蛋白酶抑制劑對(duì)含水生菜種子耐凍性的影響

鮑紅艷，于 影，鄧佳寶，劉寶林，韓穎穎

(上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院／生物醫(yī)學(xué)技術(shù)研究院，上海 200093)

植物種子根據(jù)貯藏特性的不同可以分為3類：正常型、頑拗型和中間型[1]。正常型種子含水量較低，不易被低溫所影響，因此種子自身對(duì)于低溫脅迫具有一定的抵抗能力[2]。相反，頑拗型種子在發(fā)育末期不經(jīng)歷成熟脫水，脫落時(shí)水分含量較高，對(duì)低溫和脫水較敏感，因此脫水和低溫對(duì)其影響較大[3]。頑拗型種子長(zhǎng)期貯藏困難較大，對(duì)頑拗型種子貯藏的研究具有重要意義。生菜(Lactuca sativa)種子是正常型種子，但含水生菜種子能模擬頑拗型種子的含水狀況，是研究種子含水量和低溫保存關(guān)系的模式材料[4]。

植物種子在低溫條件下會(huì)產(chǎn)生一定的抗冷反應(yīng)，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，調(diào)節(jié)有關(guān)蛋白質(zhì)合成，提高種子內(nèi)超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)和過(guò)氧化氫酶(Catalase, CAT)活性、產(chǎn)生新的蛋白成分、積累更小分子量球蛋白多肽等，進(jìn)而提高種子抗凍性[5]。當(dāng)種子受到低溫冷害時(shí)，種子內(nèi)的變化最先且主要發(fā)生在細(xì)胞膜上[6]。研究表明，提高種子內(nèi)SOD活性以及提高羥自由基清除能力有利于維持機(jī)體內(nèi)自由基平衡，穩(wěn)定植物細(xì)胞膜[7—8]。Laskowski等[9]研究表明，蛋白酶抑制劑可阻止生物細(xì)胞膜發(fā)生不良蛋白水解反應(yīng)。許雷等[10]提出蛋白酶抑制劑的靶標(biāo)主要是植物體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶，即巰基蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶負(fù)責(zé)逆境脅迫下受損或者變性蛋白的降解，為新蛋白合成提供肽段或游離氨基酸[11]。蛋白酶抑制劑可防止植物體內(nèi)不必要的蛋白質(zhì)降解[12]。2-硝基苯甲酸[5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]是蛋白酶抑制劑，是一種巰基修飾劑，與巰基反應(yīng)形成二硫鍵[13—14]。半胱氨酸蛋白酶抑制劑DTNB處理可促進(jìn)種子貯藏蛋白水解，顯著抑制球蛋白水解[15]。目前，關(guān)于低溫脅迫下添加外源DTNB對(duì)種子生理活性的研究未見報(bào)道。

不同降溫速率對(duì)低溫保存的種子質(zhì)量造成影響[16]。含水生菜種子受低溫脅迫時(shí)有兩種耐凍機(jī)制，慢速降溫下，種子由于外部先結(jié)冰而使胚趨于干燥進(jìn)而保護(hù)種子[17]；快速降溫下，種子采用過(guò)冷機(jī)制降低冰晶形成的溫度[18]。種子受到低溫脅迫時(shí)，種子胞內(nèi)形成冰晶從而對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷[19]?？箖龅鞍资且活惪梢砸种票L(zhǎng)的蛋白，可減輕低溫?fù)p傷。植物在抗寒時(shí)合成小分子量抗凍蛋白，以提高其抗寒性能[5,20]。外源添加2-硝基苯甲酸能否使低溫下種子產(chǎn)生新的蛋白成分并不明確。

本研究通過(guò)添加外源DTNB研究低溫條件下含水生菜種子的發(fā)芽率、生理活性變化以及種子胞內(nèi)形成的冰晶熱物性；對(duì)新產(chǎn)生的蛋白成分進(jìn)行質(zhì)譜分析和鑒定，以及探討小分子量球蛋白多肽對(duì)種子耐凍性的影響，旨在為研究外源蛋白酶抑制劑調(diào)控種子球蛋白降解的生物學(xué)機(jī)理奠定基礎(chǔ)，也為開發(fā)種子低溫保護(hù)劑提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

羅莎綠生菜(Lactuca sativa)種子購(gòu)自北京鳳鳴雅世科技發(fā)展有限公司。

試劑：瓊脂粉、DTNB、硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、水楊酸、甲硫氨酸、過(guò)氧化氫(30%)、核黃素、SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、Tris-HCl (pH 6.8)、PAGE膠蛋白微量回收試劑盒等，均購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。

儀器：PLANERkryo360-1.7程序降溫儀(英國(guó))、GZX-250B光照培養(yǎng)箱(中國(guó)通利信達(dá))、微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó))、Powerpac Basic 電泳儀(美國(guó))、DSC儀器(美國(guó))、低溫顯微鏡(日本)等。

1.2 方法

1.2.1 常溫下DTNB處理生菜種子吸脹后含水量測(cè)定

配制 DTNB 濃度為 0、0.1、1、2、5 mmol·L–1，1%瓊脂培養(yǎng)基。每份0.2 g羅莎綠生菜種子撒入培養(yǎng)皿中，放在常溫(21 ℃)、光照強(qiáng)度 30 μmol·m–2·s–1的光照培養(yǎng)箱中吸脹處理，吸水11 h，此時(shí)種子完全吸水但未發(fā)芽[21]。取材后擦干表面水分，立即放入烘箱內(nèi)103 ℃烘17 h。每個(gè)樣品做3組平行。

1.2.2 常溫下含水生菜種子發(fā)芽率測(cè)定

生菜種子按照1.2.1吸脹處理，每樣品取25粒種子播種至培養(yǎng)基，3組平行。在1.2.1光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)5 d觀察發(fā)芽情況[22]。

1.2.3 慢速降溫下含水生菜種子發(fā)芽率測(cè)定

種子按照1.2.1吸脹處理后，擦干表面水分，分別裝入1.5 mL EP管中，放入程序降溫儀慢速降溫，降溫程序見表1。降溫結(jié)束后室溫放置30 min，種子播種處理同1.2.2。

表1 程序慢速降溫參數(shù)設(shè)置Table 1 Parameter setting during slow program cooling

1.2.4 慢速降溫至不同溫度梯度時(shí)含水生菜種子發(fā)芽率的測(cè)定

外源添加 0、2 mmol·L–1DTNB，同 1.2.3 對(duì)生菜種子進(jìn)行吸脹和降溫處理。溫度分別降至–13 ℃、–15 ℃、–17 ℃、–20 ℃后，室溫放置 30 min。按照1.2.2播種并測(cè)定發(fā)芽率。

1.2.5 含水生菜種子生理活性測(cè)定

外源添加 0、2 mmol·L–1DTNB 的生菜種子按1.2.4慢速降溫至–20 ℃。采用氮藍(lán)四唑比色法測(cè)定種子SOD活性[23]，通過(guò)Fenton反應(yīng)測(cè)定種子羥基自由基清除能力[24]。以相同條件常溫的含水生菜種子為對(duì)照。

1.2.6 含水生菜種子熱物性分析

外源添加 0、2 mmol·L–1DTNB，同 1.2.1 吸脹處理。取一顆飽滿的生菜種子于培養(yǎng)皿中，進(jìn)行差示掃描量熱法(Differential scanning calorimeter，DSC)實(shí)驗(yàn)，降溫程序同文獻(xiàn)[25]。

1.2.7 差異蛋白點(diǎn)測(cè)定

外源添加 0、2 mmol·L–1DTNB，同 1.2.3 對(duì)種子吸脹處理后降溫至–20 ℃。用TCA丙酮沉淀法抽提種子總蛋白。根據(jù)丁玉嬌[23]雙向電泳操作程序設(shè)置參數(shù)，對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定(生工生物工程(上海)有限公司)。利用Bio Tools軟件搜索NCBI prot數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找相匹配的蛋白質(zhì)[26]。

1.2.8 含水生菜種子球蛋白提取及SDS-PAGE圖譜

同 1.2.7吸脹和程序降溫處理的含水生菜種子進(jìn)行球蛋白提取和SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)，電泳條件參考Han等[25]的方法并作改進(jìn)，先80 V、20 min然后120 V、80 min。

1.2.9 球蛋白多肽提取液處理的種子發(fā)芽率測(cè)定

采用PAGE膠蛋白微量回收試劑盒將1.2.8球蛋白多肽回收?；厥盏牟煌笮》肿恿壳虻鞍锥嚯奶崛∫?，每個(gè)條帶做3組平行，分別取60 μL加入培養(yǎng)基中，種子吸脹和降溫處理同 1.2.3。按照 1.2.2播種并測(cè)定發(fā)芽率。

1.2.10 球蛋白多肽熱物性測(cè)定

對(duì)1.2.9球蛋白多肽提取液進(jìn)行DSC實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品提取液取10 μL放在皿中，每組樣品做3組平行。DSC的慢速降溫程序同1.2.6。

1.2.11 球蛋白多肽的冰晶顯微觀察

將1.2.9回收的球蛋白多肽進(jìn)行低溫顯微觀察，每組取3 μL置于低溫顯微鏡的載玻片上，降溫速率為 1 ℃·min–1，觀察冰晶形成的起始溫度和放熱焓值。每組樣品做3組平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 常溫下DTNB處理生菜種子吸脹后含水量的變化

生菜種子在吸水 12 h后發(fā)芽，因此選取吸水11 h種子進(jìn)行含水量測(cè)定，吸脹后生菜種子含水量見表2。常溫下不同濃度DTNB對(duì)生菜種子吸脹含水量無(wú)顯著影響，種子含水量維持在50%左右。因此可以保證后續(xù)慢速程序降溫實(shí)驗(yàn)中生菜種子的耐凍性不受含水量差異的影響。

表2 不同濃度DTNB吸脹處理后生菜種子含水量及發(fā)芽率Table 2 Water content and germination rate of Lactuca sativa seeds with different concentration of DTNB treatments

2.2 常溫下含水生菜種子發(fā)芽率的變化

發(fā)芽率是衡量種子活性的指標(biāo)之一。常溫下不同濃度 DTNB對(duì)生菜種子發(fā)芽沒有影響(P>0.05)，其發(fā)芽率均為92%左右(表2)。

2.3 慢速降溫下含水生菜種子發(fā)芽率的變化

慢速程序降溫可以模擬自然界低溫脅迫等環(huán)境下的溫度變化。采用不同濃度DTNB對(duì)生菜種子進(jìn)行吸脹處理，慢速降溫條件下將生菜種子從常溫降溫至–20 ℃，觀察生菜種子的發(fā)芽情況，以發(fā)芽率為指標(biāo)篩選保護(hù)效果最佳的DTNB濃度。外源添加0、0.1、1、2、5 mmol·L–1DTNB 處理生菜種子，吸脹后經(jīng)程序降溫，2 mmol·L–1DTNB處理的種子發(fā)芽率最高，表明2 mmol·L–1DTNB對(duì)低溫脅迫環(huán)境下生菜種子抗凍性的保護(hù)效果最佳(P<0.01)，即在此濃度下種子會(huì)做出抗冷反應(yīng)來(lái)抵御低溫?fù)p傷。后續(xù)選取 2 mmol·L–1DTNB 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4 慢速降溫至不同溫度時(shí)含水生菜種子發(fā)芽率的變化

通過(guò)慢速降溫設(shè)置低溫梯度及外源添加2 mmol·L–1DTNB處理種子，根據(jù)發(fā)芽率和低溫傷害指標(biāo)確定含水生菜種子的致死溫度及DTNB對(duì)種子抗凍性的影響。溫度降至–13 ℃、–15 ℃、–17℃時(shí)，2 mmol·L–1DTNB處理的生菜種子發(fā)芽率與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖1)；當(dāng)溫度降至–20 ℃時(shí)，對(duì)照組發(fā)芽率大幅度下降，約下降 3 0%。降溫至–20 ℃時(shí)，對(duì)照組含水生菜種子發(fā)芽率僅為8.89%，2 mmol·L–1DTNB處理組的發(fā)芽率為37.78%，對(duì)照組與外源添加DTNB處理的生菜種子發(fā)芽率存在極顯著差異(P<0.01)(圖1)。表明溫度降至–20 ℃時(shí)含水生菜種子自身無(wú)法抵御低溫?fù)p傷，造成種子幾乎處于死亡狀態(tài)，推測(cè)–20 ℃是影響含水生菜種子發(fā)芽的致死溫度。

圖1 DTNB吸脹與不同溫度對(duì)生菜種子發(fā)芽率的影響Fig. 1 Germination rate of Lactuca sativa seeds treated with DTNB (2 mmol·L–1) under slow program cooling

2.5 DTNB對(duì)含水生菜種子抗氧化活性的影響

常溫下，對(duì)照組生菜種子SOD活性較低。慢速降溫至–20℃時(shí)，對(duì)照組的SOD活性有所提高，表明低溫脅迫下細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更多的活性氧和羥基自由基(圖2: A)。

圖2 DTNB(2 mmol·L–1)對(duì)生菜種子抗氧化活性的影響Fig. 2 Effect of DTNB (2 mmol·L–1) treatment on antioxidant activity of Lactuca sativa seeds

外源添加2 mmol·L–1DTNB時(shí)，常溫下含水生菜種子 SOD活性是對(duì)照的 3倍，存在極顯著差異(P<0.01)；程序降溫至–20 ℃時(shí)，生菜種子的 SOD值與對(duì)照相比提高約 1.38倍，二者差異極顯著(P<0.01) (圖2: A)。說(shuō)明外源添加 2 mmol·L–1DTNB時(shí)促使種子在早期產(chǎn)生較高的 SOD活性可抵御低溫對(duì)種子造成的冷凍損傷?？梢姺N子內(nèi)SOD活性提高可提高種子耐凍性，這也是外源添加DTNB能對(duì)種子提供低溫保護(hù)的原因。

生菜種子羥基自由基的清除能力變化也表現(xiàn)出與SOD活性相似的規(guī)律。常溫下對(duì)照組羥基自由基清除率為25.90%，經(jīng)慢速程序降溫后，對(duì)照組的羥基自由基清除能力提高至32.01%，表明程序降溫后種子內(nèi)產(chǎn)生更多的抗氧化酶來(lái)清除細(xì)胞因低溫?fù)p傷產(chǎn)生的羥基自由基(圖2: B)。常溫下外源添加2 mmol·L–1DTNB時(shí)，羥基自由基清除率提高約1.17倍，經(jīng)慢速程序降溫處理后，羥基自由基的清除能力變化不顯著。表明外源添加2 mmol·L–1DTNB在早期已提高清除種子內(nèi)因低溫產(chǎn)生的羥基自由基，使機(jī)體盡量減少因羥基自由基大幅度增加而造成的低溫?fù)p傷。

2.6 含水生菜種子熱物性變化

外源添加2 mmol·L–1DTNB對(duì)生菜種子吸脹處理，吸脹后對(duì)種子進(jìn)行 DSC實(shí)驗(yàn)，降溫速率為3 ℃·h–1，對(duì)照組第一個(gè)放熱峰形成時(shí)溫度為–15 ℃左右，即胞內(nèi)冰晶形成的起始溫度約為–15 ℃(表3)。經(jīng)2 mmol·L–1DTNB處理后含水生菜種子放熱峰起始溫度也在–15 ℃左右，溫度變化不顯著。DSC測(cè)得的結(jié)晶峰放熱焓值代表水分結(jié)冰所釋放的熱量，即放熱焓值絕對(duì)值越大，種子形成的冰晶越大，對(duì)種子的損傷亦越大。

表3 慢速降溫下生菜種子胞內(nèi)形成冰晶的溫度及放熱焓值Table 3 Ice crystal formation temperature and exothermic han value of 2 mmol·L–1 DTNB treatment during slow paragram cooling

對(duì)照組生菜種子形成兩個(gè)結(jié)晶峰，其總放熱焓值絕對(duì)值為 101.87 J·g–1，而外源添加 2 mmol·L–1DTNB組生菜種子只出現(xiàn)一個(gè)結(jié)晶峰，放熱焓值絕對(duì)值較低(表3)。以上表明在慢速降溫條件下，外源添加2 mmol·L–1DTNB吸脹處理的含水生菜種子耐凍性比對(duì)照組強(qiáng)，即與對(duì)照組相比，種子胞內(nèi)水分含量更低，種子胚處于更干燥的狀態(tài)，胞內(nèi)形成的冰晶更小，對(duì)種子的低溫?fù)p傷較小，故種子活性較強(qiáng)，發(fā)芽率更高(圖1)。

2.7 差異蛋白點(diǎn)分析

提取慢速降溫條件下生菜種子蛋白進(jìn)行雙向電泳，發(fā)現(xiàn)外源添加2 mmol·L–1DTNB組的蛋白條帶與對(duì)照組存在兩個(gè)差異蛋白點(diǎn)(圖3)。對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，表明蛋白點(diǎn)1為11S 種子貯藏球蛋白Jug r4(XP_023733339.1)，蛋白點(diǎn)2為11S 種子貯藏球蛋白2 (XP_023769779.1)，兩個(gè)差異蛋白點(diǎn)都屬于球蛋白家族，分子量集中在 14.4～18.4 kDa。表明外源添加2 mmol·L–1DTNB 可促進(jìn)生菜種子貯藏蛋白的水解，水解成單個(gè)小分子的球蛋白多肽。低溫下外源添加2 mmol·L–1DTNB 之所以使種子產(chǎn)生抗凍性也可能與種子內(nèi)貯藏蛋白降解為小分子量球蛋白多肽有關(guān)。

圖3 DTNB吸脹處理生菜種子差異蛋白點(diǎn)Fig. 3 Differential protein spot stripe of DTNB treatment in Lactuca sativa seeds

表4 DTNB吸脹處理生菜種子差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜分析鑒定Table 4 Identification of differential ptotein points by mass spectrometry in Lactuca sativa seeds treated with DTNB

2.8 含水生菜種子球蛋白多肽的積累

慢速程序降溫條件下，對(duì)照組與外源添加2 mmol·L–1DTNB 含水生菜種子球蛋白SDS-PAGE 電泳圖譜見圖4。基于分子量的球蛋白電泳條帶顯示。對(duì)照組與外源添加2 mmol·L–1DTNB含水生菜種子球蛋白電泳圖譜的較大分子量集中在30～45 kDa，中等分子量集中在20～30 kDa，較小分子量集中在14.4～18.4 kDa。與對(duì)照組相比，外源添加2 mmol·L–1DTNB可以促進(jìn)種子貯藏蛋白降解為更小分子量(18.4 kDa以下)的球蛋白多肽。這與圖3雙向電泳蛋白點(diǎn)分析結(jié)果一致，外源添加2 mmol·L–1DTNB吸脹處理的生菜種子，具有較多分子量18.4 kDa以下的球蛋白多肽積累。

圖4 慢速降溫下不同處理含水生菜種子球蛋白SDS-GAGE電泳條帶Fig. 4 SDS-PAGE electrophoretic bands of globulin in aqueous lettuce seeds under slow cooling of different treatments

2.9 小分子量球蛋白多肽提取液吸脹對(duì)種子發(fā)芽率的影響

檢測(cè)圖4回收的小分子量球蛋白多肽提取液對(duì)慢速程序降溫的生菜種子發(fā)芽率的影響，DTNB+球蛋白組處理吸脹后的生菜種子發(fā)芽率為 25.88%±0.88%，與對(duì)照組相比發(fā)芽率存在顯著差異(P<0.05)(表5)。表明DTNB組中積累的小分子量球蛋白多肽可以提高慢速程序降溫后的含水生菜種子發(fā)芽率，小分子量球蛋白多肽提取液可提高種子的低溫耐受性和抗凍性。

表5 小分子量球蛋白多肽對(duì)發(fā)芽率的影響Table 5 Effect of small molecular globulin polypeptide on germination rate of Lactuca sativa seeds

2.10 不同分子量球蛋白多肽的熱物性分析

差示掃描量熱法實(shí)驗(yàn)(DSC)表明，不同分子量球蛋白多肽(C1、C2、C3、C4、CD)形成冰晶時(shí)放熱峰的起始溫度在上升。慢速降溫條件下，對(duì)照組C1球蛋白多肽在–36 ℃左右出現(xiàn)冰晶，當(dāng)C4球蛋白多肽的放熱峰出現(xiàn)時(shí)起始溫度已上升至–22 ℃(表6)。DTNB組中最小分子量球蛋白多肽CD放熱峰出現(xiàn)時(shí)溫度已上升至–18 ℃左右。冰晶形成的起始溫度上升，則種子在低溫環(huán)境下對(duì)溫度的敏感性降低，即減少了低溫脅迫對(duì)其造成的損傷。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞外會(huì)先于細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，胞內(nèi)水分滲透到細(xì)胞外，使胚趨于干燥狀態(tài)從而在低溫脅迫條件下保護(hù)種子。C1～C4放熱峰的總放熱焓值增大，胞內(nèi)更多的水分滲透到胞外，胞內(nèi)水分不斷減少，使胚趨于干燥狀態(tài)。胞內(nèi)水分活度越低，種子在低溫脅迫條件下更容易存活下來(lái)。這也是外源添加2 mmol·L–1DTNB吸脹處理后經(jīng)降溫后種子內(nèi)積累的小分子量球蛋白多肽 CD與對(duì)照組積累的小分子量球蛋白多肽相比可以使生菜種子在低溫下產(chǎn)生抗凍性的原因。

表6 不同大小分子量球蛋白多肽的DSC實(shí)驗(yàn)Table 6 DSC experiments of globulin polypeptides with different molecular weights

2.11 不同分子量球蛋白多肽冰晶的顯微變化

為了進(jìn)一步驗(yàn)證不同分子量球蛋白多肽胞內(nèi)冰晶形成大小以及冰晶形成時(shí)的起始溫度，對(duì)不同分子量球蛋白多肽進(jìn)行低溫顯微鏡觀察。球蛋白多肽C1、C2、C3、C4、CD形成的冰晶隨著分子量減小逐漸變小(圖5)。C1形成的冰晶呈枝狀且遍布整個(gè)視野，枝狀冰晶對(duì)種子的損害作用大；C2形成的冰晶變得圓潤(rùn)且遍布整個(gè)視野，圓潤(rùn)冰晶比枝狀冰晶對(duì)種子的低溫?fù)p害作用小；C3和 C4形成的冰晶也呈圓形，但C4形成的冰晶更小，即對(duì)種子的損傷小；與C4相比，外源添加DTNB積累的小于18.4 kDa球蛋白多肽CD形成的冰晶更小更圓潤(rùn)，即對(duì)種子的低溫?fù)p害最小，與球蛋白多肽提取液吸脹種子程序降溫后發(fā)芽率較高的結(jié)果相一致。說(shuō)明球蛋白多肽分子量越小對(duì)種子的保護(hù)效果更佳，同時(shí)驗(yàn)證了在低溫脅迫環(huán)境下，外源添加2 mmol·L–1DTNB的種子吸脹后，積累的小分子量球蛋白多肽能提高種子的抗凍能力。

圖5 不同分子量球蛋白多肽在低溫下形成的冰晶形狀Fig. 5 Low temperature microscope experiment of globulin polypeptides with different molecular weights

3 討論

低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致種子機(jī)械損傷甚至死亡，可通過(guò)添加冰凍保護(hù)劑維持低溫條件種子的活力[27—28]。常用的冰凍保護(hù)劑有二甲基亞砜(DMSO)、蔗糖、甘油等，但都存在一定的不足，如對(duì)不同種類的細(xì)胞具有一定的毒性。本研究采用外源添加蛋白酶抑制劑DTNB處理生菜種子，探討其通過(guò)慢速程序降溫時(shí)抗凍能力。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度降至–20 ℃時(shí)，生菜種子幾乎處于死亡狀態(tài)。Han等[25]研究表明，慢速降溫條件下–20 ℃是含水生菜種子的致死溫度。而外源添加 2 mmol·L–1DTNB 的含水生菜種子在–20℃時(shí)發(fā)芽效果顯著，即 2 mmol·L–1DTNB 可提高種子的抗凍性。

植物遭受逆境脅迫時(shí)施加外源物質(zhì)可在一定程度上調(diào)節(jié)抗氧化酶活性，增強(qiáng)植物體抗逆性[19]。植物在低溫下會(huì)表現(xiàn)出一定的抗寒性，SOD是機(jī)體清除活性氧的第一道防線[19]，其活性增強(qiáng)可清除植物體在低溫下產(chǎn)生的 ROS和羥基自由基等物質(zhì)以提高機(jī)體抗寒能力[29]。Anwar等[30]研究表明，外源添加5-氨基乙酰丙酸(ALA)可提高植物體的抗氧化酶活性，穩(wěn)定丙二醛和 ROS的積累。本研究發(fā)現(xiàn)外源添加2 mmol·L–1DTNB在初期就可以提高種子內(nèi)抗氧化酶活性，有效緩解植物在冷應(yīng)激中受到的損傷。

外源添加DTNB吸脹處理的含水生菜種子再經(jīng)低溫–20 ℃脅迫后，其發(fā)芽率與對(duì)照組明顯提高。DSC差示掃描量熱法測(cè)定顯示，對(duì)照組生菜種子形成兩個(gè)放熱峰，即種子內(nèi)有兩次形成冰晶。根據(jù)Jaganathan等[31]的研究，第一個(gè)放熱峰是胚乳中冰晶形成，第二個(gè)放熱峰是胚胎中冰晶形成。胚胎中更多的冰晶形成將導(dǎo)致種子受到更大的傷害[31]。添加2 mmol·L–1DTNB吸脹處理的生菜種子只在胚乳中形成一次放熱峰，胚胎中未形成冰晶。因此減少了胚胎中冰晶對(duì)種子的傷害，這也是外源添加2 mmol·L–1DTNB可以提高種子抗凍性的原因。

植物體貯藏蛋白中球蛋白的含量最高[32]，種子貯藏蛋白在種子萌發(fā)初期發(fā)生水解，生成氨基酸并為種子萌發(fā)提供營(yíng)養(yǎng)。植物貯藏蛋白的水解離不開蛋白酶的作用[33]，主要包括半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶等。以球蛋白為例，半胱氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶對(duì)種子球蛋白進(jìn)行降解，以半胱氨酸蛋白酶抑制劑如碘乙酸(JAA)、DTNB處理促進(jìn)貯藏蛋白水解，顯著抑制球蛋白降解[15]。本研究雙向電泳實(shí)驗(yàn)表明，DTNB促進(jìn)生菜種子貯藏蛋白降解為小分子量的球蛋白亞基，促進(jìn) 11S 種子貯藏球蛋白Jug r4 (XP_023733339.1)和 11S 種子貯藏球蛋白 2(XP_023769779.1)兩種球蛋白的積累。SDS-PAGE電泳圖也同樣顯示外源添加DTNB后種子內(nèi)有更多的分子量低于18.4 kDa球蛋白多肽積累。種子貯藏球蛋白的水解參與保護(hù)種子免受氧化應(yīng)激[34]，而且分子量小的多肽比分子量較大的多肽表現(xiàn)出更高的抗氧化活性[35—36]。這也是外源添加DTNB在低溫條件下可以使含水生菜種子產(chǎn)生抗凍性的原因之一。