陳晨 張妍蓓
1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年呼吸與危重癥(合肥230022);2安徽省胸科醫(yī)院結(jié)核科(合肥230022)
許多肺部疾病均能引起肺部持續(xù)性的低氧環(huán)境,從而發(fā)展為缺氧性肺動脈高壓[1-3],死亡率極高[4]。研究發(fā)現(xiàn)通過抑制TGF?β1/Smads 通路相關(guān)因子的表達(dá)能夠緩解缺氧性肺動脈高壓[5],炎癥和重塑會使血管發(fā)生永久性的結(jié)構(gòu)改變,而半乳糖凝集素?3(galectin?3,Gal?3)的高表達(dá)能夠增加平滑肌細(xì)胞的非自然增殖和存活[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)Rho 激酶抑制劑法舒地爾在慢性阻塞性肺疾病相關(guān)性肺動脈高壓中有一定作用[7]。國內(nèi)對于中藥治療缺氧性肺動脈高壓的研究越來越多,研究發(fā)現(xiàn)黃酮類槲皮素能減輕肺動脈高壓的嚴(yán)重程度[8],丹參通過抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞過度增殖和過度激活RhoA/Rho 信號通路來預(yù)防大鼠缺氧性肺動脈高壓[9],葛根素誘導(dǎo)人肺動脈平滑肌細(xì)胞線粒體依賴性凋亡[10],但是對于Rho 激酶抑制劑法舒地爾聯(lián)合葛根素治療缺氧性肺動脈高壓的研究未見報道。因此研究Rho 激酶抑制劑法舒地爾聯(lián)合葛根素通過TGF?β1/Smads 通路和炎癥反應(yīng)來減輕缺氧誘導(dǎo)肺動脈高壓對肺血管的損傷程度具有重要的意義,對于臨床治療缺氧性肺動脈高壓提供理論依據(jù)。
1.1 實驗動物與分組選取體質(zhì)量為180~200 g的SD 大鼠60 只(最后納入實驗的例數(shù),HPH 模型成功率為72%),隨機(jī)分成5 組:正常對照組、模型組、葛根素組、法舒地爾組和法舒地爾與葛根素聯(lián)合治療組。
將模型組、葛根素組、法舒地爾組和法舒地爾與葛根素聯(lián)合治療組大鼠分別放入常壓缺氧艙內(nèi)缺氧,缺氧期間艙內(nèi)氧濃度控制在10%,每天缺氧8 h,連續(xù)21 d[11]。各組大鼠缺氧放置前30 min進(jìn)行腹腔注射,葛根素組大鼠注射葛根素注射液20 mg/kg,法舒地爾組大鼠注射法舒地爾注射液15 mg/kg,聯(lián)合治療組大鼠注射葛根素注射液20 mg/kg+法舒地爾注射液15 mg/kg,對照組和模型注射相當(dāng)體積的0.9%NaCl 溶液。
1.2 實驗方法
1.2.1 血流動力學(xué)指標(biāo)的測定將麻醉后的大鼠仰臥位固定在手術(shù)板上,用測壓導(dǎo)管沿著大鼠勁外靜脈經(jīng)右心房插入至右心室及肺動脈,記錄右心室收縮壓(RVSP)、平均肺動脈壓(mPAP)、肺動脈收縮壓(PASP)和肺小動脈楔壓(PAWP)。
1.2.2 右心室肥厚指數(shù)的測定開胸取心臟,采集并稱取右心室(RV)和左心室加室間隔(LV+S)的重量,計算右心室肥厚指數(shù)(RVHI)=RV/(LV+S)。
1.2.3 HE 染色法將石蠟切片脫蠟至水后,沒入Harris 蘇木素染液,蒸餾水洗后用1%的鹽酸酒精分化,0.6%氨水返藍(lán),伊紅染液中染色。脫水透明后,用中性樹膠封片保存。用光學(xué)顯微鏡鏡觀察肺血管形態(tài)學(xué)變化。
1.2.4 qPCR 檢測法肺組織被迅速分離后放于液氮中。采用Trizol 法提取樣品中總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后,擴(kuò)增目的基因(表1)。
表1 引物序列Tab.1 Primer sequence
1.2.5 Western blot檢測法提取總蛋白,采用SDS?PAGE 分離蛋白。隨后轉(zhuǎn)印蛋白到PVDF 膜上。5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗(兔抗鼠TGF?β1、Smad2、Smad4 和Smad7 多克隆抗體)4 ℃孵育過夜,二抗(HRP 標(biāo)記的山羊抗兔)室溫孵育1 h。采用ECL顯色法掃描獲得圖片。通過Image J 軟件對目的條帶進(jìn)行灰度分析,做統(tǒng)計學(xué)分析。
1.2.6 免疫組化檢測法將肺組織放入4 ℃4%多聚甲醛中固定6 h,再放入30%蔗糖4 ℃過夜,然后將組織包埋成石蠟塊,切片、爬片、脫臘后按照免疫組化試劑盒進(jìn)行免疫組化,置于倒置顯微鏡下觀察。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間多重比較采用單因素方差分析,采用最小顯著性差異(LSD)檢驗作為多重比較的事后分析。方差不整齊時進(jìn)行Dunnett′t 檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH大鼠血流動力學(xué)和右心室重構(gòu)指標(biāo)的影響模型組RVSP、mPAP、PASP、PAWP和RVHI值明顯高于Sham組(P<0.05)。與模型組、葛根素組和法舒地爾組比較,聯(lián)合治療組的RVSP、mPAP、PASP、PAWP 和RVHI 值顯著降低(P<0.05)。見表2。
2.2 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠肺動脈血管壁的影響見圖1,對照組組肺動脈血管壁清晰、管壁薄、管腔大、細(xì)胞分布均勻、血管周圍無炎性浸潤。與對照組相比,模型組肺動脈血管壁明顯增厚、平滑肌增生、管腔變狹窄、細(xì)胞核增多、血管周圍出現(xiàn)炎性浸潤。與模型組相比,葛根素組、法舒地爾組和聯(lián)合治療組肺動脈血管壁厚度下降、管腔變小、細(xì)胞形態(tài)趨于正常、血管周圍炎性浸潤程度下降。
表2 各組大鼠血流動力學(xué)和右心室重構(gòu)指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of hemodynamics and right ventricular remodeling in each group ±s
表2 各組大鼠血流動力學(xué)和右心室重構(gòu)指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of hemodynamics and right ventricular remodeling in each group ±s
注:與對照組比較,aP <0.05;與模型組比較,bP <0.05;與葛根素組比較,cP <0.05;與法舒地爾組比較,dP <0.05
組別對照組模型葛根素組法舒地爾組聯(lián)合治療組RVSP(mmHg)16.89±0.85 39.45±1.25a 28.21±2.01b 31.12±0.85b 21.15±1.24bcd mPAP(mmHg)14.52±1.05 33.28±0.87a 27.68±0.92b 26.52±1.25b 20.94±2.07bcd PASP(mmHg)18.85±2.84 46.58±4.18a 38.94±3.05b 36.72±1.87b 26.84±0.92bcd PAWP(mmHg)13.37±0.82 28.64±2.35a 25.54±1.58b 26.37±1.40b 18.82±0.91bcd RVHI(%)21.47±1.24 45.42±1.22a 39.85±0.91b 36.17±1.05b 28.62±2.41bcd
圖1 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠肺動脈血管壁的影響Fig.1 Effect of fasudil combined with puerarin on pulmonary artery wall in HPH rats
2.3 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠TGF?β1/Smads 通路的影響見圖2,與模型組、葛根素組和法舒地爾組相比較,聯(lián)合治療組TGF?β1、Smad2、Smad4 和Smad7 蛋白的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。
圖2 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠TGF?β1/Smad2/Smad4/Smad7 的影響Fig.2 Effects of fasudil combined with puerarin on TGF? β1/Smad2/Smad4/Smad7 in HPH rats
2.4 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠炎癥因子的影響見圖3,與模型組、葛根素組和法舒地爾組相比較,聯(lián)合治療組iNOS、COX?2、IL?6 和HIF?1α mRNA 的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。
2.5 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠Gal?3 的影響見圖4,與模型組、葛根素組和法舒地爾組相比較,聯(lián)合治療組Gal?3 蛋白的表達(dá)量顯著下降(P<0.01)。
圖3 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠iNOS/COX?2/IL?6/HIF?1α mRNA 的影響Fig.3 Effects of fasudil combined with puerarin on iNOS/COX?2/IL?6/HIF?1α mRNA in HPH rats
圖4 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠Gal?3 蛋白的影響Fig.4 Effects of fasudil combined with puerarin on Gal?3 protein in HPH rats
本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比,模型組右心室收縮壓和右心肥厚指數(shù)顯著升高,且肺動脈血管壁明顯增厚、平滑肌增生、管腔變狹窄、細(xì)胞核增多、血管周圍出現(xiàn)炎性浸潤等,說明缺氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓會改變心臟右心室壓力,加重右心室負(fù)荷[12-13]的同時,導(dǎo)致肺循環(huán)阻力增大[14],這與AGARWAL等[15]的研究結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)與模型組、葛根素組和法舒地爾組相比較,聯(lián)合治療組HPH大鼠RVSP、mPAP、PASP、PAWP、PVHI 和Gal?3 蛋白的表達(dá)量下降、脈血管壁厚度下降、管腔變小、細(xì)胞形態(tài)趨于正常、血管周圍炎性浸潤程度下降,提示法舒地爾聯(lián)合葛根素對大鼠缺氧誘導(dǎo)的肺血管損傷具有很好的修護(hù)作用,且效果優(yōu)于法舒地爾和葛根素單獨治療。Gal?3 的相對表達(dá)量能夠預(yù)測心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險及治療效果[16],其高表達(dá)能夠增加平滑肌細(xì)胞的非自然增值和存活[17]。
進(jìn)一步檢測了炎癥相關(guān)因子的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)模型組炎癥相關(guān)因子iNOS、COX?2、IL?6 和HIF?1α mRNA 等炎癥因子的相對表達(dá)量顯著升高,而聯(lián)合治療組炎癥因子的相對表達(dá)量顯著下降,提示模型組大鼠為了保護(hù)機(jī)體免受低氧誘導(dǎo)肺動脈高壓的損傷炎性因子水平迅速上升[18],而法舒地爾聯(lián)合葛根素具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用,保護(hù)肺血管免受缺氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓的損傷[19]。本研究檢測了TGF?β1/Smads 通路相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示聯(lián)合治療組TGF?β1/Smads 通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量下降。缺氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓可激活TGF?β1,激活的TGF?β1 首先與受體結(jié)合使其活化,受體活化后激活絲/蘇氨酸激酶從而磷酸化其下游信號蛋白Smad2[20],磷酸化的Smad2 與Smad4 結(jié)合形成異二聚體,轉(zhuǎn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),即Smad2 與Smad4 復(fù)合物的形成及核轉(zhuǎn)位是該通路活化的標(biāo)志[21-22]。受體激活性Smad 被激活以后,相對應(yīng)的靶基因的產(chǎn)物開始調(diào)控抑制性Smad7 的表達(dá),構(gòu)成負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路從而抑制Smad 通路信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),即Smad7 表達(dá)的上調(diào)也是該通路活化的標(biāo)志[23]。以上提示,缺氧誘導(dǎo)肺動脈高壓促進(jìn)TGF?β1/Smads 通路活化來增大肺血管損傷程度,而法舒地爾聯(lián)合葛根素通過促進(jìn)TGF?β1/Smads 通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)來保護(hù)缺氧性肺血管損傷。
綜上所述,缺氧性肺動脈高壓可促使肺血管重建、導(dǎo)致肺損傷,法舒地爾聯(lián)合葛根素能保護(hù)肺動脈血管緩解缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓引起一系列肺血管收縮失常、重建及肺血管壁病理變化,并通過調(diào)節(jié)TGF?β1/Smads 信號通路和緩解炎癥反應(yīng)來保護(hù)機(jī)體減輕損傷,為缺氧性肺動脈高壓的臨床治療提供參考。