miR-25與大動脈粥樣硬化性腦卒中相關(guān)性研究

代英杰

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016

大動脈粥樣硬化性腦卒中(large artery atherosclerotic stroke，LAAS)是由于顱內(nèi)外大血管的動脈粥樣造成的缺血性腦卒中[1-3]。有研究表明，miRNAs作為一類非編碼小分子RNA，參與諸多生命活動的調(diào)控，已成為某些疾病診斷、治療與預(yù)后判定的分子靶點，其在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4-6]。miR-25與miRs-93、miRs-106b共同組成 miR-106-25基因簇[7]。有研究表明，miR-25在缺血性卒中患者外周血中表達水平出現(xiàn)了下調(diào)或上調(diào)[8-9]，但其在缺血性腦卒中的作用機制未見報道。本研究通過檢測LAAS患者血液中miR-25的表達水平，探討其作為該病診斷分子標(biāo)志物的可能性，同時探索miR-25在LAAS形成中的分子機制?，F(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 將北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院2015年6—12月收治的41例發(fā)病72 h內(nèi)確診LAAS患者納入B組。納入標(biāo)準(zhǔn)：有急性、突發(fā)的持續(xù)24 h以上的局灶性神經(jīng)功能缺失；經(jīng)頭顱核磁共振CT檢查發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的陽性病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有嚴重心臟疾病，近期發(fā)生心絞痛、急性心肌梗死者；嚴重肝腎功能不全者；兩周內(nèi)服用過抗凝或抗血小板藥物者。另將同期于我院體檢的42例健康志愿者納入A組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 獲取血液標(biāo)本 通過問卷調(diào)查、體格檢查與實驗室檢查等，收集兩組研究對象的臨床資料，包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、血壓、血脂、既往史等。B組患者分別于入院次日清晨與發(fā)病第10天進行采血，A組于體檢當(dāng)日采集外周靜脈血4 ml，乙二胺四乙酸抗凝，上下顛倒混勻后立即置于4℃冰箱保存，于2 h內(nèi)進行血漿分離。以1 500 r/min離心10 min，將血漿轉(zhuǎn)移至1.5 ml無RNA酶離心管中，于-80℃凍存。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與基因瞬時轉(zhuǎn)染 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECS)于含有10%胎牛血清的1 640培養(yǎng)基，以37℃條件下，5%CO2孵箱中培育。當(dāng)細胞長滿瓶底后，用0.25%胰酶消化，進行傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d鋪6孔板，調(diào)整細胞密度為2×105～4×105個/ml。待細胞密度為60%～80%時，進行相關(guān)小RNAs、siRNA轉(zhuǎn)染。小RNAs序列如下：miR-25 模擬物(miR-25 mimics)，5′-AUUGCCCAAGUCUCCGCCUUU-3′；miR-25抑制物(miR-25 inhibitor)，5′-CAAUUGCCCAAGUCUCCGCCU-3′；陰性對照(NC)，5′-UUCUCCG AACGUGUCACGUTT-3′；siCYP17A1，5′-AUGAUAACUUCUGUGCCCUdTdT-3′。將小RNAs及轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME分別混于jetPRIME緩沖物，靜置10 min后滴入6孔板，置培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染后4 h，PBS漂洗，加入新鮮的培養(yǎng)基。48 h后收集細胞。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測 細胞及血液總RNA提取采用TRIzol法。使用TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix Kit(Transgene公司)進行miRNA cDNA合成。使用PrimeScript RT Master Mix Kit(Takara公司)試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA。應(yīng)用SYBR Green Real-time PCR試劑盒(TakaRa公司)擴增miR-25與CYP17A1 cDNA。具體操作均嚴格按照說明書進行。

1.2.4 細胞計數(shù)試劑盒檢測 將消化轉(zhuǎn)染后細胞密度調(diào)整為2×104～5×104個/ml。每孔加入100 ml細胞懸液，每組設(shè)5個復(fù)孔，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。分別于24、48、72、96 h，每孔加入10 ml細胞計數(shù)試劑溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。測定A450 nm波長吸光度，以波長吸光度作為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。

1.2.5 克隆形成實驗 將消化轉(zhuǎn)染后細胞密度調(diào)整為3×104～5×104個/ml。每孔加入100 ml細胞懸液，于培養(yǎng)箱孵育3～4 d。以PBS溶液漂洗，10%甲醛固定20 min。蘇木素染色10 min，自來水沖洗，空氣干燥，計算集落形成情況。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 消化轉(zhuǎn)染后細胞濃度調(diào)整為5×105～1×106個/ml。取1 ml細胞懸液，以4℃、3 000 r/min離心10 min，棄上層清液。加入1 ml冷PBS溶液，輕震懸浮細胞。以4℃、3 000 r/min離心10 min，棄上層清液。采用100 ml binding buffer重懸細胞。收集細胞并用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(南京凱基公司)染色，流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率。

1.2.7 Transwell小室法與劃痕實驗檢測細胞遷移能力 消化轉(zhuǎn)染后的細胞，用雙無培養(yǎng)基稀釋細胞懸液，分別向Transwell上室加入100 μl含有2×105個HUVECS細胞，下室加入500 μl完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，取出小室，10%甲醛固定30 min，依次進行蘇木素、伊紅染色、蘇木素復(fù)染，并用棉簽擦凈膜上表面細胞。用刀片小心剝下膜，中性樹脂封片。干燥后，顯微鏡下觀察計數(shù)。將轉(zhuǎn)染后的HUVECS細胞接種6孔板中，用1 ml槍頭小心在孔底劃痕，PBS溶液清洗3次，加入新鮮培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下拍照，沿劃痕邊緣等間距取3處測量劃痕寬度，取平均值。48 h后繼續(xù)拍照，在相同觀察點測量劃痕寬度。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象一般資料比較 B組收縮壓、低密度脂蛋白、高血壓病史比例均高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組患者其他一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

2.2 兩組研究對象miR-25表達量比較 與治療前比較，B組治療后的miR-25表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療后，B組的miR-25表達量仍顯著高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-25表達水平與收縮壓呈正相關(guān)(r=0.37，P<0.05)。

2.3 miR-25對HUVECS細胞生物學(xué)功能的影響 與對照組相比，miR-25 mimics或miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染組miR-25表達水平分別顯著升高或降低(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。細胞計數(shù)試劑盒檢測結(jié)果顯示，miR-25 mimics轉(zhuǎn)染組HUVECS增殖能力較對照組顯著下降，miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染組HUVECS的增殖能力較對照組顯著上升(P<0.05)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，miR-25 mimics轉(zhuǎn)染組HUVECS克隆形成能力較對照組顯著下降，miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染組HUVECS的克隆形成能力較對照組顯著上升(P<0.05)。流式細胞術(shù)檢測細胞早期凋亡結(jié)果顯示，miR-25 mimics轉(zhuǎn)染組較對照組HUVECS早期凋亡率顯著升高，而miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染組較對照組HUVECS早期凋亡率顯著下降(P<0.05)。Transwell小室法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染組HUVECS遷移能力顯著增加，而miR-25 mimics轉(zhuǎn)染組HUVECS遷移能力顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 miR-25對HUVECS細胞生物學(xué)功能的影響(a.miR-25 mimics與miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染效率的檢測；b.細胞計數(shù)試劑盒法檢測miR-25對HUVECS細胞增殖能力的影響；c.克隆形成實驗檢測miR-25對HUVECS細胞克隆形成能力的影響；d.流式細胞術(shù)檢測miR-25對HUVECS細胞早期凋亡的影響；e.Transwell小室法檢測miR-25對HUVECS細胞遷移能力的影響)

3 討論

動脈粥樣硬化受到環(huán)境因素與遺傳因素共同影響[10]，作為一種動脈粥樣硬化相關(guān)疾病，可推測LAAS發(fā)病為多因素共同參與。近年來，諸多miRNA被報道參與動脈粥樣硬化的發(fā)生[11-13]。有研究表明，miR-25的靶基因參與細胞增生、分化、遷移、凋亡炎癥、應(yīng)激等多種生物活動的調(diào)節(jié)，在急性心肌梗死的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[14]。

本研究通過檢測LAAS患者中miR-25的表達量發(fā)現(xiàn)：治療后，B組miR-25表達量顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療后，B組miR-25表達量顯著低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。臨床治療可以降低LAAS患者的miR-25水平，miR-25參與LAAS的發(fā)生、發(fā)展，可能為LAAS治療的潛在生物標(biāo)志物。盡管miR-25與高血壓間的關(guān)系尚未被報道，但本研究發(fā)現(xiàn)，高miR-25水平與收縮壓有關(guān)。miR-25可能在高血壓源性LAAS發(fā)病中起到重要作用。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，miR-25抑制HUVECS的增殖和遷移，并促進其凋亡。但miR-25是如何對血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮作用的，尚需要進一步闡明?？赏ㄟ^生物信息學(xué)軟件對miR-25的靶基因進行預(yù)測、篩查與鑒定，并結(jié)合生物學(xué)功能研究，進一步明確miR-25在LAAS中相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

綜上所述，miR-25可調(diào)控HUVECS增殖、遷移及早期凋亡，可能為LAAS治療的潛在靶點。