藏藥巖生忍冬多糖抗氧化的實(shí)驗(yàn)研究

張熙苓，蘇小鋒，劉 群

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041）

巖生忍冬（Lonicera rupicola Hook. f. et Thoms.）屬忍冬科忍冬屬植物。目前對(duì)忍冬科忍冬屬藥物植物的研究主要集中于金銀花的研究，對(duì)同屬植物巖生忍冬研究較少。相關(guān)研究報(bào)道，忍冬屬藥物植物含環(huán)烯醚萜[1]、黃酮[2]、綠原酸[3]、揮發(fā)油[4]、皂苷[5]等多種具有藥理作用的活性物質(zhì)。為了探討藏藥巖生忍冬多糖的抗氧化作用，采用水煎醇沉法制備巖生忍冬多糖干膏制劑，通過(guò)體外DPPH·自由基體系、·OH 自由基體系、Fe3+還原力體系及S180 荷瘤小鼠大腦、肝臟、心臟、血液的SOD、CAT 活性、MDA 含量的研究以陽(yáng)性藥物維生素C 為對(duì)照，探究藏藥巖生忍冬多糖的抗氧化作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料

1.1 研究藥物

巖生忍冬采自四川省甘孜州色達(dá)地區(qū)。巖生忍冬多糖，由西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 周齡清潔級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g/只，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供。

1.3 主要試劑及儀器

S180 瘤細(xì)胞株（國(guó)家細(xì)胞共享資源庫(kù)提供）；羥自由基測(cè)定試劑盒（南京建成公司）；DPPH·溶液（Huaxia Reagent 公司）；維生素C 溶液（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；SOD（南京建成生物工程研究所有限公司）；MDA、CAT 測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（ThermoFisher 公司）等。

2 方法

2.1 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

按照生藥100%濃度，制備巖生忍冬多糖樣品溶液，4℃冰箱保存、備用；參考丁良等[6～7]的研究，以維生素C 為陽(yáng)性對(duì)照藥物，DPPH·自由基、羥自由基、Fe3+為研究體系，檢測(cè)巖生忍冬多糖體外的抗氧化作用。DPPH·自由基清除能力的測(cè)定按試劑盒操作測(cè)定IC50值；羥自由基清除能力測(cè)定按試劑盒操作測(cè)定抑制羥自由基能力（U/ml）；Fe3+還原能力測(cè)定按照鐵氰化鉀還原法，測(cè)定Fe3+還原力。

2.2 體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 巖生忍冬多糖口服液的制備

將巖生忍冬多糖配制成低、中、高的巖生忍冬多糖口服液（50%、100%、200%）。

2.2.2 S180 瘤細(xì)胞懸液的制備

S180 肉瘤制備瘤細(xì)胞懸液并確定接種小鼠，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中瘤體不被破裂死亡，以確定接種S180瘤細(xì)胞濃度。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

參照范旭楠等[8～10]的研究，84 只昆明小鼠隨機(jī)分成6 組?？瞻讓?duì)照組：正常小鼠，每天灌胃生理鹽水；S180 荷瘤對(duì)照組：每只小鼠右前肢腋下注射瘤細(xì)胞懸液0.2 ml/只，每天灌胃生理鹽水；維生素C 組：每只小鼠右前肢腋下注射瘤細(xì)胞懸液0.2 ml/只，每天灌胃維生素C（100 mg/kg·d）。高劑量多糖組、中劑量多糖組、低劑量多糖組，每只小鼠右前肢腋下注射瘤細(xì)胞懸液0.2 ml/只，每天灌胃巖生忍冬多糖分別為200 mg/kg·d、100 mg/kg·d、50 mg/kg·d。連續(xù)28 d。

2.2.4 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

摘除小鼠眼球，收集小鼠靜脈血，檸檬酸鈉抗凝，制備小鼠血漿樣本；頸椎脫臼法處死小鼠，取腦、肝臟、心臟，制備10%組織勻漿上清液，測(cè)定其SOD、MDA、CAT 按試劑盒操作。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 DPPH·清除能力

不同濃度巖生忍冬多糖和維生素C 對(duì)DPPH·自由基清除作用見(jiàn)表1～2。巖生忍冬多糖對(duì)DPPH·的清除能力隨著濃度的增加而增大。當(dāng)多糖濃度達(dá)到3.0 mg/ml 時(shí)，清除率達(dá)到最大值60.95%，IC50值為2.123 mg/ml；陽(yáng)性藥物維生素C 濃度為2.0 mg/ml 時(shí)，清除率達(dá)到最大值100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)巖生忍冬多糖質(zhì)量濃度為2.123 mg/ml，能有效清除DPPH·自由基體系中一半的DPPH·并隨著濃度的增加清除率增加，存在一定的量效關(guān)系。采用DPPH·自由基IC50清除率的巖生忍冬多糖濃度時(shí)，對(duì)DPPH·清除作用具有動(dòng)態(tài)特點(diǎn)，說(shuō)明巖生忍冬多糖對(duì)DPPH·清除作用可能存在一定的時(shí)效關(guān)系。藏藥巖生忍冬多糖對(duì)DPPH·具有一定的清除作用，其IC50=2.0 mg/ml，清除作用具有一定的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。

表1 DPPH·自由基清除率（%）

表2 DPPH·自由基清除率（%）

3.1.2 ·OH 清除能力

不同濃度巖生忍冬多糖和維生素C 對(duì)·OH 自由基清除作用見(jiàn)表3。巖生忍冬多糖對(duì)羥自由基清除力隨著巖生忍冬多糖濃度的增加而增大并穩(wěn)定在一定水平上。當(dāng)多糖濃度達(dá)到1.0 mg/ml 時(shí)，清除率達(dá)到最大，陽(yáng)性藥物維生素C 對(duì)羥自由基清除力高于巖生忍冬多糖的清除力。綜上藏藥巖生忍冬多糖對(duì)羥自由基具有一定的清除作用。

表3 ·OH 自由基清除率

3.1.3 Fe3+還原能力

不同濃度巖生忍冬多糖和維生素C 對(duì)Fe3+還原能力作用見(jiàn)表4。巖生忍冬多糖對(duì)Fe3+還原能力隨著巖生忍冬多糖濃度的增加而增大。當(dāng)多糖濃度達(dá)到1.0 mg/ml 時(shí)，還原力達(dá)到最大值，陽(yáng)性藥物維生素C 對(duì)Fe3+還原能力高于巖生忍冬多糖的還原能力。綜上，藏藥巖生忍冬多糖對(duì)Fe3+具有一定的還原作用。

表4 Fe3+還原能力

3.2 體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 SOD 活性

各組小鼠血漿及臟器組織中SOD 活性見(jiàn)表5。小鼠肝臟SOD 活力極顯著低于對(duì)照組SOD 活力（P＜0.01），三個(gè)劑量多糖組SOD 均極顯著高于荷瘤小鼠組的SOD 活力（P ＜0.01），顯著高于對(duì)照組SOD 活力；三個(gè)劑量多糖組SOD 活力表現(xiàn)出正向量效關(guān)系。小鼠大腦SOD 活力極顯著低于對(duì)照組SOD 活力（P ＜0.01），三個(gè)劑量多糖組SOD 均極顯著高于荷瘤小鼠組的SOD 活力（P ＜0.01）；小鼠心臟SOD 活力極顯著低于對(duì)照組SOD 活力（P ＜0.01），三個(gè)劑量多糖組SOD 活力均極顯著高于荷瘤小鼠組SOD 活力（P ＜0.01），三個(gè)劑量多糖組SOD 活力表現(xiàn)出正向量效關(guān)系。小鼠接種S180 瘤細(xì)胞后，血液及腦、心、肝SOD 活力極劇下降；陽(yáng)性藥物維生素C 具有增強(qiáng)荷瘤小鼠和正常小鼠SOD 活力；三個(gè)劑量多糖能夠增強(qiáng)低下的荷瘤小鼠SOD 活力并表現(xiàn)出對(duì)心、肝良好的正向量效關(guān)系，且預(yù)示三個(gè)多糖組對(duì)正常小鼠SOD 活力也具有增強(qiáng)作用。研究結(jié)果表明：巖生忍冬多糖具有增強(qiáng)機(jī)體SOD 活性的作用。

表5 小鼠血清及臟器組織中SOD 活力（ ±s，n = 14）

表5 小鼠血清及臟器組織中SOD 活力（ ±s，n = 14）

注: 同列數(shù)據(jù)肩上標(biāo)有相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著（P ＞0.05），標(biāo)有不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（0.01 ＜P ＜0.05），標(biāo)有不同大寫(xiě)字母表示極顯著差異（P ＜0.01）。下同。

組別肝（U/g）腦（U/g）心（U/g）血漿（U/ml）空白組496.60±4.59Bd554.08±8.21Bb426.50±2.87Dd488.18±9.11BCc模型組420.61±10.53Ce446.06±3.00Cc164.67±7.39Ee432.38±39.02Cc維生素C組570.81±5.30Aa579.33±2.69Aa539.92±4.89Aa559.39±2.55Aa低濃度組523.02±6.55Bc547.05±2.97Bb433.45±10.11Dd520.41±4.70ABab中濃度組547.49±4.03ABb555.14±2.58Bb466.68±7.91Cc551.17±7.54ABa高濃度組567.54±6.48Aa557.84±3.61Bb507.69±9.94Bb554.73±0.52ABa

3.2.2 CAT 活性

各組小鼠血漿及臟器組織中CAT 活性見(jiàn)表6。小鼠肝臟CAT 活力顯著低于對(duì)照組CAT 活力（P ＜0.05），三個(gè)劑量多糖組CAT 活力均極顯著高于荷瘤小鼠組的CAT 活力（P ＜0.01），低劑量多糖組CAT 活力顯著高于對(duì)照組；荷瘤小鼠大腦CAT 活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），三個(gè)劑量多糖組中、高劑量多糖組CAT 活力極顯著高于荷瘤小鼠CAT 活力（P ＜0.01），三個(gè)劑量多糖組CAT 活力平均值逐漸增大；荷瘤小鼠心臟CAT 活力極顯著低于對(duì)照組（P ＜0.01），三個(gè)劑量多糖組CAT 活力低于陽(yáng)性藥物組（P ＜0.01）。三個(gè)劑量多糖組中高劑量多糖組CAT 活力極顯著高于荷瘤小鼠組CAT活力（P ＜0.01）顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05）；荷瘤小鼠血漿CAT活力顯著低于對(duì)照組SOD活力（P＜0.05），三個(gè)劑量多糖組CAT 活力低于陽(yáng)性藥物組（P ＜0.01）且三個(gè)劑量多糖組CAT 活力平均值逐漸增大，中、高劑量多糖組極顯著高于低劑量多糖組（P ＜0.05）。小鼠接種S180瘤細(xì)胞后28 d，血液及腦、心、肝CAT活力下降；陽(yáng)性藥物維生素C 具有增強(qiáng)荷瘤小鼠和正常小鼠CAT 活力；三個(gè)劑量多糖不僅具有增強(qiáng)低下的荷瘤小鼠CAT 活力的作用并表現(xiàn)出一定的正向量效關(guān)系，研究結(jié)果表明：巖生忍冬多糖具有增強(qiáng)機(jī)體CAT 活性的作用。

表6 小鼠血清及臟器組織中CAT 活力（ ±s，n = 14）

表6 小鼠血清及臟器組織中CAT 活力（ ±s，n = 14）

組別肝（U/g）腦（U/g）心（U/g）血漿（U/ml）空白組49.42±5.56Cc16.88±1.45BCDcd125.84±10.63Bc2.59±0.96BCb模型組21.96±2.58Cd11.22±1.11De38.25±1.83Ce1.27±0.08Cc維生素C組130.20±12.34Aa29.07±1.75Aa202.11±8.48Aa4.96±0.91Aa低濃度組42.46±4.18Ccd12.44±1.97CDde39.40±4.08Cde2.48±0.25BCbc中濃度組98.00±11.11Bb19.43±2.69BCbc56.30±12.16Cde2.74±0.21BCb高濃度組98.91±4.58ABb23.72±1.68ABb165.10±10.63ABb3.17±0.37Bb

3.2.3 MDA 含量

各組小鼠血漿及臟器組織中MDA 含量見(jiàn)表7。荷瘤小鼠肝臟MDA 含量極顯著高于對(duì)照組的含量（P＜0.01）。三個(gè)劑量多糖組MDA 含量極顯著低于荷瘤小鼠組（P ＜0.01），三個(gè)劑量多糖組MDA 含量平均值隨劑量增加逐漸減小，表現(xiàn)出良好的負(fù)向量效關(guān)系。荷瘤小鼠大腦MDA 含量極顯著高于對(duì)照組MDA 含量（P＜0.01），三個(gè)劑量多糖組MDA 含量高于陽(yáng)性藥物組，表現(xiàn)為低劑量差異極顯著（P ＜0.01），中、高劑量差異顯著（P ＜0.05）；荷瘤小鼠心臟MDA 含量極顯著高于對(duì)照組MDA 含量（P ＜0.01），三個(gè)劑量多糖組MDA 含量高于陽(yáng)性藥物組（P ＜0.01），均極顯著低于荷瘤小鼠（P ＜0.01）；荷瘤小鼠血漿MDA 含量極顯著高于對(duì)照組（P ＜0.01），三個(gè)劑量多糖組和陽(yáng)性藥物MDA含量極顯著低于荷瘤小鼠組（P＜0.01）。小鼠接種S180 瘤細(xì)胞28 d 后，血液及腦、心、肝MDA 含量升高；維生素C 能夠降低荷瘤小鼠和正常小鼠MDA 含量；三個(gè)劑量多糖組具有降低荷瘤小鼠MDA含量且表現(xiàn)出對(duì)心、肝良好的負(fù)向量效關(guān)系，研究結(jié)果表明：巖生忍冬多糖具有降低機(jī)體MDA 含量的作用。

表7 小鼠血清及臟器組織中MDA 含量（ ±s，n = 14）

表7 小鼠血清及臟器組織中MDA 含量（ ±s，n = 14）

組別肝（U/g）腦（U/g）心（U/g）血漿（U/ml）空白組49.42±5.56Cc16.88±1.45BCDcd125.84±10.63Bc2.59±0.96BCb模型組21.96±2.58Cd11.22±1.11De38.25±1.83Ce1.27±0.08Cc維生素C組130.20±12.34Aa29.07±1.75Aa202.11±8.48Aa4.96±0.91Aa低濃度組42.46±4.18Ccd12.44±1.97CDde39.40±4.08Cde2.48±0.25BCbc中濃度組98.00±11.11Bb19.43±2.69BCbc56.30±12.16Cde2.74±0.21BCb高濃度組98.91±4.58ABb23.72±1.68ABb165.10±10.63ABb3.17±0.37Bb

4 討論與結(jié)論

4.1 巖生忍冬多糖體外抗氧化作用

體外抗氧化研究方法目前主要采用DPPH·、·OH 自由基體系和Fe3+還原力測(cè)定體系，并以維生素C 作為對(duì)照，用于研究中藥的抗氧化活性。中草藥及其化學(xué)成分的抗氧化能力隨其濃度增加逐步上升，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，但明顯低于維生素C 的抗氧化能力。IC50為清除率達(dá)到50%時(shí)所需藥物的濃度，IC50值的大小表明了抗氧化劑清除自由基的能力高低，IC50值越小，抗氧化劑能力越強(qiáng)[11]。藏藥巖生忍冬多糖抗氧化作用的結(jié)果表明，藏藥巖生忍冬多糖對(duì)DPPH·具有一定的清除作用，其IC50=2.0 mg/ml，清除作用具有一定的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。研究結(jié)果也表明，藏藥巖生忍冬多糖對(duì)·OH 自由基、Fe3+具有一定的清除和還原作用。

4.2 巖生忍冬多糖體內(nèi)抗氧化作用

SOD 廣泛存在于各組織細(xì)胞中，通過(guò)歧化O2-·為H2O2與O2，減少O2-·聚集。在氧化應(yīng)激引發(fā)的炎癥動(dòng)物模型、衰老動(dòng)物模型、癌癥動(dòng)物模型等中，血清和組織SOD 含量下降，說(shuō)明SOD 的活性受到了影響。CAT 酶活力是生物體抗氧化水平的另一指標(biāo)，肝臟具備高效降解、解毒作用的原因之一是肝細(xì)胞的過(guò)氧化物體內(nèi)存在有大量的CAT，CAT將H2O2分解為H2O 和O2。MDA 是自由基與脂質(zhì)生物膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化物，在一定程度上反應(yīng)機(jī)體的抗氧化能力。植物多糖作為中藥有效成分之一，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等活性，尤其是近年來(lái)多糖的抗氧化作用受到廣泛的重視[12]。張麗梅[13]發(fā)現(xiàn)銀耳多糖對(duì)衰老大鼠的血清、肝臟及腦組織中的SOD、CAT酶的活力有增強(qiáng)作用。藥巖生忍冬多糖體內(nèi)抗氧化研究表明，不同劑量巖生忍冬多糖不僅具有增強(qiáng)低下的荷瘤小鼠肝、腦、心臟、血液SOD、CAT 活力，降低荷瘤小鼠肝、腦、心臟、血液高M(jìn)DA 含量的作用，對(duì)心、肝表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。

目前，對(duì)巖生忍冬的藥理學(xué)研究還未見(jiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)表明：S180 荷瘤小鼠肝、腦、心臟、血液SOD、CAT 活力顯著低于正常小鼠，MDA 含量高于正常小鼠；不同劑量巖生忍冬多糖不僅具有增強(qiáng)低下的荷瘤小鼠肝、腦、心臟、血液SOD、CAT 活力，降低荷瘤小鼠肝、腦、心臟、血液高M(jìn)DA 含量的作用，對(duì)心、肝表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。并且100 ～200 mg/kg·d 巖生忍冬多糖連續(xù)給藥28 d，對(duì)正常小鼠也具有增強(qiáng)SOD、CAT 活力、降低MDA 含量的作用。研究結(jié)果表明，藏藥巖生忍冬多糖具有增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力并具有量效關(guān)系。