虛擬導(dǎo)航超聲支氣管鏡灌洗液miRNA在不同大體分型肺癌患者體內(nèi)表達(dá)差異及診斷周圍型肺癌的效能研究

顏晶晶， 蔡青波， 郭峰睿， 劉 穎， 張 業(yè)*

1. 河北中石油中心醫(yī)院， 河北 廊坊 065000； 2. 廊坊市人民醫(yī)院， 河北 廊坊 065000

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，有報(bào)道，2015年我國(guó)新發(fā)肺癌病例73.3萬，死亡病例61.0萬[1],肺癌患者約75%診斷時(shí)已屬晚期，5年生存率僅為16.1%[2],因此，肺癌早期診斷具有積極意義。纖維支氣管鏡是診斷肺癌的主要臨床方法之一，但肺外周病變是支氣管鏡檢查盲區(qū)，難以發(fā)現(xiàn)周圍型肺癌(peripheral lung cancer，PLC)病灶[3,4]。虛擬支氣管鏡導(dǎo)航聯(lián)合支氣管超聲導(dǎo)向鞘，同步將氣管鏡引導(dǎo)至肺周圍病變部位，可有效提高PLC的診斷率及診斷效率[5]。微小RNA(miRNA)是目前腫瘤領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。大量miRNA在基因組上定位于腫瘤相關(guān)脆性位點(diǎn)，發(fā)揮類似抑癌基因或癌基因的功能，參與腫瘤細(xì)胞分化凋亡、侵襲遷移、新生血管生成等病理生理過程[6,7]。癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)是肺癌經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物。本研究探討了虛擬導(dǎo)航超聲氣管鏡灌洗液中的miRNA在不同大體分型肺癌患者體內(nèi)表達(dá)差異、其與肺癌經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系及診斷PLC、判斷是否轉(zhuǎn)移的效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月～2020年4月我院收治的65例CLC患者，設(shè)為中心型組；同期65例PLC患者，設(shè)為周圍型組。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)檢查明確為肺癌患者；均為初診患者；常規(guī)支氣管鏡下無法看到病變；患者知曉本研究，已簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤；嚴(yán)重呼吸困難；不能控制的高血壓(收縮壓>180 mmHg)；嚴(yán)重臟器功能不全；拒絕接受支氣管鏡檢查；對(duì)局麻藥過敏(如利多卡因、丁卡因)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 方法

術(shù)前均行胸部64排螺旋CT掃描，參數(shù)：0.5 mm準(zhǔn)直，120 kV，螺距0.9，雙探測(cè)器，螺旋時(shí)間0.5 s，層厚1 mm，通過重建獲得軸向CT圖像。將螺旋CT掃描的數(shù)字圖像通信醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)(DICOM)導(dǎo)入DirectPath系統(tǒng)，生成合適引導(dǎo)路徑?；颊咝g(shù)前禁水4 h，禁食8 h，2%利多卡因霧化吸入局麻。經(jīng)一側(cè)鼻孔置入奧林巴斯BF-P260F型支氣管鏡至目標(biāo)支氣管，經(jīng)活檢管道置入帶鞘管超聲探頭，獲得滿意超聲圖像。固定鞘管并退出超聲探頭，實(shí)施肺泡灌洗操作，收集灌洗液，離心10 min(3000 r/min)，采集上清液。CEA和NSE采用Roche E170全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定。采用TRIzol法提取灌洗液中RNA，純化后測(cè)定RNA濃度(NanoDropND-1000分光光度儀)，檢測(cè)RNA完整性(電泳法)，A260/A280>1.8，根據(jù)丹麥Exiqon公司方法進(jìn)行RNA標(biāo)記和雜交。采集芯片，用GenePix Pro 6.0 軟件讀取芯片并掃描圖像，提取探針信號(hào)值，合并相同探針取中值，保留信號(hào)值均≥30.0的探針，中值標(biāo)準(zhǔn)化，篩選差異表達(dá)探針，篩選標(biāo)準(zhǔn)：表達(dá)差異倍數(shù)變化>1.5且P<0.05，繪制火山圖。用PCR法檢測(cè)miR-1260b、miR-135a-3p、miR-299-3p和miR-3175表達(dá)量，用2-ΔΔCT表示。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)兩組患者一般資料，灌洗液miRNA含量。

(2)灌洗液miRNA與經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性。

(3)miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175與PLC相關(guān)性。

(4)灌洗液miRNA診斷PLC的效能。

(5)按PLC是否轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組，分析患者灌洗液miRNA表達(dá)。

(6)評(píng)估PLC是否轉(zhuǎn)移的ROC曲線。

(7)診斷流程圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料及灌洗液miRNA比較

兩組患者年齡45～86歲，組間年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、分化程度、腫瘤TNM分期、轉(zhuǎn)移情況及miR-299-3p比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；周圍型組灌洗液中miR-1260b低于中心型組，miR-135a-3p、miR-3175高于中心型組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般資料和灌洗液miRNA比較

2.2 灌洗液miRNA與經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

周圍型組CEA高于中心型組，NSE低于中心型組(P<0.05)；miR-1260b與CEA、NSE呈負(fù)相關(guān)，miR-135a-3p、miR-3175與CEA和NSE呈正相關(guān)；且各灌洗液miRNA的相關(guān)性系數(shù)r，周圍型組均大于中心型組(P<0.05)。見圖1、圖2和表2。

圖1 兩組患者CEA比較

圖2 兩組患者NSE比較

表2 相關(guān)性參數(shù)

2.3 偏相關(guān)性分析

將腫瘤TNM分期、是否轉(zhuǎn)移等其他因素控制后，miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175仍與PLC顯著相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 偏相關(guān)性分析

2.4 灌洗液miRNA診斷PLC的效能

圖3為灌洗液miRNA診斷PLC的ROC曲線，由圖可知miR-1260b診斷PLC的AUC為0.751，miR-135a-3p診斷PLC的AUC為0.814，miR-3175診斷PLC的AUC為0.800，各指標(biāo)聯(lián)合診斷PLC的AUC為0.899，詳見表4。

圖3 灌洗液miRNA診斷PLC的ROC曲線

表4 灌洗液miRNA診斷PLC的ROC曲線分析結(jié)果

2.5 PLC轉(zhuǎn)移/未轉(zhuǎn)移患者灌洗液miRNA表達(dá)比較

PLC轉(zhuǎn)移患者灌洗液中miR-1260b、miR-299-3p低于未轉(zhuǎn)移患者，miR-135a-3p、miR-3175高于未轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。見表5。

表5 PLC是否轉(zhuǎn)移患者灌洗液miRNA表達(dá)比較

2.6 評(píng)估PLC是否轉(zhuǎn)移的ROC曲線

圖4為灌洗液miRNA評(píng)估PLC轉(zhuǎn)移的ROC曲線。miR-1260b評(píng)估PLC轉(zhuǎn)移的AUC為0.785，miR-135a-3p評(píng)估PLC轉(zhuǎn)移的AUC為0.794，miR-299-3p評(píng)估PLC轉(zhuǎn)移的AUC為0.814，miR-3175評(píng)估PLC轉(zhuǎn)移的AUC為0.838；各指標(biāo)聯(lián)合評(píng)估PLC轉(zhuǎn)移的AUC為0.888，高于單獨(dú)評(píng)估。詳見表6。

圖4 灌洗液miRNA評(píng)估PLC轉(zhuǎn)移的ROC曲線

表6 灌洗液miRNA評(píng)估PLC轉(zhuǎn)移的ROC分析結(jié)果

2.7 診斷流程圖

以miR-1260b為例繪制診斷流程圖如圖5。

圖5 診斷流程圖

3 討論

3.1 研究背景

PLC指位于肺段以下支氣管直到細(xì)小支氣管的肺癌，由于其早期無明顯癥狀、不易與其他結(jié)節(jié)樣疾病鑒別、確診比CLC困難等原因，導(dǎo)致多數(shù)PLC患者診斷時(shí)已屬中晚期[8,9]。因此，早期診治對(duì)改善PLC預(yù)后尤為關(guān)鍵。

3.2 虛擬導(dǎo)航超聲氣管鏡對(duì)PLC診斷價(jià)值

病理學(xué)檢查是肺外周病變臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)[10]，經(jīng)纖維支氣管鏡肺活檢已成為診斷肺癌的主要手段之一。而肺外周病變超出支氣管鏡可視范圍，鏡檢陽性率僅30%左右，灌洗及痰檢陽性率亦不高[11]。導(dǎo)向鞘引導(dǎo)的超聲支氣管鏡可獲得支氣管樹、周圍肺實(shí)質(zhì)及縱膈結(jié)構(gòu)的可視化圖像，彌補(bǔ)了普通支氣管鏡無法觀察管壁及臨近組織結(jié)構(gòu)的不足[12]。虛擬導(dǎo)航支氣管鏡系統(tǒng)利用計(jì)算機(jī)軟件處理患者胸部CT掃描圖像，得到虛擬肺部三維可視化模型，與電子支氣管鏡視頻同步將氣管鏡引導(dǎo)至肺周圍病變部位[13]。方芳[14]研究顯示，虛擬導(dǎo)航超聲氣管鏡可顯著縮短確認(rèn)病灶位置的時(shí)間，且未增加并發(fā)癥。李士杰等[15]研究表明，虛擬導(dǎo)航超聲氣管鏡引導(dǎo)肺活檢，肺周圍型病變顯像率89.3%，明確診斷率73.5%，惡性病變?cè)\斷率82.5%。

3.3 miRNA與肺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性及CLC、PLC患者灌洗液中miRNA表達(dá)差異

miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的相對(duì)分子質(zhì)量較小的非編碼蛋白R(shí)NA分子。人類基因組中，miRNA占比僅1%～3%，但卻調(diào)控30%以上蛋白編碼基因表達(dá)[16]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已發(fā)現(xiàn)的miRNA中，約50%編碼基因位于腫瘤相關(guān)脆性位點(diǎn)或基因區(qū)域，可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[17]。Hou等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155表達(dá)增高可促進(jìn)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖，并抑制叉頭框蛋白1(FoxO1)表達(dá)，進(jìn)而刺激活性氧(ROS)產(chǎn)生。Li等[19]研究顯示，弗蘭德白血病病毒整合素l(FLI1)通過激活miR-17-92簇發(fā)揮促腫瘤形成作用。miR-205、miR-545、miR-25等與肺癌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)[20,21]。本研究在上述研究的基礎(chǔ)上探討了虛擬導(dǎo)航超聲氣管鏡灌洗液miRNA在CLC和PLC患者中的表達(dá)差異，以研究二者可能發(fā)病機(jī)制的差異。本研究數(shù)據(jù)顯示，PLC患者miR-1260b表達(dá)較低，miR-135a-3p、miR-3175表達(dá)較高，有望通過進(jìn)一步深入研究上述miRNA從而尋找肺癌靶向治療新靶點(diǎn)。

3.4 灌洗液中miRNA診斷PLC及是否轉(zhuǎn)移的效能

本研究數(shù)據(jù)顯示，miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175與PLC顯著相關(guān)，且對(duì)PLC具有一定診斷價(jià)值，尤以聯(lián)合診斷AUC值最高(達(dá)0.899)，進(jìn)一步顯示測(cè)定miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175表達(dá)可為PLC診斷提供有力參考。肺癌臨床病例資料分析發(fā)現(xiàn)，PLC總生存期好于CLC[22,23]。PLC預(yù)后由多種因素決定，相關(guān)因素有吸煙史、年齡、TNM分期、分化程度、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等[24]。目前研究發(fā)現(xiàn)，miRNA(如has-miR-155、miRNA-31等)也能作為肺癌獨(dú)立預(yù)后因素[25,26]。本研究創(chuàng)新性探討發(fā)現(xiàn)，PLC轉(zhuǎn)移患者的肺泡灌洗液中miR-1260b、miR-299-3p降低，miR-135a-3p、miR-3175升高，且各指標(biāo)診斷PLC是否轉(zhuǎn)移的AUC值均較高，推測(cè)miR-1260b、miR-299-3p可能作為抑癌基因，miR-135a-3p、miR-3175可能作為癌基因，通過控制細(xì)胞分化或凋亡途徑，參與PLC轉(zhuǎn)移病理過程。同時(shí)，各指標(biāo)聯(lián)合診斷PLC轉(zhuǎn)移的AUC值為0.888，大于單一診斷，有助于早期檢出PLC轉(zhuǎn)移。

此外，miR-1260b與肺癌經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物CEA和NSE呈負(fù)相關(guān)，miR-135a-3p、miR-3175與CEA和NSE呈正相關(guān)，從側(cè)面表明灌洗液miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175表達(dá)可為肺癌患者診斷及預(yù)后評(píng)估提供有力參考。而各灌洗液miRNA的相關(guān)性系數(shù)r，周圍型組均大于中心型組，考慮與虛擬導(dǎo)航超聲氣管鏡可準(zhǔn)確收集PLC病灶部位灌洗液有關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)虛擬導(dǎo)航超聲支氣管鏡對(duì)PLC診斷的應(yīng)用價(jià)值。

綜上可知，PLC、CLC患者虛擬導(dǎo)航超聲支氣管鏡灌洗液miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175存在差異表達(dá)，聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PLC診斷具有重要價(jià)值，而miR-1260b、miR-135a-3p、miR-299-3p、miR-3175聯(lián)合檢測(cè)可預(yù)測(cè)PLC轉(zhuǎn)移，為臨床診治提供依據(jù)。