豬肉和雞肉中11種同化激素殘留超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定

張家華，方炳虎，王敏儒*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642)

同化激素是一類具有強(qiáng)的蛋白質(zhì)同化作用，可抑制異化或氧化代謝，提高蛋白質(zhì)沉積的甾體類物質(zhì)，具有重要的殘留毒理學(xué)意義。在養(yǎng)殖業(yè)濫用最普遍的主要有睪酮、甲基睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、康力龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮及苯丙酸諾龍等[1-2]。由于它們能提高飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉生產(chǎn)率，一些從業(yè)者在利益驅(qū)使下將其用作畜禽的促生長(zhǎng)劑[3]。雄性激素可損害人的肝功能，影響心血管系統(tǒng)，傷害人體的生殖系統(tǒng)，引起內(nèi)分泌功能障礙等，過量攝入性激素還可能對(duì)青少年的神經(jīng)系統(tǒng)和心理行為發(fā)展造成不可逆轉(zhuǎn)的損害[4-6]。原農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第178號(hào)公告明確指出不得在動(dòng)物飼料和飲食中添加苯丙酸諾龍等藥物[7]。但目前非法將這類藥物用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖上的報(bào)道仍時(shí)有發(fā)生。

國(guó)內(nèi)外主要采用液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物組織中的睪酮、甲睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、司坦唑醇、丙酸諾龍、丙酸睪酮及苯丙酸諾龍等同化激素[8-13]。目前我國(guó)對(duì)于上述11種同化激素在豬肉、雞肉中的多殘留檢測(cè)報(bào)道相對(duì)較少，參考現(xiàn)有的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008[14])，本研究在參考文獻(xiàn)基礎(chǔ)上對(duì)儀器參數(shù)和樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，擬建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS),以期能夠同時(shí)測(cè)定雞肉、豬肉中睪酮等11種同化激素，為批量檢測(cè)樣品中睪酮等違禁藥物的殘留量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 睪酮、甲睪酮、群勃龍、諾龍、美雄酮、丙酸諾龍標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr．Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；勃地龍，美國(guó)CATO公司產(chǎn)品；丙酸睪酮、康力龍、黃體酮，中國(guó)食品藥品檢定研究所產(chǎn)品；苯丙酸諾龍標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)IL公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑 甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純，德國(guó)Merk公司產(chǎn)品；乙酸乙酯、叔丁基甲醚、無水乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；Triple QuadTM4500液質(zhì)聯(lián)用儀，AB SCIEX公司產(chǎn)品，配Analyst1.6.3軟件；CPA225D電子天平，賽多利斯科學(xué)技術(shù)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品；ST16R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；JE1002電子天平，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司產(chǎn)品；R205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司公司產(chǎn)品；N-VEVAP 24位氮吹儀，美國(guó)Organomation公司產(chǎn)品；MS3普通型旋渦混合器，廣州儀科實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)，Merck Millipore公司產(chǎn)品；WAT200677固相萃取裝置，Waters公司產(chǎn)品；Agilent C18固相萃取小柱(200 mg，3 mL)，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1.1 同化激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制 準(zhǔn)確稱取睪酮、甲睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、康力龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍10 mg(按實(shí)際含量折算，精確至0.0001)置于10 mL容量瓶中，用純甲醇溶液溶解并稀釋，配成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置-20℃下保存。

1.2.1.2 同化激素混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制 從配制好的同化激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中，各自取1.0 mL的同化激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，甲醇定容至20 mL，配制成50 μg/mL的混標(biāo)儲(chǔ)備液，置-20℃下保存。用甲醇稀釋備用。

1.2.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸乙腈，B相為0.1%甲酸水溶液；柱溫：37℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.25 mL/min；梯度洗脫程序:0 min～1 min,30%～55% A；1 min～3 min,55% A；3 min～6 min,55%～98% A；6 min～12 min,98% A；12 min～12.5 min,98%～30% A；12.5 min～15 min,30% A。質(zhì)譜條件：電噴霧電離(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；電噴霧電壓(IS)5500V，霧化氣壓力(GSl)65 psi，輔助器流速(GS2)60 L/rain，氣簾氣壓力(CUR)30 psi，離子源溫度(TEM)550℃，碰撞室壓力(CAD)8 psi。去簇電壓、碰撞能量及定量離子對(duì)、定性離子對(duì)等參數(shù)見表1。

表1目標(biāo)化合物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)

1.2.3 樣品測(cè)定

1.2.3.1 樣品制備 將雞肉、豬肉的可食用組織部分盡可能地去除筋膜和脂肪后，切成小塊，用絞肉機(jī)絞碎，置-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 樣品提取 精確稱取2 g(精確至0.001 g)勻漿好的組織于50 mL 聚丙烯離心管中，加入10 mL 甲醇-乙腈(1∶1，v/v)，渦旋混勻，超聲提取10 min，以6000 r/min 離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 聚丙烯離心管中，重復(fù)提取一次。合并提取液，置-20℃下，冷凍2 h。以10000 r/min，離心10 min。

1.2.3.3 樣品凈化 將“1.2.3.2”中提取的上清液于37℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸至近干，加4 mL 30%乙腈水溶解，備用。將上述溶液加到C18固相萃取柱凈化(3 mL甲醇、3 mL水活化，6 mL 30%甲醇水淋洗)，抽干后，加入4 mL乙腈洗脫，置-20℃下冷凍1 h。以15000 r/min，離心10 min。于37℃水浴下氮?dú)饩徛蹈伞＜尤? mL 30%乙腈復(fù)溶，渦旋2 min，上清液過0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.2.3.4 檢測(cè)限與定量限的測(cè)定 分別制備0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2 μg/kg的添加樣品，每個(gè)濃度重復(fù)3次，前處理后。經(jīng)UPLC-MS/MS檢測(cè)，從基質(zhì)添加樣品中檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)的最小濃度為檢測(cè)限(limit of detection，LOD)，被定義為信噪比S/N≥3。根據(jù)其檢測(cè)限以同樣的方法確定其定量限，基質(zhì)添加樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量為定量限(Limit of Quantitation，LOQ)，被定義為S/N≥10。

1.2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取空白樣品7份，進(jìn)行前處理，制備空白基質(zhì)液。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用初始流動(dòng)相稀釋成1000、500、200、100、50、20、10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。取空白基質(zhì)液對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行稀釋，制得濃度為100、50、20、10、5、 2、1 μg/kg的空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度重復(fù)3次，共做3個(gè)批次。

1.2.3.6 回收率與精密度 準(zhǔn)確稱取2 g(精確至 0.001 g)空白基質(zhì)，添加適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 100 μL，制備成10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg的添加濃度。每個(gè)添加濃度做5個(gè)重復(fù)，連續(xù)做3個(gè)批次，添加提取劑進(jìn)行提取，其他按照上述前處理方法進(jìn)行處理。同時(shí)制得10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg的空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用單點(diǎn)定量法，按照回收率計(jì)算公式計(jì)算各添加水平下的回收率。每組5個(gè)平行樣品回收率之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是批內(nèi)精密度(RSD)，3個(gè)批次的添加樣品回收率之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是批間精密度(RSD)。

2 結(jié)果

2.1 液相條件

試驗(yàn)中采用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相，可實(shí)現(xiàn)對(duì)11種同化激素激素類藥物的分離，藥物的沒有拖尾現(xiàn)象，且峰形對(duì)稱，圖1為11種同化激素在豬肉中的MRM離子流色譜圖。

2.2 方法線性范圍、檢出限和定量限

在1 μg/kg～100 μg/kg濃度內(nèi)，豬肉和雞肉中各個(gè)藥物基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(R2>0.99)。按照方法規(guī)定進(jìn)行前處理，上機(jī)測(cè)定。在豬肉中，睪酮、甲睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、康力龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍的檢測(cè)限和檢出限分別為0.1 μg/kg～0.5 μg/kg和0.3 μg/kg～1 μg/kg。雞肉中，睪酮、甲睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、康力龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍的檢測(cè)限和檢出限分別為0.1 μg/kg～0.5 μg/kg和0.3 μg/kg～1 μg/kg。

圖111種同化激素在豬肉中的MRM色譜圖(10 μg/kg)

2.3 回收率和精密度

為消除或減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，按照“1.2.3.6”方法，采用空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，豬肉中11種藥物平均回收率為74.3%～101.1%，批間變異系數(shù)為6.0%～13.7%。雞肉中11種藥物平均回收率為70.1%～97.4%，批間變異系數(shù)為5.0%～12.3%。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

將建立的方法應(yīng)用于雞肉、豬肉各20個(gè)實(shí)際樣品的檢測(cè)，均未檢出睪酮等11種同化激素。

表2檢出限與定量限

3 討論

3.1 儀器條件選擇

3.1.1 MS/MS特征離子的選擇 對(duì)于動(dòng)物肌肉組織中多種甾體激素的分析，采用串聯(lián)質(zhì)譜MRM模式采集信號(hào)。在ESI+電離方式下，11種甾體激素都可形成穩(wěn)定的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，然后進(jìn)行相應(yīng)的子離子全掃描,以確定MRM特征診斷離子，11種甾體激素選擇的特征離子見表1，每種藥物選擇兩個(gè)離子對(duì)。

3.1.2 液相條件的優(yōu)化 基于超高效液相色譜分離的特點(diǎn)和要求，在優(yōu)化的流動(dòng)相條件下，11種甾體激素藥物在 15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好的分離，峰形對(duì)稱，不拖尾，圖1為11種激素在豬肉中的MRM離子流色譜圖?？紤]到同化激素容易受到內(nèi)源性干擾，選用的色譜柱不宜過短，因此選擇了長(zhǎng)度為150 mm的色譜柱。11種同化激素在溫度高于45 ℃時(shí)易于分解，而色譜柱溫度較低時(shí)分離洗脫效果較低，且出峰較慢。流動(dòng)相中加入適量的甲酸溶液有利于11種激素都可形成穩(wěn)定的[M+H]+準(zhǔn)分子離子。試驗(yàn)對(duì)比了有機(jī)溶劑乙腈/甲醇(A相)與水/0.1%甲酸水溶液(B相)分離目標(biāo)化合物的效果。在0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈流動(dòng)體系中，采用梯度洗脫，可實(shí)現(xiàn) 11種甾體激素藥物的快速分離，且峰形良好。

3.2 樣品前處理方法優(yōu)化

3.2.1 除脂 動(dòng)物組織含有的脂肪會(huì)影響檢測(cè)方法的靈敏度，本研究對(duì)比了使用乙腈飽和的正己烷和低溫冷凍兩種方法以及兩種方法相結(jié)合的除脂效果。當(dāng)使用乙腈飽和的正己烷進(jìn)行除脂，結(jié)果表明丙酸睪酮和丙酸諾龍的回收率均低于30%，而苯丙酸諾龍幾乎檢測(cè)不到，且其余8種藥物的回收率相對(duì)于用冷凍除脂的方法也有所降低，因此選擇冷凍除脂。

3.2.2 提取溶劑的選擇 試驗(yàn)對(duì)比了叔丁基甲醚、乙酸乙酯、甲醇、乙腈等溶劑或混合溶液的提取效果，發(fā)現(xiàn)叔丁基甲醚提取時(shí)，康力龍、丙酸睪酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍的回收率低于30%。乙酸乙酯提取時(shí)，康力龍、苯丙酸諾龍的回收率低于55%。以甲醇-乙腈(1∶1，v/v)提取時(shí)各個(gè)藥物的回收率較高，且易于濃縮，最終選擇甲醇-乙腈(1∶1，v/v)作為提取液。

3.2.3 固相萃取法的優(yōu)化

3.2.3.1 固相萃取柱的選擇 考慮到經(jīng)有機(jī)試劑提取肌肉組織容易得到較多雜物，本試驗(yàn)采用最常用的凈化方式固相萃取凈化。由于類物質(zhì)為中等極性或者弱極性，目前報(bào)道中[8-13]多采用MCX、HLB和C18固相萃取小柱。本試驗(yàn)對(duì)比了11種同化激素在MCX、HLB和C18兩種固相萃取小柱上吸附效果，當(dāng)使用 MCX 柱進(jìn)行凈化時(shí)，大部分藥物的回收率低于30%。與HLB固相萃取柱相比，各個(gè)藥物在C18固相萃取柱上回收率均較高，同時(shí)考慮其成本相對(duì)較低，最終選擇C18柱。

3.2.3.2 淋洗液的選擇 在固相萃取過程中，需要盡可能地洗掉的干擾組分，且需保證所測(cè)目標(biāo)化合物不被洗脫下來。本試驗(yàn)所測(cè)目標(biāo)化合物易溶于甲醇，選用的固相萃取柱的淋洗溶劑一般采用甲醇，因此，本研究采用加入含所測(cè)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白樣品進(jìn)行試驗(yàn)，選擇不同濃度的甲醇水作為淋洗溶液，比較淋洗效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)淋洗液為20%甲醇水淋洗的目標(biāo)化合的回收率相對(duì)較高，30%甲醇水淋洗液的回收率稍偏高；另外，隨著甲醇的含量增加，即甲醇含量高于30%時(shí)，目標(biāo)化合物未被固相萃取柱保留而導(dǎo)致回收率降低。主要原因由于目標(biāo)化合物能溶解于有機(jī)試劑甲醇中，在淋洗過程中，隨著甲醇的含量的增加，其洗脫的能力也增加，因此，造成目標(biāo)化合物在淋洗過程中被沖洗，造成了回收率的降低，最終選取30%甲醇作為淋洗溶液。

3.2.3.3 洗脫液的選擇 本試驗(yàn)選用甲醇、乙腈及混合溶劑甲醇/乙腈(1∶1，v/v)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行洗脫。試驗(yàn)結(jié)果表明，在洗脫劑用量不變的條件下，甲醇與乙腈的洗脫能力相當(dāng)，乙腈稍高于甲醇的洗脫能力；而當(dāng)選擇甲醇作為洗脫液時(shí)，群勃龍和勃地龍的回收率相對(duì)于乙腈洗脫時(shí)低，且雜質(zhì)增多；以混合溶劑甲醇/乙腈(1∶1，v/v)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫速度相對(duì)較慢，雜質(zhì)也相對(duì)較多，因此，最終選擇乙腈溶液作為最佳洗脫溶劑。

表3豬肉和雞肉中11種同化激素的線性方程

表4豬肉和雞肉中11種同化激素的回收率與精密度

本試驗(yàn)對(duì)洗脫溶劑乙腈不同洗脫體積(2 mL，3 mL，4 mL，5 mL)對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫能力，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)洗脫液體積為2 mL 時(shí)，整體目標(biāo)化合物的回收率較低；當(dāng)升高洗脫溶劑至3 mL 時(shí)，其回收率相對(duì)增加；當(dāng)采用5 mL洗脫液體積時(shí)，回收率有降低的趨勢(shì)；洗脫液的體積與氮吹濃縮的時(shí)間有關(guān)，故在一定程度上影響了前處理的時(shí)間。因此，考慮回收率與經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等因素，最終選定4 mL洗脫液體積為最佳選擇。

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定11種同化激素的方法，以豬肉、雞肉為檢測(cè)基質(zhì)，證明了方法的可應(yīng)用性，為肉品中同化激素的檢測(cè)提供了可選擇的方法。