甘草苷體內(nèi)暴露特征及體外跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究

張愛(ài)杰，李 偲，劉羽康，張英華，谷偉玲，董世奇*，樊慧蓉*，谷 元，司端運(yùn)

甘草苷體內(nèi)暴露特征及體外跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究

張愛(ài)杰1, 2，李 偲3，劉羽康3，張英華4，谷偉玲4，董世奇1, 2*，樊慧蓉1, 2*，谷 元5，司端運(yùn)5

1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津 300192 2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院創(chuàng)新藥物放射性藥代研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192 3. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617 4. 吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 132012 5. 天津藥物研究院，天津 300462

總甘草素是甘草苷在體內(nèi)的主要暴露形式，對(duì)兩者在大鼠體內(nèi)暴露特征及體外跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行研究，為以甘草苷單體為新藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。采用LC-MS/MS分析方法測(cè)定大鼠給藥后不同時(shí)間點(diǎn)血漿樣品中的總甘草素濃度，并應(yīng)用WinNonlin.6.3軟件采用非房室模型的統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)；同時(shí)測(cè)定大鼠ig給藥后組織勻漿中的濃度，考察不同類型甘草素在各組織中的暴露特征；應(yīng)用體外MDCK-MDR1細(xì)胞模型，研究甘草苷、甘草素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力及其機(jī)制。ig給藥后在大鼠體內(nèi)，甘草苷不呈線性動(dòng)力學(xué)特征；血漿和大部分組織中主要以甘草素的II相結(jié)合產(chǎn)物存在，肝、子宮、卵巢、胃和腸組織中主要為游離甘草素；總甘草素暴露量排序?yàn)槟c＞血漿＞肝＞腎＞肺＞胃＞子宮＞卵巢＞脂肪＞心＞脾＞肌肉＞睪丸，且不易產(chǎn)生組織蓄積現(xiàn)象；甘草素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力較甘草苷良好，且均不是P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物。甘草苷不呈線性動(dòng)力學(xué)吸收特征；甘草素在組織中暴露特征表現(xiàn)為不同組織中甘草素的存在形式和分布程度差異較大，總甘草素不易產(chǎn)生組織蓄積現(xiàn)象；兩者均為被動(dòng)擴(kuò)散跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式。

甘草苷；甘草素；暴露特征；吸收動(dòng)力學(xué)；組織分布；跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

甘草為豆科植物甘草Fisch.、脹果甘草Bat. 及光果甘草L.的干燥根及根莖；其性味甘平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效[1]。甘草的現(xiàn)代藥理研究顯示其具有抗炎、抗菌、保肝、抗氧化、抗癌、降糖、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[2-3]。甘草的主要活性成分有三萜類、黃酮類、多糖類[4]，具有廣泛的生物活性。目前，甘草屬中分離得到的黃酮類化合物及其衍生物有300多種[5]，具有抗菌、抗病毒、保肝、抗腫瘤等藥理作用。甘草苷是甘草中主要的黃酮類化合物，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠單次ig 30、100 mg/kg甘草苷后具有顯著的抗垂體后葉素誘導(dǎo)的心肌缺血作用，表現(xiàn)為抑制心電圖J點(diǎn)變化。因此，甘草苷擬作為抗心肌缺血Ⅰ類新藥進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究。

通過(guò)藥物代謝和藥動(dòng)學(xué)研究藥物的體內(nèi)處置和動(dòng)力學(xué)過(guò)程，將藥物在血循環(huán)和靶器官的暴露水平與關(guān)鍵的臨床表現(xiàn)（藥效和不良反應(yīng)）相關(guān)聯(lián)，為了解動(dòng)物或人體服用藥物后的生物學(xué)和物理化學(xué)過(guò)程及機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)[6]。已有文獻(xiàn)報(bào)道提示，甘草素是甘草苷在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物之一，甘草苷進(jìn)入體內(nèi)主要是以甘草素的形式被吸收[7-10]。為了確定甘草苷經(jīng)口給藥后在體內(nèi)的主要暴露形式，本研究首先進(jìn)行了一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)合藥效學(xué)的給藥方式和有效劑量，大鼠單次ig給予30 mg/kg甘草苷后大鼠血漿中檢測(cè)到少量甘草苷（最高血藥濃度約為50 ng/mL），而血漿中總甘草素平均最高濃度為（3.166±1.616）μg/mL，研究結(jié)果提示甘草苷原型不是甘草苷胃腸道給藥后在體內(nèi)的主要存在形式[10]，同時(shí)血漿中總甘草素（包括游離甘草素、甘草素硫酸結(jié)合物、甘草素葡萄糖醛酸結(jié)合物）的暴露量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于游離甘草素的暴露量。吸收和分布是藥物進(jìn)入機(jī)體到達(dá)作用部位的重要過(guò)程，藥物吸收的多少及快慢直接影響到藥物在體內(nèi)發(fā)揮的作用[11]。其中藥物的吸收過(guò)程與轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，且甘草有“解百藥毒”的特性[12]，其機(jī)制之一為延緩和減少藥物吸收，目前也有研究表明甘草這一特性與其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能有關(guān)[13]。基于此，本研究以含有葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶的H-2型水解酶，測(cè)定未經(jīng)水解及酶水解后樣品中甘草素的含量表征游離甘草素和總甘草素，定量分析兩者在大鼠體內(nèi)的吸收動(dòng)力學(xué)、組織分布速度和程度及消除特點(diǎn)，總結(jié)歸納暴露特征，從而間接表征甘草苷在大鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化；以甘草苷和甘草素為待測(cè)物分別評(píng)價(jià)其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力、探究跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制等，為甘草苷的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

甘草苷（批號(hào)20121211，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.23%）、甘草素（批號(hào)20120401，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%），吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院；柚皮素（批號(hào)071100023，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.2%），河南天方藥業(yè)有限公司；羧甲基纖維素鈉（分析純）、-甲基-吡咯烷酮（分析純）、甲酸（色譜純）、甲酸銨（分析純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無(wú)水乙醇（分析純），天津市化學(xué)試劑供銷公司；甲醇（色譜純）、冰乙酸（色譜純），天津康科德科技有限公司；β-葡萄糖醛酸酶（Type H-2 From Helix Pomatia，批號(hào)011M7405），SIGMA-ALDRICH公司；磷酸二氫銨（分析純），天津市化學(xué)試劑三廠；肝素鈉注射液（批號(hào)20111006），天津市生物化學(xué)制藥廠；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)NYM1045），美國(guó)Hyclone公司，使用前4 ℃保存；胎牛血清（批號(hào)1227693），美國(guó)Gibco公司，使用前?25 ℃保存；Trypsin-EDTA（批號(hào)1155732），美國(guó)Gibco公司，使用前4 ℃保存；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康Wistar大鼠，雌雄各半，7～10周齡，體質(zhì)量200～300 g。北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，生產(chǎn)單位許可證編號(hào)：SCXK（京）2012-0001，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：No.11400700015112、No.11400700018465。本研究的動(dòng)物使用方案已經(jīng)獲得天津市新藥安全評(píng)價(jià)研究中心IACUC批準(zhǔn)，IACUC號(hào)為2013071901。

1.3 儀器

液相色譜系統(tǒng)（配備LC-20AD型輸液泵、DGU-20A3型脫氣機(jī)、CTO-20A型柱溫箱、SI L-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、CBM-20A系統(tǒng)控制），日本Shimadzu公司；Diamonsil?C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），Dikma科技公司；質(zhì)譜系統(tǒng)（配備API 4000 Q-TRAP質(zhì)譜儀，ESI（電噴霧離子化）離子化源和Analyst 1.5.2分析數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)工作站），美國(guó)Applied Biosystems公司；17R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific公司；Turbo Vap LV型樣品濃縮儀，美國(guó)Caliper公司；700E型全自動(dòng)均質(zhì)器，美國(guó)TOMTEC公司；BM-40型純水制備系統(tǒng)，北京中盛茂源科技發(fā)展有限公司；Eppendorf手動(dòng)單道加樣器，德國(guó)Eppendorf公司；ZHWY-110X50型恒溫水浴震蕩儀，上海智城分析儀器制造有限公司；IMS-40全自動(dòng)雪花制冰機(jī)制冰機(jī)，常熟市雪科電器有限公司；Olympus- CKX41倒置顯微鏡，日本Olympus公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；Millcell ERS-2跨上皮電阻儀，美國(guó)Millipore公司；12孔聚碳酸酯膜轉(zhuǎn)運(yùn)（Transwell?），美國(guó)Corning公司；單人超凈工作臺(tái)及生物安全柜，力康生物醫(yī)療有限科技公司。

2 方法

2.1 LC-MS/MS條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil?C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.5 mmol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸和10%甲醇，B）（52.5∶47.5）；體積流量0.6 mL/min；進(jìn)樣體積為3 μL；運(yùn)行時(shí)間為10 min（5～9.8 min切換進(jìn)入質(zhì)譜）。

2.1.2 質(zhì)譜條件 ESI電噴霧離子源，離子噴霧電壓?3000 V；溫度500 ℃；噴霧氣344.74 kPa（50 psi）；加熱氣551.60 kPa（80 psi）；卷簾氣68.95 kPa（10 psi）；碰撞氣55.16 kPa（8 psi）；負(fù)離子方式檢測(cè)，掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；甘草素碰撞能量為?40 V，內(nèi)標(biāo)物柚皮素碰撞能量為?25 V；甘草素/為255.0～119.0；內(nèi)標(biāo)物柚皮素/為271.0～151.0。

2.2 吸收動(dòng)力學(xué)

2.2.1 給藥溶液的配制 單次ig給藥：準(zhǔn)確稱量甘草苷120、240、480 mg，在乳缽中研磨狀態(tài)下緩緩加入0.5%羧甲基纖維素鈉20 mL，分別制成6、12、24 mg/mL的藥液。iv給藥：準(zhǔn)確稱量甘草苷150 mg，在乳缽中研磨狀態(tài)下緩緩加入2 mL-甲基吡咯烷酮，再加1 mL無(wú)水乙醇，完全溶解后，加入7 mL生理鹽水，混勻，制成15 mg/mL的藥液。

2.2.2 動(dòng)物給藥 單次ig給藥：健康Wistar大鼠18只，體質(zhì)量（245±25）g，雌雄各半，給藥前禁食16 h，實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食與飲水。按30、60、120 mg/kg的劑量單次ig給藥，給藥容積為5 mL/kg，每個(gè)劑量組6只。iv給藥：健康Wistar大鼠6只，雌雄各半，體質(zhì)量（272±40）g，給藥前不禁食，試驗(yàn)期間自由進(jìn)食與飲水。按30 mg/kg的劑量經(jīng)尾iv，給藥容積為2 mL/kg。

2.2.3 血漿樣品的采集 單次ig給藥：?jiǎn)未蝘g給藥后0.167、0.5、1、2、3、4、6、9、12、17、24、30 h，分別自眼眶后靜脈叢采血200 μL，肝素抗凝， 4 ℃，12 000 r/min，離心10 min，分離血漿，分裝于EP試管中，?80 ℃冷凍保存。iv給藥：iv給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、9、12、17、24和30 h，分別自眼眶后靜脈叢采血200 μL，肝素抗凝， 4 ℃，12 000 r/min，離心10 min，分離血漿，分裝于EP試管中，?80 ℃冷凍保存。

2.2.4 血漿樣品處理與分析 精密吸取50 μL大鼠給藥后的血漿樣品，置于已加入10 μL乙酸工作液（0.56 mol/L）的玻璃管中，輕搖混勻，加入25 μL β-葡萄糖醛酸酶溶液（100 U），渦旋30 s混勻，置于37 ℃恒溫水浴1 h；從水浴中取出后，加入內(nèi)標(biāo)柚皮素溶液（2 μg/mL，甲醇配制）50 μL，渦旋30 s混勻，再加入2.5 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，3000 r/min離心10 min（4 ℃）；取上清液2 mL，40 ℃下氮?dú)獯蹈桑?00 μL 50%甲醇水溶液復(fù)溶，12 000 r/min離心5 min（4 ℃），上清進(jìn)樣3 μL，進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.2.5 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算 采用WinNonlin 6.3軟件的非房室模型統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，其中血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0-t、AUC0-∞）采用梯形法計(jì)算，消除半衰期（1/2）采用Best Fit法計(jì)算，5 min時(shí)藥物濃度（5min）、峰濃度（max）、達(dá)峰時(shí)間（max）采用實(shí)測(cè)值。

2.3 組織分布研究

組織分布實(shí)驗(yàn)采用ig給藥方式（與藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)一致），研究甘草苷的分布特征。

2.3.1 給藥溶液的配制 精密稱取甘草苷300 mg，加入0.5% 羧甲基纖維素鈉25 mL研勻至混懸，臨用現(xiàn)配，即得質(zhì)量濃度為12 mg/mL的ig藥液。

2.3.2 動(dòng)物給藥 健康Wistar大鼠18只，雌雄各半，體質(zhì)量180～238 g。進(jìn)行3個(gè)時(shí)間點(diǎn)（2、6、17 h）的組織分布實(shí)驗(yàn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只，雌雄各半。給藥前大鼠禁食16 h，給藥后4 h進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水。按60 mg/kg的劑量ig給藥，給藥容積為5 mL/kg。

2.3.3 生物樣品的采集 分別于給藥后2、6、17 h乙醚吸入麻醉手術(shù)剪斷頸動(dòng)脈取血至肝素化試管中，于10 min內(nèi)置于離心機(jī)中離心（4℃、3000 r/min，離心5 min），分裝于EP試管中，?80℃冷凍保存；取血后乙醚過(guò)量麻醉脫頸處死動(dòng)物，分別剖取腦、肌肉、脂肪、睪丸、卵巢、子宮、肝、脾、腎、肺、心、胃、小腸，純水沖洗，濾紙吸干水分，稱定質(zhì)量，剪刀剪碎，放入EP試管中。將EP試管置于全自動(dòng)勻漿機(jī)中，按照5 mL/g對(duì)應(yīng)體積加入純水進(jìn)行勻漿，將各組織勻漿置于?80℃冷凍保存，待測(cè)。

2.3.4 組織樣品處理與分析 除臟器組織樣品以大鼠各組織勻漿代替血漿外，其他實(shí)驗(yàn)操作同“2.2.4”項(xiàng)。上述處理過(guò)程用于組織樣品中總甘草素濃度的測(cè)定。應(yīng)用于游離甘草素的濃度測(cè)定時(shí)，不加入乙酸工作液和β-葡萄糖醛酸酶進(jìn)行孵育，其余處理過(guò)程與總甘草素的濃度測(cè)定一致。

2.3.5 數(shù)據(jù)處理

（1）組織含量計(jì)算：由LC-MS/MS法測(cè)定并經(jīng)Analyst1.5.2數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算獲得的各組織樣品的質(zhì)量濃度單位為ng/mL，換算成各組織含量（ng/g）需乘以勻漿體積與各組織質(zhì)量的比值（5 mL/g），具體公式如下。

組織含量＝組織勻漿測(cè)定濃度×5

（2）組織暴露量計(jì)算：采用梯形法計(jì)算總甘草素和游離甘草素在各組織中的AUC0-17 h，以考察藥物在各組織中的分布程度。

2.4 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究

2.4.1 無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基-多藥耐藥蛋白1（MDCK-MDR1）細(xì)胞模型的建立 Madin-Darby canine kidney（MDCK）-MDR1細(xì)胞是將人類的MDR1基因轉(zhuǎn)染到MDCK細(xì)胞上產(chǎn)生的[14-15]，多藥耐藥蛋白（MDR1）也稱為P-糖蛋白（P-gp）[16]。MDCK-MDR1細(xì)胞廣泛應(yīng)用于P-gp底物和抑制劑的體外快速篩選研究。該細(xì)胞株由日本富士生物醫(yī)藥研究所友情贈(zèng)送。細(xì)胞培養(yǎng)方法如下[17]：MDCK-mock和MDCK-MDR1細(xì)胞于常規(guī)培養(yǎng)皿內(nèi)，以高糖DMEM培養(yǎng)液（含10% FBS）在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用含0.25% EDTA的胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度至2×105/mL接種于Transwell聚碳酸酯膜12孔板中（膜面積為1.13 cm2）。在頂端側(cè)（AP）每孔加0.5 mL細(xì)胞懸液，基底側(cè)（BL）每孔加1.5 mL新鮮培養(yǎng)基，每天換液，連續(xù)培養(yǎng)6 d，得到完全分化的細(xì)胞單層。

本實(shí)驗(yàn)所用MDCK-mock和MDCK-MDR1細(xì)胞均為25～30代。

2.4.2 MDCK-mock和MDCK-MDR1單層細(xì)胞電阻（TEER）測(cè)定 MDCK-mock和MDCK-MDR1細(xì)胞接種于Transwell膜上培養(yǎng)6 d；將Millcell ERS-2電阻儀的電極放入含有Hank's平衡鹽溶液（HBSS）的燒杯中，預(yù)平衡20 min；移去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，AP側(cè)每孔加預(yù)熱的HBSS 0.5 mL，BL側(cè)每孔加預(yù)熱的HBSS 1.5 mL，37 ℃平衡20 min，洗去細(xì)胞表面的雜質(zhì)；移走HBSS，重新加入預(yù)熱的HBSS，測(cè)定跨膜電阻值；用1個(gè)空白載體重復(fù)上述步驟以獲得空白值。

2.4.3 細(xì)胞單層的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)[17]

（1）AP→BL方向的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)：吸去Transwell小室AP和BL端的培養(yǎng)基，加入37 ℃預(yù)熱的HBSS溶液，37 ℃平衡20 min；吸去HBSS，在AP端加入0.5 mL預(yù)熱的含有甘草苷/甘草素的HBSS溶液，BL端加入1.5 mL空白HBSS溶液；37 ℃恒溫振蕩器培養(yǎng)1.0 h，振蕩器轉(zhuǎn)速為80 r/min；吸取BL端的轉(zhuǎn)運(yùn)液，測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)液中的甘草苷/甘草素濃度。

（2）BL→AP方向的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)：吸去Transwell小室AP和BL端的培養(yǎng)基，加入37 ℃預(yù)熱的HBSS溶液，37 ℃平衡20 min；吸去HBSS，在AP端加入0.5 mL空白HBSS溶液，BL端加入1.5 mL預(yù)熱的含有甘草苷/甘草素的HBSS溶液；37 ℃恒溫振蕩器培養(yǎng)1.0 h，振蕩器轉(zhuǎn)速為80 r/min；吸取AP端的轉(zhuǎn)運(yùn)液，測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)液中的甘草苷/甘草素濃度。

2.4.4 數(shù)據(jù)的處理與分析

（1）TEER的計(jì)算：采用TEER值表征細(xì)胞間緊密連接的完整性，并按照公式計(jì)算。

TEER＝(測(cè)定電阻值－空白值)×單層表面積

（2）表觀滲透系數(shù)（app）的計(jì)算：采用app值的大小表征藥物透過(guò)單層細(xì)胞的能力和藥物吸收的速度以及程度。研究表明藥物在Caco-2細(xì)胞模型的app與藥物人體口服吸收程度相關(guān)性良好，且與藥物在MDCK細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞中的滲透性有良好相關(guān)性。

app＝d/d×1/×1/0

d為藥物在d時(shí)間內(nèi)的透過(guò)量，為膜的表面積，0為初始濃度。

（3）外排率（E）的計(jì)算E值的大小反映藥物外排的能力，通過(guò)E值可以推測(cè)藥物是否為P-糖蛋白的底物。當(dāng)待測(cè)藥物的E≥2時(shí)，表明藥物可能為腸道外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物，當(dāng)E≤0.5時(shí)，表示該藥物可能為腸道攝入型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物，需要做進(jìn)一步研究。

E＝app(BL－AP)/app(AP－BL)

3 結(jié)果

3.1 吸收動(dòng)力學(xué)

3.1.1 大鼠單次ig給藥的血漿總甘草素濃度-時(shí)間曲線 大鼠ig給藥后，3個(gè)劑量組動(dòng)物不同時(shí)間平均血漿總甘草素濃度-時(shí)間曲線比較見(jiàn)圖1。

3.1.2 大鼠iv給藥的血漿總甘草素濃度-時(shí)間數(shù)據(jù) 在30 mg/kg劑量下大鼠ig與iv給予甘草苷后，不同時(shí)間相應(yīng)的平均血漿總甘草素濃度-時(shí)間曲線比較見(jiàn)圖2。

3.1.3 大鼠單次ig、iv后血漿總甘草素藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較 大鼠單次ig、iv后血漿總甘草素藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。在大鼠單次ig甘草苷后，在30～120 mg/kg劑量?jī)?nèi)，與體內(nèi)暴露量密切相關(guān)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0-30 h、AUC0-∞、max隨劑量增加而增加，增加的比例小于劑量比；與分布、消除過(guò)程密切相關(guān)的1/2、清除率（CL）、分布表觀容積（d）等參數(shù)與給藥劑量不相關(guān)，不隨給藥劑量增加而呈明顯變化。上述情況均表明大鼠單次ig甘草苷后，在30～120 mg/kg劑量?jī)?nèi)不呈線性動(dòng)力學(xué)特征。根據(jù)大鼠ig給予甘草苷后總甘草素的AUC0-30 h均值與同劑量下iv給予甘草苷后總甘草素的AUC0-30 h均值進(jìn)行計(jì)算，大鼠ig甘草苷后的絕對(duì)生物利用度為80.6%。

3.2 組織分布研究

3.2.1 甘草苷的組織分布特點(diǎn) 大鼠ig 60 mg/kg甘草苷后在2、6、17 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)平均總甘草素和游離甘草素在各組織/血漿的分布見(jiàn)表2。對(duì)各組織/血漿中總甘草素和游離甘草素含量進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明：（1）大鼠ig給予甘草苷后，血漿中2 h和17 h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)不到游離甘草素，6 h時(shí)游離甘草素也非常少，而水解后的總甘草素濃度較高，表明大鼠血漿主要以甘草素的II相結(jié)合產(chǎn)物形式存在。（2）大鼠ig給予甘草苷后，各組織中甘草素分布的存在形式和組織暴露量不同，大鼠血漿主要以甘草素的II相結(jié)合產(chǎn)物形式存在；脾、子宮、卵巢、肝、胃和腸組織中直接測(cè)得游離甘草素的含量與組織樣品經(jīng)酶水解后測(cè)得總甘草素含量相似，提示上述組織中游離甘草素為主要暴露物質(zhì)；其余組織結(jié)合型甘草素與游離甘草素共存。ig給藥后6 h藥效靶器官心組織中總甘草素的含量較游離甘草素高1倍，至給藥后17 h總甘草素與游離甘草素含量相似，且游離甘草素含量下降緩慢，表明結(jié)合型甘草素在心組織中可能逐漸全部轉(zhuǎn)化為游離甘草素。（3）除胃中甘草素的含量在給予甘草苷2 h后最高外，其余組織均在6 h達(dá)到分布峰值，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈迅速下降趨勢(shì)。大鼠ig給藥17 h，即約3個(gè)半衰期后，大部分組織中已檢測(cè)不到甘草素或含量已降至分布峰值的1/10～1/20，表明不會(huì)產(chǎn)生組織蓄積趨勢(shì)。

圖1 大鼠ig給予3劑量甘草苷后的平均血漿總甘草素濃度- 時(shí)間曲線(n= 6)

圖2 大鼠ig與iv給予30 mg/kg甘草苷后平均血漿總甘草素濃度-時(shí)間曲線比較 (半對(duì)數(shù)坐標(biāo)，n= 6)

表1 大鼠單次ig、iv后總甘草素藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較(n= 6)

*= 3

3.2.2 甘草苷的組織分布程度 按“2.3.5”項(xiàng)下方法計(jì)算的各組織/血漿中總甘草素和游離甘草素的分布程度AUC0-17 h和游離甘草素占總甘草素的比例（AUCF/AUCT）結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 大鼠ig給予甘草苷后各組織和血漿中總甘草素和游離甘草素的AUC0-17 h比較

AUCF為游離甘草素的AUC0-17 h；AUCT為總甘草素的AUC0-17 h；*= 3

AUCFis the value of AUC0-17 hfor free liquiritigenin; AUCTis the value of AUC0-17 hfor total aglycone liquiritigenin;*= 3

根據(jù)各組織中總甘草素和游離甘草素的組織暴露量AUC0-17 h結(jié)果可知，總甘草素分布程度腸＞血漿＞肝＞腎＞肺＞胃＞子宮＞卵巢＞脂肪＞心＞脾＞肌肉＞睪丸；游離甘草素分布程度：腸＞肝＞腎＞胃＞肺＞子宮＞卵巢＞脾＞脂肪＞心＞血漿＞肌肉＞睪丸?？偢什菟卦谀c、肝、腎、胃、肺分布相對(duì)較高；在雌性生殖器官卵巢、子宮中的分布相對(duì)高于雄性生殖器官睪丸；在心、脾、脂肪、肌肉中分布相對(duì)較少；無(wú)論結(jié)合型的還是游離型甘草素均不能到達(dá)腦組織，因此腦中檢測(cè)不到甘草素。

3.2.3 總甘草素的組織含量/血漿濃度比 各時(shí)間點(diǎn)組織樣品中總甘草素平均含量與同時(shí)間點(diǎn)血漿的平均濃度比值見(jiàn)表4。

肺、肝的總甘草素組織/血漿比隨時(shí)間變化基本維持一致；肌肉、脾、卵巢、腎、心、胃和腸的總甘草素組織/血漿比隨時(shí)間推進(jìn)迅速增加，結(jié)果表明，除肺和肝外，總甘草素在其余組織的消除過(guò)程和血漿的消除過(guò)程不一致。

表4 組織樣品中總甘草素平均含量與同時(shí)間點(diǎn)的平均血漿濃度比值(n= 6)

*= 3

3.3 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究

3.3.1 MDCK-MDR1細(xì)胞模型的驗(yàn)證 MDCK- mock細(xì)胞單層的TEER值到第6天達(dá)到（245±13）Ω·cm2＞150 Ω·cm2，MDCK-MDR1細(xì)胞單層的TEER值到第6天達(dá)到（242±10）Ω·cm2＞150 Ω·cm2，表明MDCK-mock和MDCK-MDR1細(xì)胞單層的致密性與完整性均良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

3.3.2 甘草苷和甘草素在MDCK-MDR1細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn) MDCK-MDR1細(xì)胞模型，甘草苷5 μmol/L給藥，甘草素10 μmol/L給藥，得到的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)app和E值，見(jiàn)表5。

本研究中甘草苷在MDCK-MDR1細(xì)胞模型攝入方向的app約為2×10?6cm/s，說(shuō)明甘草苷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力中等；甘草素的app約為17.0×10?6cm/s，說(shuō)明甘草素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力良好。甘草苷和甘草素在MDCK-MDR1細(xì)胞模型中E＜2，提示甘草苷和甘草素主要以被動(dòng)擴(kuò)散形式跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，均不存在P-糖蛋白外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

表5 甘草苷和甘草素在MDCK-MDR1細(xì)胞模型的Papp值和RE

4 討論

本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的黃酮類化合物吸收和代謝特點(diǎn)[18]，針對(duì)性地對(duì)大鼠體內(nèi)甘草苷、總甘草素和游離甘草素暴露量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，研究結(jié)果表明甘草苷在血漿中的主要存在形式為甘草素的II相結(jié)合產(chǎn)物，因此本實(shí)驗(yàn)采取β-葡萄糖醛酸酶水解總苷的方式定量分析總甘草素和游離甘草在體內(nèi)吸收分布中的暴露特征從而間接表征甘草苷在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。另外，采用MDCK-MDR1細(xì)胞模型研究甘草苷和甘草素各自的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力和轉(zhuǎn)運(yùn)方式，為進(jìn)一步闡明藥物吸收機(jī)制提供了依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)中甘草苷在大鼠體內(nèi)的吸收不呈線性動(dòng)力學(xué)特征，這需要進(jìn)一步闡明其飽和機(jī)制，再根據(jù)非線性動(dòng)力學(xué)的規(guī)律，指導(dǎo)臨床試驗(yàn)的用藥方案和劑量調(diào)整。藥物不呈現(xiàn)線性動(dòng)力學(xué)特征的主要原因是體內(nèi)的某些系統(tǒng)達(dá)到飽和，如酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體、血漿蛋白結(jié)合的飽和、腎小管重吸收的飽和等[19]。在當(dāng)前甘草苷臨床前藥動(dòng)學(xué)研究中，大鼠的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0-t、max隨劑量增加而增加，但增加的比例均小于劑量比，說(shuō)明體內(nèi)可能存在某種飽和機(jī)制，但機(jī)制的闡明還需進(jìn)一步的試驗(yàn)，這種非比例化劑量反應(yīng)關(guān)系給預(yù)測(cè)人體安全有效的劑量范圍帶來(lái)復(fù)雜性[19]。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血漿中總甘草素的藥-時(shí)曲線存在雙峰現(xiàn)象，進(jìn)一步研究了甘草苷（60 mg/kg）單次ig給藥后膽汁排泄情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽汁中總甘草素0～48 h累積排泄分?jǐn)?shù)為（32.1±10.7）%，提示ig給藥后總甘草素存在肝腸循環(huán)現(xiàn)象，可能是藥時(shí)曲線出現(xiàn)雙峰的原因。

在組織分布中，相對(duì)于其他組織，心臟中的游離甘草素濃度在6 h和17 h差別不大，而其他組織17 h時(shí)的游離甘草素的濃度比6 h顯著降低，推測(cè)心臟組織中的甘草素消除較慢，從現(xiàn)有數(shù)據(jù)分析這一結(jié)果可能會(huì)導(dǎo)致兩方面作用，一是延長(zhǎng)藥效作用，二是可能會(huì)引起心臟組織的蓄積。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)采集給藥后24 h組織樣本并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明大部分組織已檢測(cè)不到甘草素，其中有一半的大鼠心臟組織中檢測(cè)不到甘草素，排除個(gè)體差異的因素，這一結(jié)果表明甘草素在體內(nèi)24 h即可大部分消除，不會(huì)引起心臟組織的蓄積。因此，心臟組織比較其他組織消除較慢這一現(xiàn)象可能會(huì)使藥物作用延長(zhǎng)，這一點(diǎn)應(yīng)該是支持其心血管系統(tǒng)臨床應(yīng)用的依據(jù)。甘草苷擬作為抗心肌缺血類I類新藥進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究，理論上，心臟是甘草苷（甘草素）發(fā)揮其抗心肌缺血作用的靶器官之一，但絕不是唯一發(fā)揮藥效作用的關(guān)鍵因素，單純地從藥物在心臟組織的分布量來(lái)衡量其心血管系統(tǒng)作用是不全面的，其更全面深刻的作用機(jī)制還需進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

藥物吸收、分布、排泄僅是發(fā)生空間位置上的遷移，統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)運(yùn)[20]。藥物的體內(nèi)動(dòng)態(tài)就是其在體內(nèi)一系列跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的綜合效果。轉(zhuǎn)運(yùn)體的初步研究表明甘草苷和甘草素主要以被動(dòng)擴(kuò)散形式跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，均不存在P-gp外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。因此，不需關(guān)注基于P-gp的藥物-藥物相互作用，而且不呈線性動(dòng)力學(xué)的原因也可基本排除這一因素。大多數(shù)藥物對(duì)于機(jī)體來(lái)說(shuō)是外源性物質(zhì)，且具有一定的脂溶性，推測(cè)甘草苷和甘草素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制主要是被動(dòng)擴(kuò)散中的溶解擴(kuò)散[21-22]，是否為通過(guò)膜上含水孔道轉(zhuǎn)運(yùn)的限制擴(kuò)散還需更進(jìn)一步的研究。藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程，藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)不僅直接參與藥物的吸收、分布、排泄等藥動(dòng)學(xué)行為，同時(shí)與分布于靶器官的有效藥物濃度密切相關(guān)，因此明確藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力、機(jī)制以及對(duì)藥物體內(nèi)動(dòng)力學(xué)的調(diào)控作用[23]，對(duì)于新藥研發(fā)和評(píng)價(jià)意義重大。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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exposure characteristic andtransport mechanism of liquiritin

ZHANG Ai-jie1, 2, LI Cai3, LIU Yu-kang3, ZHANG Ying-hua4, GU Wei-ling4, DONG Shi-qi1,2, FAN Hui-rong1, 2, GU Yuan5, SI Duan-yun5

1. Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300192, China 2. Key Laboratory of Radiopharmacokinetics for Innovative Drugs, Chinese Academy of Medical Sciences, and Institute of Radiation Medicine, Tianjin 300192, China 3. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 4. Jilin Academy of Chinese Medicine Sciences, Changchun 132012, China 5. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China

The total aglycone liquiritigenin represents the primary exposure of liquiritinin rats. The objective of this study was to investigate the characteristics of exposure and transport mechanism of liquiritinin rats and. The results could provide the evidence of liquiritin for its further development as a new drug.The concentration of total aglycone liquiritigenin at different timing points in rat plasma and tissue distribution samples was determined by LC-MS/MS method after an oral administration of liquiritin in rats. The pharmacokinetic parameters were calculated by WinNonlin software using Rosenbluth method of non-compartment model. The exposure of total aglycone liquiritigenin and free liquiritigenin in rat tissues was investigated. And the transport mechanism of liquiritin and liquiritigenin was clarified using the MDCK-MDR1 cells.Liquiritin did not undergo linear pharmacokinetic characteristic after a single oral dose in rats. The phase II conjugation metabolites of liquiritigenin were the major exposure in plasma and most rat tissues. However, free liquiritigenin was primarily distributed in the tissue of rat liver, uterus, ovary, stomach and intestine. The exposure of total aglycone liquiritigenin in rat tissues did not show any accumulation trends. And the sequence of exposure was: intestine＞plasma＞liver＞kidney＞lung＞stomach＞uterus＞ovary＞fat＞heart＞spleen＞muscle＞testicle.The transport results indicated that both liquiritin and liquiritigenin were not the substrate of P-gp. And the transcellular transport of liquiritigenin from apical to basolateral membrane was higher than that of liquiritin in MDCK-MDR1 cells.Liquiritin did not show linear pharmacokinetic characteristic after a single oral dose in rats. The characteristics of exposure of liquiritigenin in rat tissues indicated that the extent of distribution and type of liquiritigenin were different among tissues. The exposure of total aglycone liquiritigenin in rat tissues did not show any accumulation trends. The transcellular transport of liquiritin and liquiritigenin was mediated by passive diffusion.

liquiritin, liquiritigenin, exposure characteristic, absorptionkinetics, tissue distribution, transcellular transport mechanism

R283

A

0253 - 2670(2021)07 - 2053 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.022

2020-05-28

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1708203）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（2018PT35031）；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專項(xiàng)（2019ZD004）；天津市自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（20JCQNJC00320）

張愛(ài)杰，男，助理研究員，研究方向?yàn)樗巹?dòng)學(xué)。E-mail: zhangaijie1986@163.com

董世奇，男，博士，研究方向?yàn)樗巹?dòng)學(xué)。E-mail: dongsq1314@126.com

樊慧蓉，女，研究員，碩士導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗巹?dòng)學(xué)。E-mail: fanhr99@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]