一Stickler綜合征家系的臨床特征及分子遺傳學(xué)分析

黃星星 劉果 高茹心 王婷婷 范夢(mèng)杰 王希振 朱益華 吳仁毅張達(dá)人 劉旭陽，2

作者單位：1廈門大學(xué)附屬廈門眼科中心 361000；2深圳市眼科醫(yī)院 518040

Stickler綜合征是一種罕見的遺傳性進(jìn)行性全身性膠原結(jié)締組織疾病，發(fā)病率約為1∶10 000，主要是因?yàn)槟z原蛋白基因突變導(dǎo)致全身廣泛膠原蛋白功能紊亂，引起眼部病變，可同時(shí)伴有骨骼及口面部發(fā)育異常、聽力損傷、腭部缺損等一系列變化[1]。該綜合征多為常染色體顯性遺傳，小部分為常染色體隱性遺傳，眼部表現(xiàn)較為突出，是兒童孔源性視網(wǎng)膜脫離的常見病因之一[1]。部分患者除眼部表現(xiàn)外還合并嚴(yán)重的骨骼發(fā)育異常，而在臨床中僅有眼部表現(xiàn)而未合并全身系統(tǒng)病變的患者，常常被漏診。分子遺傳學(xué)研究顯示75%的Stickler綜合征由COL2A1基因突變所致[2]。國外已有較多關(guān)于本病分子遺傳學(xué)的研究報(bào)道，中國在該方面的研究鮮見報(bào)道。本研究在臨床中診斷了1個(gè)Stickler綜合征的家系，并對(duì)其臨床表型及基因型進(jìn)行了分析。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

以2019年6月至2020年5月在廈門大學(xué)附屬廈門眼科中心診治的一Stickler綜合征家系為研究對(duì)象。該家系4代共計(jì)21人，符合Stickler綜合征的臨床診斷患者11例，其中男7例，女4例，1例已去世。家系先證者為女性，3 歲。家長(zhǎng)代訴自幼視力差，伴聽力減退。1%阿托品散瞳驗(yàn)光提示雙眼高度近視：右眼-12.00-1.75×75，左眼-11.00-0.75×80。除雙眼高度近視外，尚有面部扁平、鼻梁短、關(guān)節(jié)過度伸展等特征性體征。初步診斷：雙眼高度近視，Stickler綜合征。為進(jìn)一步明確病因，本研究對(duì)該家系成員進(jìn)行臨床及分子遺傳學(xué)分析。本研究經(jīng)所在廈門眼科中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：XMYKZX-LW-2019-004），且所有受檢者或未成年人的監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 檢查方法

1.2.1 眼部檢查 包括裸眼視力、矯正視力、裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、眼底彩色照相及眼部B型超聲等檢查。對(duì)12歲以下者涂1%阿托品眼膏睫狀肌麻痹下驗(yàn)光；12歲及以上者滴復(fù)方托品酰胺散瞳驗(yàn)光。

1.2.2 全身檢查 包括頭面部檢查，檢查有無腭裂（完全性腭裂、黏膜下腭裂及雙叉懸壅垂等），有無Marfan樣體型及面中部扁平（顴骨發(fā)育不良）、低鼻梁、短鼻、小頜畸形等面部特征。觀察受檢者面部特征并拍攝正面及側(cè)面照。骨骼及關(guān)節(jié)檢查包括有無關(guān)節(jié)疼、關(guān)節(jié)活動(dòng)度的范圍。同時(shí)行耳鏡及聽力檢查。家系中已去世成員病史根據(jù)病歷記錄獲得。

1.3 分子遺傳學(xué)分析

1.3.1 遺傳學(xué)調(diào)查及樣本采集 對(duì)該家系所有成員采用Cyrillic 3.1軟件繪制家系圖，并進(jìn)行系譜分析（見圖1）。詳細(xì)記錄所有家系成員的發(fā)病年齡、全身表現(xiàn)、近視程度、近視度數(shù)隨年齡的變化及玻璃體視網(wǎng)膜病史。

圖1.Stickler綜合征家系圖示男性患者；示健康男性示健康女性；示女性患者；示先證者；示已故男性；示已故女性Figure 1.Family diagram of Stickler syndrome.represents male patients; represents healthy men; represents healthy women;represents female patients;confirms the proband;represents dead men;represents dead women.

1.3.2 DNA提取 抽取先證者10 ml外周血及家系成員2 ml外周血置于乙二胺四乙酸抗凝管中，按試劑盒說明書方法提取基因組DNA。

1.3.3 全外顯子測(cè)序 抽提先證者及家系中正常者的基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳及Nanodrop檢測(cè)濃度及純度后進(jìn)行基因組建庫。將樣本的基因組DNA隨機(jī)打斷成主峰為200～300 bp左右片段（美國Covaris超聲波高性能樣品處理系統(tǒng)），使用試劑盒進(jìn)行末端修復(fù)、磷酸化以及加多聚腺苷酸，片段兩端分別連接接頭制備DNA文庫。將文庫與帶有生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行液相雜交，使用磁珠將全外顯子區(qū)域進(jìn)行捕獲并富集后，經(jīng)PCR線性擴(kuò)增后進(jìn)行文庫質(zhì)檢，合格后使用美國IlluminaHiSeq 4000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析 采用Chromas軟件識(shí)別基因組單核苷酸變異（Single nueleotide variants，SNV）和插入缺失（Insertion-deletion，InDel）變異；通過與dbSNP（v141）、1000 Genomes等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，過濾掉常見SNV和InDel變異后，篩選得到的變異用于下一步擴(kuò)大驗(yàn)證。

1.3.5 Sanger測(cè)序驗(yàn)證及致病性分析 對(duì)全外顯子組測(cè)序鑒定出的候選變異位點(diǎn)，采用Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物。分別對(duì)家系內(nèi)其他患者及正常人的基因組DNA各個(gè)候選變異位點(diǎn)所在的上下游區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增PCR產(chǎn)物純化后，使用ABL3730XL型DNA測(cè)序儀（美國ABL公司）進(jìn)行Sanger測(cè)序，進(jìn)行家系內(nèi)基因型-表型共分離分析。應(yīng)用生物信息軟件MutationTaster（http：//WWW.mutationtaster.org）對(duì)所發(fā)現(xiàn)的堿基進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果

2.1 家系特征

該家系4代共計(jì)21人，符合Stickler綜合征的臨床診斷共11 例。其中，男7 例，女4 例。該家系中無近親通婚，連續(xù)4代均有發(fā)病者，男女均有發(fā)??；凡是患病者，雙親中即有一方患??；若雙親均未患病，則子女均正常，符合常染色體顯性遺傳模式（見圖1）。

該家系患者特征：①高度近視。先證者（IV-3）自幼出現(xiàn)高度近視，右眼眼軸長(zhǎng)度（Axis length，AL）27.9 mm，屈光度-12.00-1.75×75；左眼AL 27.2 mm，屈光度-11.00-0.75×80。其余患者也均表現(xiàn)為高度近視。②先天性白內(nèi)障。家系中包括先證者共5 例患者出現(xiàn)白內(nèi)障，其中先證者的哥哥（IV-2）右眼裸眼視力（UCVA）0.07，-6.00-3.00×5，矯正視力0.7，左眼UCVA 0.07，-7.00-2.75×175，矯正無助，診斷為左眼先天性白內(nèi)障，雙眼高度近視，雙眼弱視，行左眼白內(nèi)障摘除聯(lián)合人工晶狀體植入術(shù)后，矯正視力0.2。先證者的父親也有白內(nèi)障。③玻璃體異常?，F(xiàn)存10 例患者玻璃體出現(xiàn)不同程度的液化改變。④眼底改變?，F(xiàn)存10 例患者中除了1 例患者眼底視網(wǎng)膜脫離外，余患者眼底呈現(xiàn)豹紋狀，視盤周圍未見明顯的萎縮?。ㄒ妶D2），OCT檢查發(fā)現(xiàn)先證者的父親黃斑部形態(tài)發(fā)育不良，黃斑中心凹厚度增厚。⑤視網(wǎng)膜脫離。家系內(nèi)有1 例患者出現(xiàn)視網(wǎng)膜脫離，先證者的爺爺（II-1）右眼無光感，左眼0.1，右眼AL16.2 mm，左眼AL30.2 mm；眼部B超提示右眼全視網(wǎng)膜脫離，左眼玻璃體混濁（見圖3）。⑥聽力障礙。先證者右耳感音性聽力障礙，余患者未發(fā)現(xiàn)聽力障礙。⑦面部特點(diǎn)。家系內(nèi)現(xiàn)存10 例患者均表現(xiàn)為面中部扁平，低鼻梁、短鼻（見圖4）。⑧Marfan樣體型。3 例患者四肢較長(zhǎng)體型（上部量與下部量比值降低或指距與身高的比值大于1.05），但無明顯的雞胸或漏斗胸（見圖4）。⑨關(guān)節(jié)活動(dòng)伸展過度。4例患者關(guān)節(jié)伸展活動(dòng)度大（見圖5）。

圖2.Stickler綜合征家系先證者雙眼彩色眼底像A：右眼；B：左眼。雙眼均顯示豹紋狀眼底，視盤色淡，邊界清晰，視盤周圍無高度近視萎縮弧Figure 2.Colored fundus images of both eyes of a proband in a family with Stickler syndrome.A:Right eye;B:Left eye.Leopard-like fundus is shown,optic disc has light color and clear boundary,and there is no high myopia atrophy arc around the optic disc.

2.2 基因檢查結(jié)果

通過對(duì)基因外顯子編碼區(qū)及側(cè)翼區(qū)篩查，過濾去掉最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）＞1%的突變多態(tài)性位點(diǎn)，比對(duì)Clinvar數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)該家系中Stickler患者均有1 個(gè)與臨床表型共分離的致病性基因變異，COL2A1（NM_033150）基因c.710delG：p.G237fs雜合變異（見圖6）。而該家系中正常者未發(fā)現(xiàn)該基因突變。該突變導(dǎo)致開放閱讀框第710位堿基G缺失，其后部序列發(fā)生移碼，從原712位后的GTGAAG變?yōu)門GAAG，712位翻譯密碼子TGA為終止密碼子UGA，導(dǎo)致其蛋白翻譯在第237 位氨基酸殘基提前終止，237 位氨基酸殘基由甘氨酸G突變?yōu)槔i氨酸V，且蛋白自第238 位氨基酸殘基截?cái)啵A(yù)測(cè)該突變導(dǎo)致蛋白整體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化從而喪失其正常功能。

3 討論

3.1 Stickler綜合征臨床特點(diǎn)

Stickler綜合征是遺傳性的關(guān)節(jié)-眼病，患者眼部表現(xiàn)較為突出，較小年齡出現(xiàn)高度近視，與病理性近視不同的是Stickler綜合征患者的高度近視為非進(jìn)展性，眼底視盤周圍無高度近視萎縮弧。Stickler綜合征患者由于巨大的視網(wǎng)膜裂孔而發(fā)生視網(wǎng)膜脫離的風(fēng)險(xiǎn)較高，其中近一半患者可能發(fā)生雙側(cè)視網(wǎng)膜脫離，主要是與玻璃體先天發(fā)育異常有關(guān)[3-5]。典型的玻璃體異常表現(xiàn)為“膜型”或“念珠型”，非典型的玻璃體異常表現(xiàn)為不同程度的液化、后脫離或是增殖膜形成，這些變化使得玻璃體后界膜與視網(wǎng)膜分離時(shí)裂孔的形成比正常同齡人要早[4]。患者在較小年齡即出現(xiàn)白內(nèi)障。部分患者因?yàn)橄忍斓姆拷前l(fā)育異常導(dǎo)致先天性青光眼，但更多的患者是因?yàn)橐暰W(wǎng)膜脫離或增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變引起繼發(fā)性房角關(guān)閉[6]。

圖3.Stickler綜合征家系先證者的爺爺雙眼超聲檢查結(jié)果A：右眼視網(wǎng)膜脫離；B：左眼玻璃體內(nèi)條狀混濁Figure 3.Results of binocular ultrasound examination of the grandfather of a proband in a family with Stickler syndrome.A:Retinal detachment in the right eye.B:There is a strip of opacity in the vitreous of the left eye.

圖4.Stickler綜合征家系先證者面部特征像A：側(cè)面圖：低鼻梁、短鼻；B：全身圖，Marfan樣體型；C：正面圖，典型面中部扁平、低鼻梁、短鼻Figure 4.Facial features of the proband of the family with Stickler syndrome.A:Side view:low bridge,short nose.B:Full-body image,Marfan shape.C:Front,typically flat middle,low bridge,short nose.

圖5.同年齡正常兒童及Stickler綜合征家系先證者肘關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度A：同年齡發(fā)育正常兒童肘關(guān)節(jié)活動(dòng)度；B：先證者肘關(guān)節(jié)活動(dòng)度；C：同齡發(fā)育正常兒童膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度；D：先證者膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度Figure 5.Range of motion of elbow and knee joint s i n normal age children and Stickler syndrome families.A:The range of motion of elbow joints in children with normal development of the same age.B:The pronator's elbow range of motion.C:Knee range of motion in children with normal development of the same age.D:Range of motion of the knee joint of the proband.

圖6.Stickler綜合征患者和正常人COL2AI基因序列片段A：雜合的是先證者基因測(cè)序片段；B：無變異的是先證者母親基因測(cè)序片段Figure 6.Fragment of the COL2AI gene in patients with Stickler syndrome and normal controls.A:The heterozygosity is the gene sequencing fragment of the probor.B:The one without variation is the gene sequencing fragment of the proband's mother.

Stickler綜合征患者聽力損傷包括高音區(qū)感音神經(jīng)性聽力損傷或內(nèi)耳及外耳發(fā)育異常引起的傳導(dǎo)性聽力障礙，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全了解，目前比較明確的是在中耳骨之間的關(guān)節(jié)中存在II型膠原，這些關(guān)節(jié)內(nèi)膠原的缺陷可能與傳導(dǎo)性聽力損傷有關(guān)[7]。因?yàn)槟z原蛋白的功能紊亂，口面部也相應(yīng)發(fā)生了改變，包括腭裂、面中部扁平、低鼻梁、短鼻、小頜畸形等，而腭部異常常與咽鼓管功能受損和中耳功能受損有關(guān)。

Stickler綜合征的兒童和成人中，超過80%的患者有骨骼發(fā)育異常，兒童由于骨骺發(fā)育不良表現(xiàn)為骨關(guān)節(jié)增大、關(guān)節(jié)活動(dòng)度過大，可導(dǎo)致平足、關(guān)節(jié)半脫位或脫位等。其他的骨關(guān)節(jié)異常還包括脊柱畸形、Marfan樣體型，或隨年齡增長(zhǎng)形成關(guān)節(jié)病變等，這些骨骼的變化對(duì)肢體活動(dòng)造成了較大的影響。

在對(duì)Stickler綜合征進(jìn)行臨床評(píng)估時(shí)需注意。約20%的患者不會(huì)發(fā)生近視；Stickler綜合征有可能發(fā)生視網(wǎng)膜巨大裂孔和視網(wǎng)膜脫離的風(fēng)險(xiǎn)，需進(jìn)行眼底詳細(xì)檢查。聽力檢查需要區(qū)分是傳導(dǎo)性還是感音神經(jīng)性聽力損傷。髖關(guān)節(jié)、腰椎和膝關(guān)節(jié)的X線檢查可顯示Stickler綜合征的特征。對(duì)玻璃體情況評(píng)估有困難的新生兒或非常年輕的患者進(jìn)行臨床評(píng)估時(shí)，可對(duì)其父母和兄弟姐妹進(jìn)行檢查幫助診斷。

該家系中所有患者均有眼部玻璃體不同程度液化改變，均有高度近視，年幼時(shí)發(fā)病，隨年齡的增大無明顯進(jìn)展。有1 例發(fā)生視網(wǎng)膜脫離，1 例年幼出現(xiàn)白內(nèi)障，1例自幼聽力差。有典型的低鼻梁、短鼻的面容特征，年長(zhǎng)者面部體征不明顯。家系中患者均有Marfan樣體型，先證者及哥哥骨骼關(guān)節(jié)活動(dòng)度大，年長(zhǎng)者有關(guān)節(jié)退行性改變。符合Stickler綜合征的臨床體征。

3.2 Stickler綜合征相關(guān)的膠原基因及COL2A1基因的相關(guān)突變

Stickler綜合征相關(guān)膠原基因包括COL2A1（COL=膠原；2=II型，A1=α1 肽，以下類推）基因、COL11A1基因、COL11A2基因、COL9A1基因、COL9A2基因及COL9A3基因，分別編碼膠原α1（II）、α1（XI）、α2（XI）、α1（IX）、α2（IX）、α3（IX）。COL2A1基因位于12號(hào)染色體的長(zhǎng)臂12q13.11上，共包含31 538個(gè)堿基對(duì)，包括54個(gè)外顯子，第1─5外顯子編碼Ⅱ型前膠原蛋白的N端，第6─48外顯子編碼三螺旋結(jié)構(gòu)的核心區(qū)，第49 ─52 外顯子編碼C端。這3 條多肽鏈折疊成一個(gè)桿狀的3 股螺旋分子。構(gòu)成膠原分子3 股螺旋結(jié)構(gòu)的每條鏈以左手螺旋的方式延長(zhǎng)，每圈包括3個(gè)氨基酸。每條鏈都叫做α鏈[8，9]。這些膠原基因主要決定的是細(xì)胞外基質(zhì)的膠原成分，對(duì)于眼部、口面部、關(guān)節(jié)及聽力的發(fā)育各自有其獨(dú)特的作用同時(shí)也相互關(guān)聯(lián)。II型膠原（同源三聚體）由COL2A1（COL=膠原；2=II型，A1=α1肽）基因編碼，由3條相同的II型膠原多肽鏈構(gòu)成。XI型膠原（異三聚體）由3 個(gè)不同鏈組成，每個(gè)組成鏈由3個(gè)不同的基因編碼：COL11A1、COL11A2和COL2A1。IX型膠原（異三聚體）也是由3 個(gè)不同基因編碼的3 個(gè)不同組成鏈形成，每個(gè)組成鏈由3個(gè)不同的基因編碼：COL9A1、COL9A2和COL9A3。XI型膠原的α1鏈在眼和軟骨組織中均有表達(dá)，而α2鏈主要在非眼（軟骨）組織中表達(dá)。因此，影響后一種蛋白的缺陷會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)病，其眼部表型未受影響或正常，而影響前一種蛋白的缺陷會(huì)導(dǎo)致眼部和骨骼組織的病變，出現(xiàn)典型的Stickler綜合征表型。Stickler綜合征患者均存在眼部玻璃體的先天性異常，因?yàn)樵诓Ａw中以II型膠原成分為主，同時(shí)也含有XI型和IX型膠原[10]。

COL2A1基因相關(guān)的錯(cuò)義突變、缺失、插入、復(fù)制及剪切位點(diǎn)突變，大多數(shù)是形成提前的終止子的點(diǎn)突變或單個(gè)核苷酸缺失導(dǎo)致的移碼突變。以往報(bào)道過在100例患者的COL2A1基因上找到了77種不同的突變[11，12]。表型變異可能因?yàn)椋孩龠x擇性剪接外顯子；②選擇性剪接轉(zhuǎn)錄的剪接位點(diǎn)突變；③不同氨基酸替代物的差異效應(yīng)；④鑲嵌現(xiàn)象：雖然表面上孤立的COL2A1相關(guān)疾病病例可能是由新突變引起的，但有報(bào)道強(qiáng)調(diào)鑲嵌現(xiàn)象是可能的病因[13]；⑤雜合變異。Ⅱ型膠原蛋白是關(guān)節(jié)軟骨的主要的結(jié)構(gòu)成分，是穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)，該區(qū)域核心部分由一段GLY-X-Y重復(fù)序列組成，維持關(guān)節(jié)軟骨正常理化性質(zhì)、力學(xué)性能。COL2A1基因的GLYX-Y重復(fù)序列中，X位精氨酸向半胱氨酸突變具有顯著意義。GLY-X-Y重復(fù)序列中的甘氨酸替換可導(dǎo)致多種形式的軟骨發(fā)育不良，統(tǒng)稱為II型軟骨病，表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)病變和軀干短小，可以伴有或不伴有眼部表現(xiàn)。應(yīng)注意與Stickler綜合征鑒別。

本研究通過采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)眼科遺傳疾病相關(guān)基因進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)患者的COL2A1（NM_033150）基因c.710delG：p.G237fs雜合變異。在家系中正常人未發(fā)現(xiàn)該突變。生物信息學(xué)分析示COL2A1基因在黑猩猩、恒河猴、狗、牛、老鼠、老鼠、雞、斑馬魚和青蛙中均高度保守，197個(gè)物種具有人類基因COL2A1的同源基因。Provean預(yù)測(cè)G237V突變的分值為-7.35，V238del突變分值為-8.31，均為設(shè)定閾值2倍以上，均為有害突變。膠原蛋白為重要結(jié)構(gòu)蛋白，此突變致使膠原蛋白鏈被明顯截短，可導(dǎo)致合格膠原蛋白量不足以支撐軟骨、眼球有關(guān)結(jié)構(gòu)等，使其結(jié)構(gòu)強(qiáng)度降低，誘發(fā)相關(guān)疾病。

3.3 Stickler綜合征的分型

Stickler綜合征突變的基因位點(diǎn)不同，因此臨床表型及遺傳方式差異大，根據(jù)是否存在眼部異常、玻璃體表型及分子遺傳學(xué)特征將Stickler綜合征分為5 型[14]，I、II及III型的突變基因分別為COL2A1基因、COL11A1基因、COL11A2基因，屬于常染色體顯性遺傳。IV、V型的突變基因分別為COL9A1基因、COL9A2基因，屬于常染色體隱性遺傳。近年也有關(guān)于COL9A3基因突變所致的常染色體隱形遺傳疾病。I型Stickler綜合征又分為ⅠA型：COL2A1基因外顯子2的突變，只有眼部表現(xiàn)，而無全身表現(xiàn)。因?yàn)楹怙@子2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的Ⅱ型膠原蛋白主要存在于玻璃體中，所以ⅠA型只有眼部表現(xiàn)，而無全身臨床特征。ⅠB型：COL2A1基因上外顯子2以外的突變，臨床表現(xiàn)包括眼部表現(xiàn)和全身特征[15]。

綜上，本研究通過家系調(diào)查、眼科檢查及全身相關(guān)檢查，確定了由COL2A1基因c.710delG：p.G237fs雜合變異的一個(gè)ⅠB型Stickler綜合征家系，本研究所發(fā)現(xiàn)的c.710delG位點(diǎn)的突變?cè)趪鴥?nèi)外尚未報(bào)道。該研究結(jié)果豐富了COL2A1基因的突變譜，也有助于遺傳咨詢和Stickler綜合征患者的防治。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明黃星星：參與選題、設(shè)計(jì)、家史采集、臨床分析、基因測(cè)序；進(jìn)行資料的分析、解釋；論文撰寫。劉果：參與基因分析，協(xié)助論文撰寫。高茹心、王婷婷、范夢(mèng)杰、王希振：協(xié)助論文撰寫。朱益華、吳仁毅：指導(dǎo)論文撰寫。張達(dá)人：參與家史采集；協(xié)助論文撰寫。劉旭陽：參與選題、設(shè)計(jì)、家史采集、臨床分析、基因測(cè)序；進(jìn)行資料的分析、解釋；論文修改