2種類型膜莢黃芪主要藥效成分含量及關(guān)鍵酶基因表達(dá)量差異研究

姚萱航，劉翠晶，常晶茹，張雪薇，劉 霞

2種類型膜莢黃芪主要藥效成分含量及關(guān)鍵酶基因表達(dá)量差異研究

姚萱航，劉翠晶，常晶茹，張雪薇，劉 霞*

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院 省部共建生態(tài)恢復(fù)與生態(tài)系統(tǒng)管理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130118

以2年生2種類型膜莢黃芪（綠莖有毛膜莢黃芪、紫莖有毛膜莢黃芪）根、莖、葉為實(shí)驗(yàn)材料，探究其主要藥效成分含量及其生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的差異，為藥材膜莢黃芪資源合理利用及其優(yōu)良品種選育選育提供科學(xué)的理論參考。使用HPLC檢測膜莢黃芪根、莖、葉中黃芪甲苷與毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，使用紫外分光光度計檢測膜莢黃芪根、莖、葉中總皂苷含量，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測其根中皂苷生物合成過程中關(guān)鍵酶乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶（AATC）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（HMGS）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）、異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶（IDI）、法尼基焦磷酸合酶（FPS）、鯊烯合酶（SS）、鯊烯環(huán)氧酶（SE）、環(huán)阿爾庭烷合酶（CAS）基因的表達(dá)量。紫莖膜莢黃芪根中黃芪甲苷含量始終高于綠莖膜莢黃芪；在生殖生長期時，綠莖膜莢黃芪根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量高于紫莖膜莢黃芪，而枯萎期二者變化浮動較大；綠莖膜莢黃芪根中總皂苷含量普遍高于紫莖膜莢黃芪。、、基因表達(dá)量與綠莖膜莢黃芪總皂苷含量呈顯著相關(guān)（<0.05），基因表達(dá)量與總皂苷含量呈極顯著相關(guān)（＜0.01），說明這4個基因在綠莖膜莢黃芪總皂苷合成中具有重要影響；基因與紫莖膜莢黃芪總皂苷呈顯著相關(guān)（＜0.05），其他基因與紫莖膜莢黃芪皂苷含量均有相關(guān)性，但未達(dá)到顯著水平。探究了2種類型黃芪3種主要藥效成分的動態(tài)變化和皂苷類化合物關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，為黃芪皂苷類化合物合成生理生態(tài)機(jī)制的明晰、膜莢黃芪資源合理利用及優(yōu)良品種選育提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

膜莢黃芪；黃芪甲苷；總皂苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；關(guān)鍵酶基因

黃芪為豆科多年生草本植物膜莢黃芪(Fisch.) Bunge.或蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的干燥根[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，用藥歷史已2000多年，為我國傳統(tǒng)大宗中藥材之一?！吨袊幍洹?015年版中規(guī)定以黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量作為黃芪藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中，按干燥品計算，含黃芪甲苷不得少于0.040%、含毛蕊異黃酮葡萄糖苷不得少于0.020%。

近幾十年，隨著人民生活水平的改善和醫(yī)療保健水平的提高，黃芪藥材市場需求量持續(xù)增加，主流品種為膜莢黃芪和蒙古黃芪兩種商品規(guī)格，其中約有50%用于生產(chǎn)黃芪飲片，近50%用于中成藥和提取物及制劑[2]，由于黃芪用量很大，加之野生資源的枯竭及再生能力的下降，我國北方多省均有人工引種[3]。在長期的栽培過程中，受生態(tài)環(huán)境、種子混雜、質(zhì)量參差不齊以及栽培技術(shù)不完善等因素的影響，使人工栽培的膜莢黃芪群體中出現(xiàn)了豐富的形態(tài)多樣性，具有不同的種內(nèi)類型[4]，主要為莖稈顏色呈綠色的綠莖膜莢黃芪和莖稈顏色呈紫色的紫莖膜莢黃芪2種。

黃芪中主要含有皂苷類、黃酮類、多糖類、氨基酸類等活性成分，黃芪皂苷類成分具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、合成抗體、強(qiáng)心、抗心力衰竭、抗炎、抑制膠原合成等作用；黃酮類成分能夠增強(qiáng)心肌收縮力，對細(xì)胞免疫功能具有促進(jìn)作用，黃芪多糖有明顯的抗疲勞、抗腫瘤作用；據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，黃芪中含有一種微量元素硒能提高谷胱甘肽過氧化物酶活性，激活解毒酶系，從而對肝細(xì)胞起保護(hù)作用[5-7]。

遺傳因素對中藥材質(zhì)量的形成具有重要作用，目前已有研究發(fā)現(xiàn)黃芪皂苷的合成通路及其合成過程中的關(guān)鍵酶基因，甲羥戊酸途徑是藥用植物黃芪黃芪皂苷類次生代謝產(chǎn)物主要合成途徑[8-9]，關(guān)鍵酶基因主要包括：乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶（acetoacetyl-co zyme A (CoA) thiolase，AACT）；3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（HMG-CoA synthase，HMGS）；3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase，HMGR）；異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶（iso-pentenyl diphosphate isomerase，IDI）；法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PS）；鯊烯合酶（squalene synthase，SS）；鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）；環(huán)阿爾庭烷合酶（cycloartenol synthase，CAS）等。皂苷合成過程中，AACT、HMGR直接催化生成甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）；SS、SE催化形成2,3-氧化角鯊烯，導(dǎo)致三萜骨架環(huán)化；CAS催化2,3-氧化角鯊烯導(dǎo)致環(huán)化反應(yīng)形成，這些酶基因均為黃芪皂苷合成過程中重要的限速酶[10-11]。

本研究以2年生2種類型膜莢黃芪為實(shí)驗(yàn)材料，測定了不同時期膜莢黃芪樣品的黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和總皂苷含量及其皂苷生物合成8種關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量的動態(tài)變化，并將2種類型膜莢黃芪皂苷含量與關(guān)鍵酶基因表達(dá)量進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析，以期確定2種類型膜莢黃芪的質(zhì)量差異及原因，為膜莢黃芪優(yōu)良品種選育及其藥用資源合理利用提供科學(xué)的理論依據(jù)和參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為二年生膜莢黃芪（綠莖有毛型、紫莖有毛型），樣品于2017-09-06～2017-10-11在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物園采集，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)劉霞副教授鑒定為豆科黃芪屬膜莢黃芪(Fisch.) Bunge.。樣地地理位置東經(jīng)125°24'59''，北緯43°48'24''，海拔高度251 m。百泰克植物多糖多酚總RNA提取試劑盒，百泰克反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百泰克生物有限公司），SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ試劑盒（DRR081A，日本TaKaRa有限公司），黃芪甲苷對照品（批號20633-67-5）購于上海源葉生物科技有限公司，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號20633-67-4）購于北京索萊寶公司，乙腈，甲醇為色譜純，乙醇、冰醋酸、香草醛、高氯酸以及其他試劑均為分析純，蒸餾水。

1.2 儀器

AUY220電子天平；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱；DL-820E智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；Agilent1260高效液相色譜儀（Agilent，美國）；依利特ODS柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；ProFlex?梯度PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystems，美國）；Mx3000P實(shí)時熒光定量PCR儀（Agilent，美國）；NanoDrop 2000核酸/蛋白定量儀（Thermo，美國）；DYY-8C型電泳儀（北京六一電泳廠）；Tanon Gis-2010凝膠成像系統(tǒng)［天能科技（上海）有限公司］；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；高速離心機(jī)（美國Thermo公司），高速萬能打粉機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

2 方法

2.1 樣品的采集與處理

膜莢黃芪樣品于2017年9月6日～2017年10月11日采集自吉林省長春市吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物園，采用五點(diǎn)采樣法每5天取樣1次，采集膜莢黃芪樣品，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，冷凍保存部分樣品。將剩余樣品烘干至恒定質(zhì)量，粉碎過100目篩，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 膜莢黃芪黃芪甲苷含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備 精確稱量2種類型的膜莢黃芪樣品1.00 g，加入15 mL甲醇超聲提取30 min，提取3次，合并濾液，用蒸發(fā)皿在水浴鍋中65 ℃下蒸發(fā)溶劑，加入甲醇溶解，隨后將提取物離心，定容至1 mL，選擇0.22 μm 微孔濾膜濾過上清液，即得供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 精確稱量黃芪甲苷對照品2.53 mg置于10 mL量瓶中，加少量甲醇溶解，定容，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.3 色譜條件[12]Agilent 1260型高效液相色譜儀UV檢測器；色譜柱：依利特Hypersil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；洗脫條件：等度洗脫；流動相：乙腈-水=38:62；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長203 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測時間30 min。色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)和供試品(B) 溶液的高效液相色譜圖

2.2.4 線性方程的繪制 以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），根據(jù)文獻(xiàn)報道方法[13]繪制線性方程＝447.1－1.010 5，2＝0.995，計算黃芪甲苷含量。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 吸取黃芪甲苷對照品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，計算黃芪甲苷峰面積的RSD值為1.64%，說明實(shí)驗(yàn)儀器的精密度較好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份藥材樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，在室溫下分別于 0、2、4、6、8、12、24 h內(nèi)進(jìn)行測定，以峰面積為指標(biāo)計算黃芪甲苷的RSD值為1.37%，說明供試品溶液能在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取黃芪粉1.0g，按照“2.2.1”項(xiàng)平行制備6份供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，計算黃芪甲苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值為1.82%，說明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批黃芪樣品6份，每份樣品1.0 g，加入黃芪甲苷對照品甲醇溶液1 mL，室溫?fù)]干，按照“2.2.1”項(xiàng)制備供試品溶液，測定，加樣回收率為98.8%，RSD值小于3%。

2.3 膜莢黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定

2.3.1 供試品溶液的制備 以“2.2.1”項(xiàng)中提取的濾液為供試品。

2.3.2 對照品溶液的制備 精確稱量毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品2.21 mg，置于10 mL量瓶中，加少量甲醇溶解，定容，搖勻，即得對照品溶液。

2.3.3 色譜條件 Agilent 1260型高效液相色譜儀UV檢測器；色譜柱：安捷倫C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；梯度洗脫，0～20 min，20%～40%乙腈；20～30 min，40%乙腈；流動相為乙腈-0.2%甲酸溶液；體積流量1.0 mL/min；檢測波長260 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL，檢測時間30 min。色譜圖見圖2。

圖2 對照品 (A) 和供試品(B) 溶液的高效液相色譜圖

2.3.4 線性方程的繪制 以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制線性方程：＝25.735－3.297 2，2＝0.999 2，計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD值為1.33%，說明實(shí)驗(yàn)儀器的精密度較好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份藥材樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，在室溫下分別于 0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)行測定，以峰面積為指標(biāo)計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷的RSD值為1.84%，說明供試品溶液能在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取黃芪粉1.0 g，按照“2.2.1”平行制備6份供試品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，以峰面積為指標(biāo)計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷的RSD值為1.75%，說明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取同一批黃芪樣品6份，每份樣品1.0 g，加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液1 mL，室溫?fù)]干，按照“2.2.1”項(xiàng)制備供試品溶液，測定，加樣回收率為99.5%，RSD值小于3%。

2.4 總皂苷含量測定

2.4.1 供試品溶液的制備 精確稱量2種類型的膜莢黃芪樣品1.00 g，加入15 mL 80%乙醇超聲提取30 min，提取3次，合并濾液。用蒸發(fā)皿在水浴鍋中65℃下蒸發(fā)溶劑，加入80%甲醇溶解，隨后將提取物離心，揮干溶液，定容至5 mL，即得供試品溶液。

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷對照品5 mg，置于10 mL量瓶中，加少量甲醇溶解，定容，搖勻，即得對照品溶液。

2.4.3 測定波長的選擇 取對照品溶液、供試品溶液適量，加入5%香草醛-冰醋酸試液0.2 mL，高氯酸溶液0.8 mL，充分振搖混勻后置于60 ℃恒溫水浴上加熱20 min，立即用冰水冷卻至室溫，再加入5 mL冰醋酸溶液，搖勻。以試劑作空白，采用紫外分光光度法在200～700 nm進(jìn)行掃描，于570 nm波長處有最大吸收。

2.4.4 線性方程的繪制 以吸光度為縱坐標(biāo)（）、濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：＝17.846 4＋0.104 38，2＝0.999 7，計算總皂苷含量。

2.5 膜莢黃芪根組織總RNA的提取

將保存在?80 ℃的膜莢黃芪根組織樣品在液氮中充分研磨至粉末狀，利用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，研磨樣品約30 min，在研磨過程中，注意試驗(yàn)環(huán)境的衛(wèi)生狀況以免樣品感染，最好選擇在冰上操作，以加大提取總RNA試驗(yàn)的成功率。利用NanoDrop2000檢測儀測定膜莢黃芪根、莖、葉組織中RNA濃度，并對提取得到的總RNA進(jìn)行完整性檢測。選用 M-MuLV第1鏈cDNA合成試劑盒，按試劑盒中提供的操作步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布的AATC、 HMGS、HMGR、IDI、FPS、SS、SE、CAS，以18S RNA為內(nèi)參基因，合成引物（上海生物工程技術(shù)有限公司），引物序列見表1。

2.7 關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的測定

膜莢黃芪組織的cDNA為模板，18S RNA為內(nèi)參基因，根據(jù)表1中各基因的引物序列，分別對、、、、、、和基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，重復(fù)3次，采用2?ΔΔCt法分析結(jié)果。生物合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)量以膜莢黃芪根中表達(dá)量為參照。PCR反應(yīng)體系為：滅菌水7.4 μL，SYBR? Premix Ex TaqTM 10 μL，正反引物各0.8 μL，cDNA模板1.0 μL，共20 μL的反應(yīng)體系。RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，反應(yīng)40個循環(huán)。

表1 基因序列引物

2.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS和GraphPad Prism6等軟件進(jìn)行處理

3 結(jié)果與分析

3.1 2種類型膜莢黃芪黃芪甲苷含量

2種類型膜莢黃芪根、莖、葉黃芪甲苷含量見圖3。圖3-A為綠莖膜莢黃芪根、莖、葉中黃芪甲苷含量，與其他部位相比，黃芪甲苷在根中含量最高，莖、葉次之，在9月21日綠莖膜莢黃芪根、莖中黃芪甲苷含量最高，分別為0.19%、0.11%，9月11日葉中黃芪甲苷含量最高為0.07%。圖3-B為紫莖膜莢黃芪根、莖、葉中黃芪甲苷含量，在不同部位中黃芪甲苷含量表現(xiàn)為：根＞葉＞莖，在9月21日根、葉中黃芪甲苷含量最高，分別為0.27%、0.13%，10月11日莖中黃芪甲苷含量最高為0.07%。圖3-C為2種類型膜莢黃芪根中黃芪甲苷含量，除9月26日與10月1日外，10月11日2種類型膜莢黃芪根中黃芪甲苷含量差異顯著（＜0.05），其余皆表現(xiàn)為兩種類型膜莢黃芪黃芪甲苷含量差異極顯著（＜0.01），9月16日黃芪甲苷含量差值最大，紫莖膜莢黃芪黃芪甲苷含量最高為綠莖膜莢黃芪的2.3倍。圖3-D為2種類型膜莢黃芪莖中黃芪甲苷含量，10月11日2種類型膜莢黃芪莖中黃芪甲苷含量差異顯著（＜0.05），9月6日、9月21日、9月26日莖中黃芪甲苷含量差異極顯著（＜0.01），9月21日莖中黃芪甲苷含量差異最大，綠莖膜莢黃芪莖中黃芪甲苷含量最高為紫莖膜莢黃芪的2.9倍。圖3-E為2種類型膜莢黃芪葉中黃芪甲苷含量，9月6日、9月16日、10月6日兩者葉中黃芪甲苷含量表現(xiàn)為：差異顯著（＜0.05），9月21日表現(xiàn)為差異極顯著（＜0.01），紫莖膜莢黃芪葉中黃芪甲苷含量最高為綠莖膜莢黃芪的3.02倍。

3.2 2種類型膜莢黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

2種類型膜莢黃芪根、莖及葉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量見圖4。圖4-A為綠莖膜莢黃芪根、莖、葉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，與其他部位相比，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在根中含量最高，莖中最少，葉次之，9月21日綠莖膜莢黃芪根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高為0.25%，10月11日莖中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高為0.07%，9月6日葉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高為0.13%。圖4-B為紫莖膜莢黃芪根、莖、葉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，在不同部位中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量大致表現(xiàn)為根＞葉＞莖，9月21日根、莖中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高，分別為0.14%、0.07%，10月6日葉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高為0.15%。圖4-C為2種類型膜莢黃芪根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，除9月6日、10月1日、10月11日外，其余皆表現(xiàn)為2種類型膜莢黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量差異極顯著（＜0.01），10月6日毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量差值最大，綠莖膜莢黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高為紫莖膜莢黃芪的2.3倍。圖4-D為2種類型膜莢黃芪莖中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，除10月6日外，其余皆表現(xiàn)為毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量差異極顯著（＜0.01），9月21日莖中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量差異最大，紫莖膜莢黃芪莖中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高為綠莖膜莢黃芪的1.7倍。圖4-E為2種類型膜莢黃芪葉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，除9月16日外，9月26日兩者葉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量表現(xiàn)為：差異顯著（＜0.05），其余皆表現(xiàn)為差異極顯著（＜0.01），紫莖膜莢黃芪葉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高為綠莖膜莢黃芪的2.3倍。

1-9月6日 2-9月11日 3-9月16日 4-9月21日 5-9月26日 6-10月1日 7-10月6日 8-10月11日 不同小寫字母表示基因表達(dá)量差異顯著（P＜0.05）；*相關(guān)性顯著（P＜0.05）；**相關(guān)性極顯著（P＜0.01），下同

3.3 2種類型膜莢黃芪總皂苷含量

2種類型膜莢黃芪根、莖及葉中總皂苷含量見圖5。圖5-A為綠莖膜莢黃芪根、莖、葉中總皂苷含量，結(jié)果表明：生殖生長期時綠莖膜莢黃芪總皂苷含量葉＞根＞莖，枯萎期總皂苷含量表現(xiàn)為根＞葉＞莖。圖5-B為紫莖膜莢黃芪根、莖、葉中總皂苷含量，在不同部位中總皂苷含量表現(xiàn)為：生殖生長期時莖中總皂苷含量較高，枯萎期時根中總皂苷含量較高。圖5-C為2種類型膜莢黃芪根中總皂苷含量，除10月1日與10月11日外，9月16日、9月26日2種類型膜莢黃芪根中總皂苷含量差異顯著（＜0.05），其余皆表現(xiàn)為兩種類型膜莢黃芪總皂苷含量差異極顯著（＜0.01），10月6日總皂苷含量差值最大，綠莖膜莢黃芪總皂苷含量最高為紫莖膜莢黃芪的4.2倍。圖5-D為2種類型膜莢黃芪莖中總皂苷含量，10月6日、10月11日兩種類型膜莢黃芪莖中總皂苷含量差異顯著（＜0.05），9月21日、9月26日莖中總皂苷含量差異極顯著（＜0.01），9月21日莖中總皂苷含量差異最大，紫莖膜莢黃芪莖中總皂苷含量最高為綠莖膜莢黃芪的2.6倍。圖5-E為2種類型膜莢黃芪葉中總皂苷含量，除9月26日外，9月21日、10月1日兩者葉中總皂苷含量表現(xiàn)為差異顯著（＜0.05），其余表現(xiàn)為差異極顯著（＜0.01），9月11日兩者差異最大，綠莖膜莢黃芪葉中總皂苷含量最高為紫莖膜莢黃芪的3.5倍。

3.4 2種類型膜莢黃芪皂苷合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量

2種類型膜莢黃芪皂苷合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量見圖6。在綠莖膜莢黃芪與紫莖膜莢黃芪根中，基因在生殖生長期均有較高的表達(dá)，而在枯萎期，基因表達(dá)量降低；綠莖膜莢黃芪根中S基因表達(dá)呈變化趨勢，而基因在9月16日紫莖黃芪根中表達(dá)量急劇升高，顯著高于該基因在各個時間段的綠莖與紫莖膜莢黃芪根中的表達(dá)量；基因在兩種類型膜莢黃芪生殖生長期均有較高的表達(dá)量，后期表達(dá)量不高的特點(diǎn)?；蛟?種類型膜莢黃芪根中表達(dá)量基本一致，無明顯差異；基因與基因在紫莖膜莢黃芪根中表達(dá)量普遍高于綠莖膜莢黃芪。

圖4 2種類型膜莢黃芪根、莖、葉毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

圖5 2種類型膜莢黃芪根、莖、葉總皂苷含量

3.5 綠莖膜莢黃芪根部皂苷含量與關(guān)鍵酶基因表達(dá)量相關(guān)性分析

使用SPSS 19.0對綠莖膜莢黃芪根部皂苷含量與關(guān)鍵酶基因表達(dá)量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，見表2，結(jié)果表明與總皂苷呈顯著相關(guān)（＜0.05），與總皂苷呈極顯著相關(guān)（＜0.01），說明這4個基因在綠莖膜莢黃芪總皂苷合成中有重要作用。以上4個基因均對綠莖膜莢黃芪總皂苷含量表現(xiàn)出顯著相關(guān)性，它們在皂苷合成途徑中的作用機(jī)制值得繼續(xù)深入研究，其他基因?qū)G莖膜莢黃芪皂苷含量沒有表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，可能是因?yàn)樗鼈儠r空表達(dá)模式受到自身轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子或者外部環(huán)境變化的影響，雖然在黃芪皂苷合成途徑中有一定作用，但未表現(xiàn)出明顯相關(guān)性。說明黃芪皂苷的生物合成是復(fù)雜多變的，其分子機(jī)制亟待闡明。

圖6 2種類型膜莢黃芪根中關(guān)鍵酶基因熒光定量PCR表達(dá)分析

表2 綠莖膜莢黃芪皂苷含量與關(guān)鍵酶基因的相關(guān)性

*相關(guān)性達(dá)到顯著水平，＜0.05，**相關(guān)性達(dá)到極顯著水平，＜0.01，下同

*correlation reached significant level (＜0.05), while ** correlation reached extremely significant level (＜0.01), same as below

3.6 紫莖膜莢黃芪皂苷含量與關(guān)鍵酶基因表達(dá)量相關(guān)性分析

使用SPSS 19.0對紫莖膜莢黃芪根部皂苷含量與關(guān)鍵酶基因表達(dá)量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，見表3，結(jié)果表明與總皂苷呈顯著相關(guān)（＜0.05），其他基因與紫莖膜莢黃芪皂苷含量均有相關(guān)性，但未達(dá)到顯著水平。說明這些基因在紫莖膜莢黃芪皂苷合成過程中均有一定的作用，其作用過程復(fù)雜，有待進(jìn)一步深入研究。

表3 紫莖膜莢黃芪皂苷含量與關(guān)鍵酶基因的相關(guān)性

4 討論

黃芪屬藥食兼用資源種，用途廣泛、需求量大，由于生態(tài)環(huán)境的破壞和人類無節(jié)制的采挖，導(dǎo)致野生膜莢黃芪資源急劇減少，因此，用栽培品代替野生資源成為黃芪市場的趨勢[14]，選育高品質(zhì)、高質(zhì)量的栽培黃芪具有十分重要的意義。在人工栽培的膜莢黃芪群體中，出現(xiàn)許多外觀形態(tài)不一的新類型，這為膜莢黃芪種內(nèi)高品質(zhì)類型的選育提供豐富的基礎(chǔ)資料[15]。本實(shí)驗(yàn)選取2年生栽培不同類型膜莢黃芪，通過對其不同部位黃芪甲苷含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量、總皂苷含量以及根組織中皂苷合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的測定，探究了不同類型膜莢黃芪中主要有效成分含量差異，在分子層面上分析皂苷合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量與膜莢黃芪黃芪甲苷及總皂苷含量之間的關(guān)系，為高質(zhì)量栽培黃芪的選育提供理論依據(jù)。

藥用植物的主要活性成分一般為次生代謝產(chǎn)物，其成分類型和含量是衡量中藥材質(zhì)量的重要標(biāo)志[16]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，紫莖膜莢黃芪根中黃芪甲苷含量始終高于綠莖膜莢黃芪；在生殖生長期時，綠莖膜莢黃芪根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量高于紫莖膜莢黃芪，而枯萎期二者變化浮動較大；綠莖膜莢黃芪根中總皂苷含量基本高于紫莖膜莢黃芪。由研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同類型膜莢黃芪中主要有效成分含量確有不同，此結(jié)果與王雅瑩等[15]的研究結(jié)果一致。

黃芪皂苷合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)調(diào)控了黃芪皂苷體內(nèi)生物合成的流向，對其合成有著重要的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在9月11日時紫莖與綠莖膜莢黃芪中的表達(dá)量均極顯著高于其他時期，但與此同時紫莖與綠莖膜莢黃芪中的皂苷含量較低，說明黃芪皂苷的生物合成是復(fù)雜的，其分子機(jī)制亟待闡明，同時也可能與土壤、光照、水分等生態(tài)因子的參與有關(guān)，有待進(jìn)一步研究[17-18]。本實(shí)驗(yàn)通過比較不同類型膜莢黃芪皂苷類成分與其合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，綠莖膜莢黃芪總皂苷生物合成途徑中，基因、基因及基因?qū)傇碥蘸铣删哂兄匾绊?；紫莖膜莢黃芪總皂苷的生物合成途徑中，基因起到重要作用，這為后續(xù)深入研究關(guān)鍵酶在植物體的作用機(jī)制及相關(guān)基因調(diào)控提供一定的理論參考，實(shí)現(xiàn)對黃芪藥材質(zhì)量向更優(yōu)質(zhì)方向的調(diào)控。

本研究系統(tǒng)地從主要有效成分及皂苷合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)對不同類型膜莢黃芪的品質(zhì)進(jìn)行了初步探索，為膜莢黃芪藥材種內(nèi)高品質(zhì)類型的選育提供科學(xué)依據(jù)，對中藥材品質(zhì)評價研究具有示范性意義，同時豐富發(fā)展了中藥品質(zhì)研究內(nèi)涵，對于確保臨床用藥安全有效有重要意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on content of main active components and expression of key enzyme genes in two types of

YAO Xuan-hang, LIU Cui-jing, CHANG Jing-ru, ZHANG Xue-wei, LIU-xia

State Key Laboratory of Ecological Restoration and Ecosystem Management, College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China

To explore the differences of the main effective components and the expression of key enzyme genes in the biosynthesis pathway of two types of(with green stem,with purple stem) roots, stems, and leaves, so as to provide a scientific theoretical reference for the rational utilization of resources ofand the selection of its excellent varieties.The contents of astragaloside A and genistein glucoside in the roots, stems, and leaves ofwere detected by HPLC, the contents of total saponins in the roots, stems and leaves ofwere detected by UV spectrophotometer, and the expression of key enzyme genes (AATC, HMGR, CAS, FPS, HMGs, IDI, SE, and SS) in the process of saponin biosynthesis in the roots ofwas detected by real-time fluorescence quantitative PCR.The content of astragaloside inwith purple stem root was always higher than that inwith green stem. During reproductive growth, the content of isoflavone glucoside inwith green stem root was higher than that inwith purple stem root, but the fluctuation of them was larger in wilting stage. The content of total saponin inwith green stem root was generally higher than that inwith purple stem.,, andgene expression were significantly correlated with the content of total saponins ofwith green stem (< 0.05),gene expression was significantly correlated with the content of total saponins (< 0.01), indicating that these four genes had an important influence on the synthesis of total saponins ofwith green stem;gene was significantly correlated with the content of total saponins ofwith purple stem (< 0.05), and other genes were significantly correlated with the content ofwith purple stem. The content of saponins was correlated, but did not reach the significant level.The dynamic changes of three main active components of two types ofand the expression of key enzyme genes ofsaponins were studied, which provided scientific theoretical basis for the clear physiological and ecological mechanism ofsaponins synthesis, the rational utilization ofresources and the selection of excellent varieties.

(Fisch.) Bge; astragaloside IV; total saponins; isoflavone glucoside; key enzyme genes

R286.12

A

0253 - 2670(2021)07 - 2072 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.024

2020-08-03

吉林省科技發(fā)展計劃項(xiàng)目（20160307001YY）

姚萱航（1994—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)學(xué)。E-mail: 724020462@qq.com

劉 霞（1965—），女，博士，副教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與栽培。E-mail: liuxia651015@163.com

[責(zé)任編輯 時圣明]