仁扇舟蛾幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

朱 晗,郝德君,魏原芝,孫麗昕,文全民

(南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，與病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物等多種微生物相互選擇、相互適應(yīng)，形成了密切的共生關(guān)系。研究表明，昆蟲(chóng)腸道細(xì)菌具有多方面的功能，如調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)代謝幫助宿主分解難以降解的食物變?yōu)橐子谙盏慕M分[1]；直接為宿主昆蟲(chóng)提供必需氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]；分解代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFAs)等代謝副產(chǎn)物影響宿主昆蟲(chóng)的脂質(zhì)和碳水化合物代謝，維持穩(wěn)態(tài)[3]；調(diào)控激素的信號(hào)途徑從而影響宿主昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育及其壽命[4]；降解殺蟲(chóng)劑，保護(hù)宿主免受毒害[5]；參與腸道干細(xì)胞增殖和上皮細(xì)胞再生的生理活動(dòng)[6]；參與昆蟲(chóng)信息素的合成，調(diào)控宿主昆蟲(chóng)種間通訊及種群行為[7]；引起宿主昆蟲(chóng)的物種分化[8]；抑制昆蟲(chóng)寄主植物的防御反應(yīng)[9]等等。

仁扇舟蛾(Closterarestitura)為鱗翅目(Lepidoptera)舟蛾科(Notodontidae)扇舟蛾屬(Clostera)，具有世代多、產(chǎn)卵量大、幼蟲(chóng)孵化率高、蟲(chóng)口數(shù)量易在短期內(nèi)劇增等特點(diǎn)[10-11]，是楊樹(shù)重要的食葉害蟲(chóng)。國(guó)外分布于印度、越南、馬來(lái)西亞和印度尼西亞，國(guó)內(nèi)分布于南方的安徽、江蘇、上海、浙江、江西、福建、湖南、廣東、云南、海南、臺(tái)灣和香港等地[10]。近些年，江蘇、安徽、上海等地仁扇舟蛾相繼爆發(fā)成災(zāi)，不僅影響了我國(guó)重要速生樹(shù)種——楊樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育，也造成很大程度的生態(tài)環(huán)境破壞。目前雖然開(kāi)展了仁扇舟蛾的形態(tài)特征[10]、生物學(xué)特性[11]、與寄主植物的相互關(guān)系[12]以及嗅覺(jué)感受蛋白[13]等方面的研究，但未見(jiàn)其腸道共生微生物的研究報(bào)道。本研究采用細(xì)菌分離培養(yǎng)法，利用16S rDNA基因序列分析和PCR擴(kuò)增技術(shù)，結(jié)合菌落形態(tài)觀(guān)察和生理生化特征鑒定腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌的種類(lèi)，了解仁扇舟蛾腸道共生細(xì)菌的主要類(lèi)群及其群落結(jié)構(gòu)特征，為進(jìn)一步研究特異功能細(xì)菌的生理生化特征和功能奠定基礎(chǔ)，也為探討腸道菌群對(duì)宿主的生理功能和生態(tài)學(xué)意義提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

仁扇舟蛾2～3齡幼蟲(chóng)采自南京市浦口區(qū)烏江鎮(zhèn)(118°52′E，31°89′N(xiāo))楊樹(shù)行道樹(shù)，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于光暗周期為14L/10D、溫度(25±2) ℃、相對(duì)濕度為(65±5)%的條件下飼養(yǎng)，喂食新鮮的楊樹(shù)葉片，每日更換1次。以實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的第2代5齡幼蟲(chóng)為供試?yán)ハx(chóng)。

1.2 腸道解剖及可培養(yǎng)細(xì)菌的分離培養(yǎng)

選取10頭健康的5齡幼蟲(chóng)，饑餓處理12 h，后用PBS緩沖液沖洗蟲(chóng)體表面多次，置于75%酒精中體表消毒3 min，并用無(wú)菌水漂洗3次。無(wú)菌環(huán)境下解剖腸道，將分離的前、中和后腸分別置于2 mL離心管中，加入PBS緩沖液0.5mL研磨，并于室溫下1 000 r/min離心3 min，取上清液，用無(wú)菌水分別稀釋10-1～10-6倍，涂布于NA和LB固體培養(yǎng)基上。LB固體培養(yǎng)基(1 L)：蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，pH 7.0。NA固體培養(yǎng)基(1 L)：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，pH 7.0。重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。根據(jù)菌落顏色、大小和形態(tài)分離純化單菌落，純化所得菌株于25%甘油中保存置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的形態(tài)觀(guān)察及生理生化實(shí)驗(yàn)

利用LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)活化所得菌株，待長(zhǎng)出單菌落后觀(guān)察形態(tài)特征，包括：大小、形狀、顏色、透明度、表面光滑與否及邊緣特點(diǎn)等。觀(guān)察菌體形態(tài)，包括菌體單染、革蘭染色、芽孢染色和鞭毛染色等。生理生化性狀包括酶活測(cè)定、H2S產(chǎn)生、硝酸鹽還原、丙二酸鹽及檸檬酸鹽的利用、IMViC(吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、伏-普實(shí)驗(yàn)和檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn))、碳素化合物利用(糖類(lèi)和醇類(lèi))和大分子化合物水解(淀粉、液化明膠和七葉苷水解)等。

1.4 腸道可培養(yǎng)細(xì)菌DNA的提取和16S rDNA擴(kuò)增

活化保存?zhèn)溆玫木N，提取細(xì)菌基因組DNA。16S rDNA通用引物：27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′) 和1492 R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 17.25 μL，10×TransTaq-T Buffer 2.5 μL，gDNA (50 ng/μL) 2.0 μL，Primer 27 F (10 mmol /L) 和Primer 1492 R(10 mmol /L) 各0.5 μL，dNTP 2.0 μL，TransTaq-T DNA Polymerase (5 U/μL) 0.25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保溫。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.5 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)序得到的16S rDNA序列用Clustal X 1.82軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，后與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，選取各個(gè)菌株的近緣序列，利用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，使用Bootstrap檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)的可靠性，Bootstrap值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的形態(tài)特征

研究分離得到仁扇舟蛾5齡幼蟲(chóng)可培養(yǎng)細(xì)菌22株，其中前腸5株，中腸10株，后腸7株，對(duì)其依次編號(hào)為CF1-5、CM1-10和CH1-7。純化后，22株菌的菌落和菌體形態(tài)的觀(guān)察結(jié)果見(jiàn)表1。其中，3株菌的形狀為球形，19株為桿狀；8株細(xì)菌革蘭染色呈陰性，14株細(xì)菌革蘭染色呈陽(yáng)性；9株細(xì)菌有芽孢，8株細(xì)菌有莢膜，18株細(xì)菌有鞭毛。

表1 仁扇舟蛾幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌基本特征Table 1 The basic characteristics of intestinal bacteria in the gut of Clostera restitura larval

2.2 腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的生理生化鑒定及16S rDNA基因片段的擴(kuò)增與克隆

測(cè)定結(jié)果表明(表2)，所有菌株對(duì)糖醇等碳素化合物的利用差異不顯著，均具有較強(qiáng)的分解能力。但不同菌株在酶活測(cè)定、H2S產(chǎn)生、硝酸鹽還原、丙二酸鹽及檸檬酸鹽利用等方面具有顯著差異，少數(shù)菌株在IMViC實(shí)驗(yàn)中呈陽(yáng)性反應(yīng)。大多數(shù)菌株在大分子化合物水解實(shí)驗(yàn)中呈陽(yáng)性反應(yīng)，可分解利用淀粉、液化明膠、七葉苷、檸檬酸鹽以及丙二酸鹽，但不能還原硝酸鹽且不能產(chǎn)生H2S。

表2 仁扇舟蛾幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌各菌株生理生化性狀Table 2 Biochemical characteristics of cultured bacteria in the gut of Clostera restitura larval

以提取的腸道細(xì)菌基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物(27F和1492R)擴(kuò)增后，通過(guò)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，條帶清晰，且獲得的細(xì)菌16SrDNA基因片段全長(zhǎng)在1 500 bp左右，是實(shí)驗(yàn)所需目的片段(圖1)。

圖1 腸道細(xì)菌DNA PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.1 The electropherogram of the intestinal bacterial DNA PCR amplification

2.3 腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 仁扇舟蛾幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA phylotypes of the intestinal bacteria of Clostera restitura larvae

將獲得的序列提交NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，將測(cè)序得到的仁扇舟蛾幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)合可培養(yǎng)細(xì)菌的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)，鑒定結(jié)果如下：前腸5種細(xì)菌分別為皮氏羅爾斯頓菌(Ralstoniapickettii)、氣球菌屬(Aerococcus)、斯氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)和Exiguobacteriumacetylium；中腸10種細(xì)菌分別為極小短小桿菌(Curtobacteriumpusillum)、皮氏羅爾斯頓菌、唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderiaginsengis)、氣球菌屬(Aerococcus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasrhizophlia)、斯氏假單胞菌、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和Paenibacillusuliginis；后腸7種細(xì)菌分別為皮氏羅爾斯頓菌、鉆特省芽孢桿菌(Bacillusdrentensis)、斯氏假單胞菌、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、寡養(yǎng)單胞菌和瓜兩面神菌(Janibactermelonis)。

3 討 論

采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)合16S rDNA分子鑒定技術(shù)，研究了仁扇舟蛾5齡幼蟲(chóng)不同腸段的可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，仁扇舟蛾幼蟲(chóng)腸道內(nèi)的可培菌種類(lèi)豐富，其中以變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群。在同為舟蛾科的櫟黃掌舟蛾(Phaleraassimilis)腸道菌的研究中發(fā)現(xiàn)其腸道優(yōu)勢(shì)菌群也以變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為主，以葡萄球菌屬和短小桿菌屬為主要菌群[14]。在鱗翅目腸道菌群的相關(guān)研究中，大多數(shù)可培養(yǎng)細(xì)菌都屬于變形菌門(mén)，其中α-變形菌門(mén)和γ-變形菌門(mén)最為常見(jiàn)；在科水平上，以腸桿菌科、芽孢桿菌科、假單胞菌科、葡萄球菌科、腸球菌科最為常見(jiàn)；在屬水平上，假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬和腸球菌屬最為常見(jiàn)[15]。在夜蛾科的相關(guān)研究中，變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群，其中克雷伯氏菌屬和沙雷氏菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬[16]。在舞毒蛾(Lymantriadispar)的腸道中發(fā)現(xiàn)分離出的70%的細(xì)菌屬于革蘭陽(yáng)性的γ-變形菌門(mén)[17]。

昆蟲(chóng)中腸段作為食物消化和吸收的主要場(chǎng)所，菌群種類(lèi)和數(shù)量相對(duì)較高。本研究發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)菌的種類(lèi)會(huì)隨著腸段的不同有所差異，如中腸段特有極小短小桿菌、唐菖蒲伯克霍爾德菌、蠟狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和Paenibacillusuliginis。此外，相鄰腸段之間往往存在相同的細(xì)菌，例如從前腸和中腸中分離出的氣球菌屬，中腸和后腸共有的寡養(yǎng)單胞菌。前、中和后腸等3個(gè)腸段共有的細(xì)菌為皮氏羅爾斯頓菌和斯氏假單胞菌。

昆蟲(chóng)腸道菌群不僅與宿主有關(guān)，而且與環(huán)境、取食的寄主植物有極大的關(guān)系。楊樹(shù)葉片中含有較為豐富的單寧[18]，仁扇舟蛾作為楊樹(shù)重要的食葉害蟲(chóng)，相關(guān)研究表明節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬均可降解單寧[19]。本研究分離到仁扇舟蛾腸道中的這些細(xì)菌可能在克服植物次生代謝物質(zhì)的化學(xué)防御上發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究首次分析了仁扇舟蛾幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的種類(lèi)與群落結(jié)構(gòu)組成。這些細(xì)菌可能在提高宿主昆蟲(chóng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性、為宿主提供營(yíng)養(yǎng)和降解外源有毒物質(zhì)等方面發(fā)揮作用，相關(guān)功能有待后續(xù)研究。