不同樹盤覆蓋對矮砧蘋果園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

薛曉敏,王來平,韓雪平,陳 汝,王金政

山東省果樹研究所, 泰安 271000

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要生物組分[1],對植物生長及土壤微環(huán)境的調(diào)節(jié)具有重要作用,其群落結(jié)構(gòu)和多樣性主要受植物物種組成和土壤質(zhì)量狀況的影響[2- 3]。研究表明,果園實施覆蓋后,微生物的群落組成、結(jié)構(gòu)以及多樣性發(fā)生改變,從而影響整個果園生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)換及能量循環(huán),并最終對地上部植物的生長和發(fā)育產(chǎn)生一定影響[4- 5]。

由于我國蘋果產(chǎn)區(qū)長期沿用全園清耕的土壤管理模式,導(dǎo)致土壤肥力退化,土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡,進而影響了我國的蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)[6]。目前,采用的解決措施主要有生草覆蓋[7]、淺耕、秸稈覆蓋[8]和地膜覆蓋[9]。而樹盤直接覆蓋秸稈存在操作不便、耗時長且易感病蟲害等諸多問題,地膜覆蓋殘留則會造成土壤污染[10- 11],因此尋找一種新的覆蓋措施對于解決果園土壤管理問題及節(jié)省人工都具有重要意義。園藝地布是由聚丙烯扁絲做成的一種環(huán)保型覆蓋材料,具有抑制雜草、滲水透氣、改良土壤、防止果樹爛根等優(yōu)點[12-14]。鄭悅等[15]研究發(fā)現(xiàn)園藝地布微壟覆蓋可作為渭北旱地蘋果栽培體系中的一種有效的蓄水保墑技術(shù)措施；此外,地布覆蓋還可以顯著提高果樹的凈光合速率和果實品質(zhì),及土壤的養(yǎng)分利用率[16-17]。但前人研究多集中于不同覆蓋對土壤溫濕度、土壤養(yǎng)分、植株葉片參數(shù)、樹體生長量和果實品質(zhì)的影響等方面,對于土壤微生物群落結(jié)果的影響鮮有報道,且已有研究大多基于喬化蘋果園方面,在矮化蘋果方面更是鮮有研究。

本試驗以山東省果樹研究所天平湖基地矮砧蘋果園為研究對象,以清耕不覆蓋為對照,通過田間試驗和高通量測序技術(shù),探討防水、透水園藝地布覆蓋,塑料薄膜覆蓋對矮砧蘋果園土壤細菌和真菌群落的影響,以期為確定矮砧蘋果園的土壤管理技術(shù)提供理論參考基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2015年至2016年進行,試驗園位于山東省果樹研究所天平湖基地(北緯：36°12′55.36″,東經(jīng)：117°01′09.87″),海拔168 m,全年日照時數(shù)2627.1 h,年均降水量697 mm,年均氣溫12.9℃,全年≥0℃的積溫47319℃,平均無霜期195 d。果園模式為現(xiàn)代矮砧集約栽培,采用寬行密植、行間生草、起壟栽培、設(shè)立支架、高紡錘樹形等技術(shù),供試砧穗組合為‘天紅2號/SH38/八棱海棠’,樹齡7年生,株行距0.75 m×4.0 m；土質(zhì)為砂壤土,肥力中等,灌溉條件良好,管理水平中等偏上,園相整齊,樹勢健壯,生長正常。

1.2 試驗設(shè)計

樹盤覆蓋在建園時培植的土壟上(即在樹干基部培土,沿行向培成高15—30 cm、上部寬40—50 cm、下部寬100—120 cm的“弓背形”土壟)進行,共設(shè)4個試驗處理(表1),透水園藝地布、防水園藝地布、黑塑料膜以及清耕不覆蓋。于2015年11月,選擇健康、長勢基本一致的蘋果樹,整行覆蓋,3次重復(fù),其他田間管理措施保持一致。

表1 試驗處理

1.3 樣品采集

于落葉后(2016年11月24日)進行土壤樣品采集。采用五點取樣法,分別在處理的 15株樣本樹東、南、西、北4個方位距樹干60 cm處用直徑4 cm土壤取樣器采集 0—20、20—40 cm土壤,去除雜質(zhì)后進行混合,裝進封口袋放進干冰箱帶回實驗室,-80℃冰箱保存用于微生物多樣性分析。

1.4 高通量測序方法

1.4.1基因組DNA提取

采用MO-BIO PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒對樣本的基因組DNA進行提取,之后取3 μL進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,檢測DNA的純度和濃度。

1.4.2PCR擴增

采用兩步PCR擴增方法[18],第一步采用50 μL反應(yīng)體系：10 μL 5xBuffe,1 μL dNTP (10mM),1 U Phusion超保真DNA聚合酶,F/R特異引物(10 μM)各1 μL(細菌16S V4—V5區(qū)片段擴增采用特異引物515F 5′—GTGCCAGCMGCCGCGGTAA—3′,926R 5′—CCGTCAATTCMTTTGAGTTT—3′；真菌ITS1片段擴增采用特異引物ITS1F 5′—CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA—3′,ITS1 R 5′—GCTGCGTTCTTCATCGATG—3′),20 ng DNA模板,ddH2O補至 50 μL。利用ABI9700智能梯度PCR儀進行擴增。反應(yīng)條件: 94℃ 預(yù)變性2 min,94℃變性30 s,56℃(細菌)/50℃(真菌)退火30 s,72℃延伸30 s,共25(細菌)/33(真菌)個循環(huán),72℃延伸5 min 終止反應(yīng),10℃保溫。將產(chǎn)物進行膠回收后作為模板進行第二步PCR擴增,采用40 μL反應(yīng)體系：8 μL 5xBuffe,1 μL dNTP(10 mM),0.8 U Phusion超保真DNA聚合酶,1 μL F/R 特異引物(10 μM),5 μLDNA模板,ddH2O補至 40 μL。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性2 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,共8個循環(huán),72℃延伸5 min 終止反應(yīng),10℃保溫。利用ABI9700智能梯度PCR儀進行擴增。

1.4.3PCR產(chǎn)物的混樣和純化

取3 μL PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增條帶合格后,將PCR擴增產(chǎn)物,于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收。采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收。采用FTC- 3000TM real-time PCR儀對膠回收產(chǎn)物進行定量。

1.4.4文庫制備和上機測序

使用TruSeq? DNAPCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫用 FTC—3000TM real—time PCR 儀進行實時熒光定量,文庫合格后,使用Hi Seq2500 PE250進行上機測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

測序數(shù)據(jù)采用雙端fastq格式保存(fq1和fq2),并根據(jù) Barcode 信息對原始序列進行拆分,確定各樣本對應(yīng)的有效序列數(shù)。用Trimmomatic軟件對有效序列進行質(zhì)量過濾,用FLASH軟件對每個樣品的reads進行拼接[19]；再使用mothur V.1.33.3軟件去除(screen),得到優(yōu)化序列(clean Tags)[20]。利用Uparse在97%相似度下進行優(yōu)化序列聚類,得到OTU的代表序列,再用Uchime去除嵌合體[21],其中16S嵌合體數(shù)據(jù)庫為gold database(v20110519),ITS嵌合體數(shù)據(jù)庫為UNITE(v20140703)；然后用usearch_global篩選OUT的代表序列,通過mothur(classify.seqs)軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫比對進行物種注釋,置信度閾值為0.8。

使用mothur (http://www.mothur.org/ wiki/Schloss_SOP #Alpha_diversity) 軟件分析Alpha多樣性[22],包括Chao1、ace及simpson指數(shù)；使用R軟件繪制稀釋曲線、聚類圖等,使用 Excel 2010和 SPSS 進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化序列統(tǒng)計

土壤樣本測序結(jié)果統(tǒng)計如表2所示,其中細菌共測定得有效序列條數(shù)為335497,過濾掉低質(zhì)量的序列后,得到優(yōu)化序列總數(shù)為260764,優(yōu)化序列所占比例均大于76%；真菌共測得有效序列條數(shù)為400976,過濾掉低質(zhì)量的序列后,優(yōu)化序列總數(shù)為358816,優(yōu)化序列所占比例均大于86%。

樣品稀釋曲線(圖1)是表征高通量測序深度是否能夠涵蓋樣品中所有微生物類群的重要依據(jù),8個土壤樣品的OTUs數(shù)隨著序列讀取數(shù)量的增加先快速上升而后轉(zhuǎn)變?yōu)榫徛厣仙?序列數(shù)量達到4000時,各樣本稀釋曲線基本趨向平坦,表明測序深度合理,可以反映樣品中的物種組成。

表2 土壤樣本細菌和真菌測序結(jié)果統(tǒng)計

圖1 土壤樣本細菌和真菌稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacteria and fungi of soil samplesA_1：不覆蓋0—20 cm； A_2：不覆蓋20—40 cm； B_1：透水園藝地布覆蓋0—20 cm； B_2：透水園藝地布覆蓋20—40 cm； C_1：防水園藝地布覆蓋0—20 cm； C_2：防水園藝地布覆蓋20—40 cm； D_1：塑料膜覆蓋0—20 cm； D_2：塑料膜覆蓋20—40 cm

2.2 樹盤覆蓋對土壤微生物Alpha多樣性的影響

Alpha多樣性(Alpha diversity)主要包括Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)和Simpson指數(shù),其中Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)反映樣品中群落的豐富度,Simpson指數(shù)反映群落的多樣性[19-20]。本試驗采用97%的一致性對樣品優(yōu)化序列進行聚類來研究不同土層微生物物種多樣性(表3),由覆蓋度均超過97%可知,在選擇OTU為 0.03相似度水平下能夠表現(xiàn)所測樣本中細菌的真實情況。

細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性結(jié)果表明,園藝地布覆蓋和塑膜覆蓋處理均顯著提高了0—20 cm土層的Ace和Chao1豐富度指數(shù),其中除C與A相比差異不顯著外,其他覆蓋處理與對照相比差異顯著,各覆蓋處理之間差異不顯著。Simpson優(yōu)勢度指數(shù)以C最高達到0.0147,高出對照93.42%,由大到小順序是C、B、D、A,各覆蓋處理均顯著高于對照,但是B和D之間差異不顯著。對于20—40 cm土層,4種處理的細菌Ace豐富度指數(shù)由大到小的順序為C、A、B、D；Chao1豐富度指數(shù)由大到小的順序為A、C、D、B,各處理均未達到顯著性差異；Simpson優(yōu)勢度指數(shù)由大到小的順序為D、C、B、A,各覆蓋處理均顯著高于對照,且表現(xiàn)出顯著性差異。

真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性結(jié)果表明,園藝地布覆蓋和塑膜覆蓋處理均顯著降低了0—20 cm土層真菌的Ace和Chao1豐富度指數(shù),由大到小的順序均為A、D、B、C,各覆蓋處理均顯著低于對照,但是A和D之間差異不顯著。Simpson優(yōu)勢度指由大到小的順序與此相反,且與對照均表現(xiàn)出顯著性差異。對于20—40 cm土層,4種處理的真菌Ace、Chao1豐富度指數(shù)由大到小的順序均為A、B、C、D,Simpson優(yōu)勢度指數(shù)由大到小的順序為C、A、D、B,且各處理間表現(xiàn)出顯著性差異。

綜上，樹盤覆蓋處理可以提高0—20 cm土層細菌群落的豐富度和優(yōu)勢度,降低真菌群落的豐富度和多樣性,同時降低20—40 cm土層細菌群落的豐富度和多樣性和真菌群落的豐富度,其中防水園藝地布處理最佳。

表3 樹盤覆蓋對土壤微生物Alpha多樣性的影響

2.3 樹盤覆蓋對土壤微生物Beta多樣性的影響

Beta多樣性(Beta diversity)研究中,選擇unweighted unifrac指數(shù)來衡量樣品間微生物群落的相似度,用unweighted unifrac距離繪制樣品相似度聚類樹。土壤細菌群落結(jié)構(gòu)樹狀圖如圖2左所示,在較低的相似度水平下,土壤細菌群落結(jié)構(gòu)被聚為兩大支,樹盤覆蓋處理單獨聚為一支,不覆蓋樣本聚為另一支,表明樹盤覆蓋土壤中的細菌群落結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別于不覆蓋土壤；而對于樹盤覆蓋單支來說,覆蓋材料和土層深度對細菌群落結(jié)構(gòu)都有影響,透水園藝地布0—20、20—40 cm土樣被聚在一起,說明其覆蓋材料的影響大于土層深度影響；而防水園藝地布20—40 cm、塑膜20—40 cm被聚在一起,說明其土層深度的影響高于覆蓋材料差異；地膜覆蓋0—10 cm和透水園藝地布覆蓋0—10 cm細菌群落結(jié)構(gòu)相似度較近,而防水園藝地布覆蓋0—10 cm土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與其他覆蓋處理的差異較大。

土壤真菌群落結(jié)構(gòu)樹狀圖如圖2右所示,可見除個別樣本外,土壤真菌群落結(jié)構(gòu)整體被聚為兩大支,樹盤覆蓋處理單獨聚為一支,不覆蓋樣本聚為另一支,表明樹盤覆蓋處理使土壤中的真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變。而對于樹盤覆蓋單支來說,土層深度對細菌群落影響較大,除透水園藝地布0—20、20—40 cm土樣因覆蓋材料影響較大被聚在一起外,其他不同土層樣品均未聚在一起；需要特別說明的是,防水園藝地布覆蓋20—40 cm與不覆蓋0—20 cm聚在一起,說明其真菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高,甚至高于不覆蓋處理兩個土層的,具體原因需進一步分析。

從整個土壤微生物群落結(jié)構(gòu)來看,覆蓋處理中以透水園藝地布影響較大,顯著地改變了土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)。

圖2 土壤微生物細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)相似性聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of soil microbial bacteria and fungicommunity structure similarity

2.4 樹盤覆蓋對土壤微生物群落組成的影響

將聚類結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對,根據(jù)物種注釋結(jié)果,在各分類水平上統(tǒng)計各樣本的群落組成,生成物種相對豐度柱狀累積圖,以便形象直觀地比較各樣本在不同分類水平上相對豐度較高的物種及比例。以門水平物種相對豐度柱形圖為例,分析樹盤覆蓋對土壤微生物群落組成的影響(圖3)。

由圖3可知,在細菌水平上,不同覆蓋處理間細菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高,其中豐度較高的前10個門分別為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、Latescibacteria、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)以及疵微菌門(Verrucomicrobia),各細菌相對含量分析顯示,優(yōu)勢類群為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和擬桿菌門,這4種優(yōu)勢類群所占比例均在80%左右,對0—20 cm土層來說,透水和防水園藝地布處理均提高了變形菌門的相對豐度,較對照分別提高了13.65%和14.52%,降低了擬桿菌門和酸酐菌門的相對豐度,較對照分別降低了11.32%、11.23%和1.31%、4.87%,透水園藝地布處理提高了放線菌門的豐度,較不覆蓋分別提高了8.75%；塑膜覆蓋降低了變形菌門、放線菌門的相對豐度,較對照降低了12.02%和38.04%,提高了酸酐菌門和擬桿菌門的相對豐度。對20—40 cm土層來說,防水園藝地布和塑膜覆蓋處理均提高了變形菌門和放線菌門的豐度,分別較對照提高了3.28%、35.95%和8.43%、1.30%,降低了酸酐菌門的豐度,較對照分別降低了3.53%和5.68%。透水園藝地布處理提高了酸酐菌門的相對豐度,降低了變形菌門、放線菌門和擬桿菌門的相對豐度,較對照分別降低了6.44%、0.08%和1.16%。

由圖3可知,在真菌水平上,豐富度較高的門分別為接合菌門(Zygomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、芽枝毒門(Blastocladiomycota),結(jié)合相對含量分析,優(yōu)勢類群分別為接合菌門、擔子菌門和子囊菌門,這3種優(yōu)勢類群中,除不覆蓋20—40 cm樣本外,所占比例均在90%左右,對0—20 cm土層來說,透水、防水園藝地布和塑膜覆蓋均提高了接合菌門相對豐度,較不覆蓋分別提高了117.96%、113.61%和52.56%;降低了擔子菌門相對豐度,較不覆蓋分別降低了56.82%、96.44%和78.23%;對于子囊菌門,園藝地布覆蓋使其豐度降低,塑膜覆蓋使其豐度升高。對20—40 cm土層來說,透水、防水園藝地布和塑膜覆蓋,覆蓋處理均提高了接合菌門相對豐度,較不覆蓋分別提高了26.94%、118.81%和57.29%;而透水園藝地布和塑膜覆蓋處理均提高了擔子菌門和子囊菌門相對豐度,較不覆蓋分別提高了56.79%、168.83%和49.41%、10.59%；防水園藝地布覆蓋降低了擔子菌門和子囊菌門相對豐度,較對照分別降低了57.21%和33.48%。

圖3 門分類水平土壤樣本細菌和真菌群落組成Fig.3 Composition and relative abundance of bacterial and fungal communities in soil samples at phylum level

3 討論

土壤微生物作為土壤中最重要的活性組分,其多樣性水平也是反映土壤環(huán)境的重要指標,而微生物的群落組成受覆蓋類型的影響較大,不同的地面覆蓋對土壤溫濕度等生態(tài)環(huán)境的影響不同,導(dǎo)致土壤微生物多樣性和豐富度會有所不同[23-24]。魏倩倩等[25]研究發(fā)現(xiàn),矮砧蘋果園覆蓋白三葉,短期內(nèi)可顯著提高土壤微生物代謝活性,增加土壤微生物多樣性；孫萌等[26]研究發(fā)現(xiàn)地膜覆蓋對5—15 cm土層溫度的提高有顯著效果,同時提高了土壤微生物活性及呼吸率。本試驗Alpha多樣性分析結(jié)果顯示,透水園藝地布處理顯著提高了0—20 cm土層細菌的多樣性指數(shù),降低了細菌優(yōu)勢度指數(shù),說明透水園藝地布覆蓋豐富了土壤細菌群落結(jié)構(gòu),同時使物種均勻度變高,進而提高了抗病原菌的綜合能力[27-29]。溫曉霞等[30]研究發(fā)現(xiàn)秸稈和地膜覆蓋處理下,土壤微生物數(shù)量隨土層深度的增加而減少,這與本試驗結(jié)果一致,經(jīng)過園藝地布樹盤覆蓋處理后20—40 cm土層細菌和真菌群落的多樣性和豐富度有所降低,其中透水園藝地布處理顯著降低了土壤真菌的優(yōu)勢度指數(shù)。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性對生態(tài)系統(tǒng)的平衡起著重要作用,由于許多細菌和真菌種類的生活史未知以及其不可培養(yǎng)性使得土壤微生物的重要性被低估[31]。應(yīng)用高通量測序分析技術(shù),可以比較準確地反映細菌和真菌群落特征[32]。陳汝等[12]研究發(fā)現(xiàn),不同覆蓋物及耕作措施等都會對微生物的群落結(jié)構(gòu)組成及其多樣性產(chǎn)生較大影響。在本研究中3個覆蓋處理在門水平上細菌優(yōu)勢菌群組成相似,主要有變形菌門、放線菌門、擬桿菌門及酸桿菌門,該結(jié)果與劉岳飛[33]的研究結(jié)果一致,這些菌群在其他一些研究中也被認為是優(yōu)勢種群[34]。變形菌門的微生物多為兼性或者專性厭氧及異養(yǎng)生活微生物,該門的鞘氨醇單胞菌屬有去除難降解污染物的能力[35],放線菌能夠分解纖維素和木質(zhì)素,豐富的放線菌有利于土壤中植物有機殘體的分解[36]。本試驗結(jié)果顯示透水園藝地布處理顯著提高了0—20 cm 土層變形菌門和放線菌門的相對豐度,而塑料地膜處理結(jié)果與此相反,說明地布覆蓋在一定程度上可以改善土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。本試驗3種覆蓋處理后酸酐菌門和擬桿菌門的相對豐度均有所降低,可能與酸桿菌門大多是嗜酸菌,更喜歡養(yǎng)分含量較低的土壤環(huán)境有關(guān)[33],而擬桿菌門與 DNA、蛋白質(zhì)和脂類等有機物質(zhì)的轉(zhuǎn)化緊密相關(guān)[37],具體聯(lián)系仍需進一步探討。

在門水平上真菌優(yōu)勢菌群主要有接合菌門、擔子菌門和子囊菌門,這3種優(yōu)勢類群中,除不覆蓋20—40 cm樣本外,所占比例均在90%左右,有研究發(fā)現(xiàn)接合菌門的被孢霉科(Mortierellaceae) 能分解土壤中的糖類和簡單多糖物質(zhì),是土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分含量豐富的標志[38]。本試驗結(jié)果顯示3種覆蓋處理均提高了不同土層接合菌門的相對豐度,以透水園藝地布處理提高最顯著,說明地布覆蓋可以提高土壤養(yǎng)分。子囊菌多數(shù)為腐生菌,可以分解木質(zhì)素、角質(zhì)素等難降解的有機質(zhì),在養(yǎng)分循環(huán)中擔任著重要角色[39],擔子菌門的滑銹傘屬、絲膜菌屬可與植物共生形成菌根,增強植株抗性[34]。本試驗結(jié)果中,防水園藝地布處理顯著降低了不同土層擔子菌門和子囊菌門的相對豐度,而透水園藝地布和塑膜處理提高了20—40 cm土層擔子菌門和子囊菌門的相對豐度,以透水園藝地布處理提高最明顯,說明透水地布處理優(yōu)化了土壤真菌群落組成。從Beta多樣性分析結(jié)果來看,三種覆蓋處理下土壤細菌和真菌的物種組成和群落結(jié)構(gòu)均異于對照,且與對照處理相似性最高的為防水地布覆蓋處理,塑膜覆蓋處理次之,透水地布覆蓋處理較對照相似性最低,說明其對土壤細菌和真菌的物種組成和群落結(jié)構(gòu)變化影響最明顯。

綜合以上研究結(jié)果,透水園藝地布覆蓋對改變不同土壤空間細菌和真菌的豐富度和多樣性最明顯,可提高0—20 cm土層細菌的豐富度和多樣性,降低不同土層真菌的豐富度和多樣性；可提高0—20 cm土層變形菌門、接合菌門和放線菌門的相對豐度,提高20—40 cm土層擔子菌門和子囊菌門的相對豐度,改善了土壤微生物組成與結(jié)構(gòu),優(yōu)化了土壤環(huán)境。因此,透水園藝地布覆蓋作為一種良好的地面管理措施,具有良好的應(yīng)用價值。