分別具有不同的菌落形態(tài)，其中H1-12、WH1、HN0015-8的菌種信息見參考文獻(xiàn)[4]。H3-4菌種信息見參考文獻(xiàn)[5]。不同形態(tài)有害疣孢霉的菌株信息見表1，供試的4株有害疣孢霉菌落形態(tài)見圖1。

表1 不同形態(tài)有害疣孢霉的菌株信息Tab.1 Information of four Hypomyces perniciosus isolates

圖1 4株有害疣孢霉的菌落特征Fig.1 Colony characteristic of 4 Hypomyces perniciosus isolates

1.2 PDA培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，加蒸餾水定容到1 L。

1.3 雙孢蘑菇栽培條件

雙孢蘑菇的出菇試驗(yàn)于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌菜基地進(jìn)行。雙孢蘑菇培養(yǎng)料配方及環(huán)境控制條件具體如下。

二次發(fā)酵麥草雞糞培養(yǎng)料：小麥∶石膏∶雞糞的重量比為10∶6∶0.5，含水量64%～66%。按麥粒種占1%比例播種，層播方式播種。采用筐式栽培（33 cm×20 cm×15 cm），培養(yǎng)料厚度15 cm，每筐裝料約5 kg。播種后菇房環(huán)境控制為溫度23℃～24℃，相對(duì)濕度90%～95%。待菌絲長滿培養(yǎng)料后使用草炭土進(jìn)行覆土，覆土厚約2.5 cm～3.5 cm。待菌絲長至2/3覆土層時(shí)，改變菇房環(huán)境條件，降低溫度至16.5℃～17.5℃，相對(duì)濕度87%～92%，加大通風(fēng)。

1.4 接種方式

待雙孢蘑菇子實(shí)體菌蓋直徑達(dá)到5 mm～10 mm時(shí)，采用2種不同的方法進(jìn)行接種。

1.4.1 噴霧法

規(guī)格為100 mL的手握式噴壺，用75%酒精對(duì)其消毒5 min，無菌水潤洗3次。取配制好的菌懸液裝入噴壺中，菌懸液的配置參照Flecher等[2]的方法。將長有子實(shí)體的栽培筐放入40 cm×30 cm×50 cm的箱子中，每筐噴施菌懸液的濃度為3×104個(gè)/mL，共噴20 mL，噴施時(shí)噴壺口距離覆土層的高度為10 cm。

1.4.2 滴定法

移液槍吸取配制好的菌懸液，將菌懸液滴于雙孢蘑菇菌蓋中間，每個(gè)子實(shí)體接種的菌懸液的量設(shè)置為10 μL。接種有害疣孢霉后每隔1 d觀察記錄雙孢蘑菇的發(fā)病情況，直至接種后第9天停止監(jiān)測。菇房環(huán)境條件使用常規(guī)栽培雙孢蘑菇出菇期的最適溫14℃～18℃，濕度86%～91%。

1.5 雙孢蘑菇濕泡病抗病性鑒定接種環(huán)境條件設(shè)置

1.5.1 接種時(shí)雙孢蘑菇菌蓋直徑

當(dāng)雙孢蘑菇菌蓋直徑約3 mm～8 mm、9 mm～14 mm及15 mm～20 mm時(shí)，采用1.4中得到的最佳的接種方式接種有害疣孢霉菌，每筐控制在約20個(gè)子實(shí)體；其中較大或較小的子實(shí)體于接種之前用滅菌的手術(shù)刀挖除掉，以保證所接種的各個(gè)試驗(yàn)組子實(shí)體數(shù)目及大小基本相同，每個(gè)處理3次重復(fù)。接種有害疣孢霉后每隔1 d觀察記錄雙孢蘑菇的發(fā)病情況，直至接種后第9天停止監(jiān)測。菇房環(huán)境條件使用常規(guī)栽培雙孢蘑菇出菇期的最適溫14℃～18℃，濕度86%～91%。

1.5.2 接種有害疣孢霉孢子濃度

使用無菌的醫(yī)用5 mL注射器吸取無菌水，不斷沖洗生長于PDA培養(yǎng)基中20 d的有害疣孢霉菌，每皿約用20 mL無菌水沖洗；孢子被沖洗下來后，用滅菌的10層紗布過濾，以去掉菌絲體，得到的菌懸液于血球計(jì)數(shù)板中計(jì)算孢子濃度；若孢子濃度低于試驗(yàn)要求濃度，則繼續(xù)沖洗新培養(yǎng)皿中的孢子添加于菌懸液中；若孢子濃度過高，則加入無菌水對(duì)其進(jìn)行稀釋。最終將4株供試的有害疣孢霉孢子濃度分別調(diào)節(jié)為 1×105個(gè)/mL、3×104個(gè)/mL、3×103個(gè)/mL，3個(gè)濃度梯度，每處理3次重復(fù)。采用1.4中得到的最佳的接種方式接種有害疣孢霉菌，選擇1.5.1中所得的最佳接種子實(shí)體大小階段進(jìn)行接種，接種有害疣孢霉后每隔1 d觀察記錄雙孢蘑菇的發(fā)病情況，直至接種后第9天停止監(jiān)測。菇房環(huán)境條件使用常規(guī)栽培雙孢蘑菇出菇期的最適溫14℃～18℃，濕度86%～91%。

1.5.3 接種后菇房相對(duì)濕度

采用1.4中得到的最佳的接種方式接種有害疣孢霉菌，接種時(shí)雙孢蘑菇的子實(shí)體大小選擇1.5.1中所得的最佳接種子實(shí)體大小階段及1.5.2中的最佳接種濃度進(jìn)行接種。菇房相對(duì)濕度分別控制于80%～85%、86%～91%及92%～97%的濕度范圍內(nèi)。接種后每隔1 d觀察記錄雙孢蘑菇的發(fā)病情況，直至接種后第9天停止監(jiān)測，每處理3次重復(fù)，以不接種病原菌相同菌蓋直徑的子實(shí)體為對(duì)照組。接種有害疣孢霉后每隔1 d觀察記錄雙孢蘑菇的發(fā)病情況，直至接種后第9天停止監(jiān)測。菇房環(huán)境條件使用常規(guī)栽培雙孢蘑菇出菇期的最適溫14℃～18℃。

1.5.4 接種后監(jiān)測時(shí)間

采用1.4中得到的最佳的接種方式接種有害疣孢霉菌，接種時(shí)雙孢蘑菇的子實(shí)體大小選擇1.5.1中所得的最佳接種子實(shí)體大小階段及1.5.2中的最佳接種濃度進(jìn)行接種，1.5.3中的最佳培養(yǎng)濕度進(jìn)行接種。接種有害疣孢霉后每隔1 d觀察記錄雙孢蘑菇的發(fā)病情況，直至接種后第9天停止監(jiān)測。

1.6 病情調(diào)查方法

于1.5.1～1.5.5所述情況下，接種有害疣孢霉后每隔1 d逐一記錄接種的雙孢蘑菇病情。調(diào)查記錄具體包括：子實(shí)體形態(tài)變化、是否畸形、顏色變化、有無病原菌菌落及孢子形成、菌蓋直徑大小、褐斑形態(tài)數(shù)目及大小、菌蓋開傘時(shí)間。

發(fā)病率（F，%）計(jì)算公式為：

式中：G為感病子實(shí)體數(shù)（個(gè)）；Z為總子實(shí)體數(shù)（個(gè)）。

子實(shí)體表面現(xiàn)褐色病斑，且病斑數(shù)大于10個(gè)即為感病。

1.7 建立雙孢蘑菇濕泡病的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及病情指數(shù)的計(jì)算

通過以上試驗(yàn)得到的最佳的評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種有害疣孢霉的方式對(duì)雙孢蘑菇發(fā)病情況的影響

不同接種方式接種后雙孢蘑菇的發(fā)病情況見圖2。

如圖2所示，使用滴定法接種3 d后，各雙孢蘑菇子實(shí)體菌蓋表面現(xiàn)一褐色病斑，不同品種間病癥區(qū)別較??；接種5 d各雙孢蘑菇子實(shí)體菌蓋表面現(xiàn)病斑，病斑形狀不規(guī)則，不同品種間病癥區(qū)別較??；接種后7 d供試，供試雙孢蘑菇子實(shí)體菌蓋表面現(xiàn)大量的有害疣孢霉菌絲，觀察不到病斑情況，供試的3株有害疣孢霉品種間發(fā)病癥狀無明顯區(qū)別。

圖2 不同接種方式接種5 d后雙孢蘑菇的發(fā)病情況Fig.2 Disease symptoms of Agaricus bisporus after inoculation of Hypomyces perniciosus with different methods after 5 d

使用噴霧式接種，接種后第3天開始，供試各雙孢蘑菇子實(shí)體菌蓋表面均現(xiàn)少量病斑；接種后5 d，供試3株雙孢蘑菇子實(shí)體菌蓋表面現(xiàn)明顯病斑，且不同雙孢蘑菇品種接種同一株有害疣孢霉菌株后病斑數(shù)目不同，其中As2796＞A15＞A40；接種后7 d，供試雙孢蘑菇子實(shí)體菌蓋表面現(xiàn)大量的有害疣孢霉菌絲，供試的3株有害疣孢霉品種間發(fā)病癥狀無明顯區(qū)別。

綜上所述采用噴霧接種的方法為最佳接種方法。

2.2 雙孢蘑菇不同發(fā)育階段接種有害疣孢霉對(duì)其發(fā)病情況的影響

雙孢蘑菇在不同生長發(fā)育階段接種有害疣孢霉5 d后發(fā)病癥狀情況見表2，雙孢蘑菇在不同生長發(fā)育階段接種有害疣孢霉5 d后發(fā)病率情況見表3。雙孢蘑菇在不同生長發(fā)育階段接種有害疣孢霉后發(fā)病情況見圖3。

圖3 雙孢蘑菇在不同生長發(fā)育階段接種5 d后有害疣孢霉后發(fā)病情況Fig.3 Disease symptoms of inoculation after 5 d of Hypomyces perniciosus on different Agaricus bisporus fruiting body growth stage

表2 雙孢蘑菇在不同生長發(fā)育階段接種有害疣孢霉5 d后發(fā)病癥狀情況Tab.2 Disease symptoms of inoculation of Hypomyces perniciosus on different Agaricus bisporus fruiting body growth stage after 5 d

表3 雙孢蘑菇在不同生長發(fā)育階段接種有害疣孢霉5 d后發(fā)病率情況Tab.3 Disease rate of inoculation of Hypomyces perniciosus on different Agaricus bisporus fruiting body growth stage after 5 d

由表2、表3及圖3可知，當(dāng)菌蓋直徑為3 mm～8 mm時(shí)接種會(huì)形成菌柄粗、菌蓋小的畸形菇，品種間病癥差異不明顯。當(dāng)菌蓋直徑9 mm～14 mm時(shí)接種，接種后3，出現(xiàn)少量病斑，但發(fā)病癥狀不明顯；接種后5 d菌蓋表面現(xiàn)褐色病斑，且不同品種間病斑數(shù)目與大小有差異。當(dāng)菌蓋直徑為15 mm～20 mm時(shí)接種，子實(shí)體在沒有觀察到明顯的病斑癥狀時(shí)即開傘，開傘后表面顏色變深，且開傘后由于孢子彈射導(dǎo)致菌蓋被褐色孢子覆蓋，使發(fā)病病癥不易觀察，且此時(shí)接種雙孢蘑菇發(fā)病率較低。

2.3 接種有害疣孢霉孢子濃度對(duì)雙孢蘑菇發(fā)病情況的影響

雙孢蘑菇接種不同濃度有害疣孢霉5 d后發(fā)病率情況見表4。

表4 雙孢蘑菇接種不同濃度有害疣孢霉5 d后發(fā)病率情況Tab.4 Disease rate of inoculation of Hypomyces perniciosus with different concentrations on Agaricus bisporus fruiting body after 5 d

由表4可知，有害疣孢霉的最佳接種濃度為3×104個(gè)/mL，每筐接種20 mL。當(dāng)接種濃度為3×103個(gè)/mL時(shí)，產(chǎn)生病斑數(shù)少、發(fā)病慢；接種濃度為1×105個(gè)/mL時(shí)子實(shí)體表面產(chǎn)生病斑數(shù)過多。A15子實(shí)體菌蓋直徑為9 mm～14 mm時(shí)接種不同濃度H1-12后發(fā)病情況見圖4。

如圖4所示，肉眼不易觀察品種間發(fā)病癥狀的區(qū)別。

圖4 雙孢蘑菇A15子實(shí)體菌蓋直徑9 mm～14 mm時(shí)接種不同濃度H1-12菌株5 d后發(fā)病情況Fig.4 5 d after inoculation of H1-12 on A15 fruiting body with 9 mm-14 mm cap diameter under different spore concentration.

2.4 接種有害疣孢霉后空氣相對(duì)濕度對(duì)雙孢蘑菇發(fā)病情況的影響

不同培養(yǎng)濕度下雙孢蘑菇接種有害疣孢霉5 d后發(fā)病率情況見表5。不同培養(yǎng)濕度下雙孢蘑菇閩秀1號(hào)接種有害疣孢霉H1-12約5 d后發(fā)病情況見圖5。

圖5 不同培養(yǎng)濕度下雙孢蘑菇接種有害疣孢霉5 d后發(fā)病情況Fig.5 Disease symptoms of inoculation of Hypomyces perniciosus on Agaricus bisporus fruiting body under different humidity after 5 d

表5 在不同培養(yǎng)濕度下雙孢蘑菇接種有害疣孢霉5 d后發(fā)病率情況Tab.5 Disease rate of inoculation of Hypomyces perniciosus on Agaricus bisporus fruiting body under different humidity after 5 d

由表5、圖5可知，接種后菇房相對(duì)濕度控制于86%～91%范圍內(nèi)為最佳培養(yǎng)濕度。于此相對(duì)濕度情況下雙孢蘑菇長勢良好，不會(huì)出現(xiàn)生長發(fā)育緩慢或者提前開傘的情況，且在接種后第5天子實(shí)體表現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀及發(fā)病率差異；當(dāng)相對(duì)濕度為80%～85%時(shí)，各雙孢蘑菇品種接種有害疣孢霉后發(fā)病率低，菌蓋表面產(chǎn)生病斑數(shù)目相對(duì)較少，且病斑顏色淺，如褐色的雙孢蘑菇品種A40不易觀察病斑；當(dāng)接種后相對(duì)濕度控制在92%～97%時(shí)，雙孢蘑菇子實(shí)體會(huì)形成菌柄較長，菌蓋薄提早開傘子實(shí)體褐變，致未觀察到明顯病斑前，其孢子覆蓋雙孢蘑菇子實(shí)體表面，不同品種間觀察不到明顯的病癥差別。

2.5 接種有害疣孢霉后不同時(shí)間內(nèi)雙孢蘑菇發(fā)病情況

雙孢蘑菇菌蓋直徑9 mm～14 mm時(shí)接種有害疣孢霉后不同時(shí)間內(nèi)發(fā)病率情況見表6，雙孢蘑菇閩秀2號(hào)菌蓋直徑9 mm～14 mm時(shí)接種有害疣孢霉H1-12后不同時(shí)間內(nèi)發(fā)病情況見圖6。

表6 雙孢蘑菇菌蓋直徑9 mm～14 mm時(shí)接種有害疣孢霉后不同時(shí)間內(nèi)發(fā)病率情況Tab.6 Disease rate of inoculation of Hypomyces perniciosus on Agaricus bisporus fruiting body with 9 mm-14 mm cap diameter under different time after inoculation

由表6、圖6可知，接種有害疣孢霉后病情評(píng)價(jià)的最佳時(shí)間為接種后第5 d。接種后的前3 d，病原菌處于潛伏期，雙孢蘑菇無明顯的發(fā)病癥狀。接種后5 d，雙孢蘑菇表現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，雙孢蘑菇病斑大量發(fā)生，不同雙孢蘑菇品種間病斑差異明顯，有害疣孢霉未在雙孢蘑菇子實(shí)體表面產(chǎn)生大量的孢子和菌絲體。因此，此時(shí)為病情評(píng)價(jià)的最佳時(shí)期；接種后第7天及之后，雙孢蘑菇處于發(fā)病后期，子實(shí)體表面會(huì)產(chǎn)生褐色液滴且有害疣孢霉的菌絲體覆蓋雙孢蘑菇表面導(dǎo)致品種間病癥相近，不易區(qū)分病害等級(jí)。

圖6 雙孢蘑菇菌蓋直徑9 mm～14 mm時(shí)接種有害疣孢霉后不同時(shí)間內(nèi)發(fā)病情況Fig.6 Disease symptoms of inoculation of Hypomyces perniciosus on Agaricus bisporus fruiting body with 9 mm-14 mm cap diameter under different time after inoculation

2.6 病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

病害分級(jí)評(píng)判等級(jí)依據(jù)接種后雙孢蘑菇表面的病斑數(shù)目及形態(tài)，共分5個(gè)等級(jí)。

0級(jí)：病斑數(shù)目0，雙孢蘑菇無任何發(fā)病癥狀；1級(jí)：雙孢蘑菇菌蓋表面現(xiàn)少量稀疏間斷的病斑，病斑1個(gè)～10個(gè)，病斑直徑0.5 mm～2.0 mm；2級(jí)：子實(shí)體菌蓋病斑數(shù)約10個(gè)～20個(gè)，病斑直徑約0.5 mm～2.0 mm；3級(jí)：子實(shí)體菌蓋病斑數(shù)約20個(gè)～40個(gè)，部分病斑相連，病斑直徑約0.5 mm～4.0 mm；4級(jí)：菌蓋表面病斑數(shù)大于40個(gè)，病斑過密而完全相連，病斑處現(xiàn)白色絨毛。

2.7 供試的雙孢蘑菇于最適接種條件接種有害疣孢霉后病情指數(shù)情況

病情指數(shù)（D，%） 計(jì)算公式為：

式中：J為小區(qū)中調(diào)查蘑菇的感病等級(jí)的級(jí)數(shù)；G為此感病等級(jí)的蘑菇子實(shí)體數(shù)目（個(gè)）；Z為小區(qū)中調(diào)查的蘑菇子實(shí)體總數(shù)（個(gè)）；B為此小區(qū)中感病蘑菇的最高病情等級(jí)。

供試的雙孢蘑菇于最適接種條件接種有害疣孢霉后病情指數(shù)情況見表7。

表7 雙孢蘑菇于最適接種條件接種有害疣孢霉后病情指數(shù)情況Tab.7 Disease index of Agaricus bisporus after inoculation Hypomyces perniciosus

由表7可知，由于不同的雙孢蘑菇品種對(duì)不同的有害疣孢霉菌株表現(xiàn)不同的病情分級(jí)程度，因此得到不同的病情指數(shù)值。供試的雙孢蘑菇品種接種相同濃度的H1-12菌懸液后病情指數(shù)最高，而接種HN0015-8后病情指數(shù)值最低。證明HN0015-8的致病力低于其他3個(gè)有害疣孢霉菌株。雙孢蘑菇閩秀2號(hào)品種在接種同一菌株相同濃度的的有害疣孢霉后其病情指數(shù)均低于其他2個(gè)供試的雙孢蘑菇品種，說明閩秀2號(hào)品種的抗病能力高于AS2796和A15。

2.8 感抗病程度劃分標(biāo)準(zhǔn)

綜合田間調(diào)查結(jié)果，參照品種病情，提出以病情指數(shù)來劃分感抗病標(biāo)準(zhǔn)：高抗（high resistance，HR）：病情指數(shù)低于15%；抗?。╮esistance，R）：病情指數(shù)大于15%，低于30%；中抗（moderately resistance，MR）：病情指數(shù)大于 30%,低于 45%；感?。╯usceptible，S）：病情指數(shù)大于45%，低于60%；高感（highsusceptible，HS）：病情指數(shù)大于60%。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在栽培環(huán)境條件相同的條件下，雙孢蘑菇接種有害疣孢霉后濕度越大病斑數(shù)目越多，發(fā)病速度越快。結(jié)合Regnier[6]的研究結(jié)果，隨著濕度的增加，有害疣孢霉孢子的萌發(fā)率增加，可以較好解釋為什么濕度越大雙孢蘑菇子實(shí)體表面病斑數(shù)目增加。同時(shí)，于雙孢蘑菇不同生長階段進(jìn)行接種發(fā)現(xiàn)，9 mm～14 mm接種為最佳接種時(shí)期，低于9 mm時(shí)，子實(shí)體過小接種產(chǎn)生大量畸形菇，且各品種之間表現(xiàn)癥狀差異不明顯，導(dǎo)致評(píng)價(jià)困難且誤差較大。Umar[5]于雙孢蘑菇不同生長階段接種有害疣孢霉觀察記錄雙孢蘑菇的發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)于雙孢蘑菇原基直徑小于6 mm時(shí)接種有害疣孢霉菌，雙孢蘑菇子實(shí)體不能進(jìn)行菌柄和菌蓋的分化而形成菇包狀組織，雙孢蘑菇表現(xiàn)菌柄粗大，菌蓋小的畸形子實(shí)體，或形成無菌蓋及菌柄分化的馬勃狀菇包組織。Umar[7]的研究結(jié)果與本研究所得結(jié)果相同，畸形蘑菇導(dǎo)致病斑數(shù)目少，因此較小時(shí)期的子實(shí)體不適合作為雙孢蘑菇感抗病評(píng)價(jià)。而當(dāng)菌蓋直徑大于15 mm接種，由于雙孢蘑菇接種后第5天初現(xiàn)明顯病癥，但此時(shí)雙孢蘑菇已處于子實(shí)體發(fā)育中后期，菌蓋開傘，孢子開始彈射，子實(shí)體顏色加深不利于病斑產(chǎn)生情況觀察，因此菌蓋直徑大于15 mm不能滿足肉眼快速判定品種間病癥差別要求。

4 結(jié)論

綜合使用不同接種方法下得到的發(fā)病癥狀及數(shù)據(jù)，確定了最佳接種條件及評(píng)價(jià)時(shí)間，建立了以接種后雙孢蘑菇菌蓋表面的病斑數(shù)量和大小作為新的雙孢蘑菇濕泡病病情分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。通過病情評(píng)價(jià)等級(jí)計(jì)算雙孢蘑菇的病情指數(shù)，以供試的3個(gè)雙孢蘑菇品種的病情指數(shù)建立了雙孢蘑菇感抗病評(píng)價(jià)等級(jí)。為國內(nèi)首次對(duì)雙孢蘑菇濕泡病感抗病評(píng)價(jià)體系的建立進(jìn)行系統(tǒng)的研究。該方法初步確定我國雙孢蘑菇品種中確實(shí)存在感抗病分化的現(xiàn)象，未來需要以此方法鑒定更多的雙孢蘑菇品種的感抗病情況，以更好的確定該評(píng)價(jià)系統(tǒng)的準(zhǔn)確性及在抗病性鑒定過程中不斷的規(guī)范和提高該評(píng)價(jià)系統(tǒng)。