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    豬CXCL10基因SNPs與仔豬腹瀉和生長性狀關(guān)聯(lián)分析

    2021-04-06 14:27:08牛步月陳志華姚迪文狄生偉王希彪
    關(guān)鍵詞:長白豬等位基因基因型

    牛步月,劉 路,陳志華,姚迪文,狄生偉,王希彪

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,哈爾濱150030)

    仔豬腹瀉嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè),并造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。隨著全球?qū)p少藥物和疫苗使用呼聲越來越高,通過抗病育種提高機(jī)體自然抗病力成為研究重點(diǎn)。

    趨化因子(Chemokines)是一類由細(xì)胞分泌的蛋白,可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生定向遷移。C-X-C基序趨化因子10(C-X-C motif chemokine ligand 10,CXCL10)也稱為干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10(Interferon gamma-induced protein 10,IP-10)或小誘導(dǎo)細(xì)胞因子B10(Small-inducible cytokine B10),蛋白大小為8.7 ku[1-2]。CXCL10由CD4+T細(xì) 胞、NK和NKT細(xì) 胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等分泌[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),IFN(Interferon)、TNF-α(Tumor necrosis factor-α)等刺激物可誘導(dǎo)CXCL10分泌,放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[5]。

    CXCL10是趨化因子CXCR3(C-X-C motif chemokine receptor 3)配體,研究發(fā)現(xiàn)CXCR3/CXCL10軸是促進(jìn)免疫細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織的關(guān)鍵趨化因子軸之一,與炎癥性疾病,特別是腸道炎癥有強(qiáng)相關(guān)性[6-7]。炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease,IBD)是一種特發(fā)性腸道炎癥性疾病,會(huì)累及回腸、直腸、結(jié)腸,腸道黏膜免疫系統(tǒng)異常反應(yīng),炎癥反應(yīng)在IBD發(fā)病中起主要作用。IBD主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)和克羅恩?。–rohn disease,CD)兩個(gè)獨(dú)立疾病。人類醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CXCL10在健康人群結(jié)腸上皮細(xì)胞中呈組成性表達(dá),但在UC和CD患者結(jié)腸上皮細(xì)胞中高度表達(dá)[8-9];這種差異表達(dá)機(jī)制在于CXCL10通過與CXCR3受體結(jié)合,促進(jìn)Th1細(xì)胞分化并將其趨化到發(fā)生炎癥的結(jié)腸組織[10]。

    豬病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CXCL10在免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11-12]。研究者分別用高毒力和低毒力非洲豬瘟病毒分離株感染豬后,發(fā)現(xiàn)豬CXCL10 mRNA表達(dá)水平顯著增加,通過誘導(dǎo)細(xì)胞活化、趨化性和淋巴細(xì)胞向Th1表型致敏,而在不同病毒感染期間發(fā)揮重要作用,對(duì)于建立有效免疫反應(yīng)非常重要[13]。

    產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichia coli,ETEC)是引起仔豬細(xì)菌性腹瀉主因。Zhou等使用F4ab、F4ac和F18ac 3種血清型ETEC感染IPEC-J2,發(fā)現(xiàn)F4ac和F18ac感 染IPEC-J2后,CXCL10基因表達(dá)量上調(diào)[14]。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringenstype C,C.perfringenstype C)是引起仔豬腹瀉的另一種主要病原菌,其外毒素引起新生仔豬紅痢。Huang等利用C.perfringenstype C感染7日齡仔豬,根據(jù)仔豬糞便評(píng)分將感染豬分為抗性組和敏感組,經(jīng)高通量測序和熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)CXCL10基因在抗性組回腸組織表達(dá)量高于敏感組[15]。根據(jù)CXCL10基因在免疫應(yīng)答中重要作用,Huang等選擇CXCL10基因作為豬一般抗病力候選基因,研究豬CXCL10基因關(guān)鍵外顯子區(qū)域遺傳變異,發(fā)現(xiàn)3′UTR存在SNP c.407T>C,性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該SNP與淋巴細(xì)胞百分比、血細(xì)胞比容、平均紅細(xì)胞量等血液參數(shù)性狀顯著相關(guān)[16]。該位點(diǎn)對(duì)哺乳仔豬腹瀉和生長性狀的影響未見報(bào)道。

    DNA元件百科全書(Encyclopedia of DNA elements,Encode)項(xiàng)目通過對(duì)人類基因組元件識(shí)別和注釋,發(fā)現(xiàn)與疾病等復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)遺傳變異主要位于基因非編碼區(qū)域[17]。大量研究證實(shí),基因5′調(diào)控區(qū)域在基因精準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用,目前關(guān)于豬CXCL10基因啟動(dòng)子區(qū)域遺傳變異研究未見報(bào)道。鑒于此,本研究利用直接測序分析民豬和長白豬CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)域遺傳變異,建立針對(duì)遺傳變異的檢測技術(shù),并在民豬和長白豬群體中展開5′側(cè)翼區(qū)域、3′UTR遺傳變異與哺乳仔豬腹瀉和生長性狀關(guān)聯(lián)分析,以期為豬育種工作提供新基因標(biāo)記和理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

    試驗(yàn)用基因組DNA為基礎(chǔ)科研平臺(tái)豬遺傳育種研究室保存的民豬和長白豬耳組織DNA。試驗(yàn)豬群在相同條件下飼喂,35日齡斷奶。記錄哺乳仔豬初生重,3、7、14、21、28和35日齡體重,計(jì)算仔豬平均日增重[ADG=(35日齡斷奶重-初生重)/35]。仔豬在哺乳期間,觀察每日糞便性狀,根據(jù)糞便形狀確定哺乳仔豬腹瀉評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:糞便外觀呈條狀或粒狀,為正常腹瀉,評(píng)分為0;糞便外觀呈軟便、成形,為輕度腹瀉,評(píng)分為1;糞便外觀呈稠狀糞水無分離現(xiàn)象、稀便,為中度腹瀉,評(píng)分為2;糞便外觀呈液體、不成形、糞水分離,黏液便或膿便,為重度腹瀉,評(píng)分為3[18]。記錄仔豬腹瀉評(píng)分,計(jì)算哺乳仔豬從出生至35日齡腹瀉評(píng)分總和。腹瀉指數(shù)=糞便狀況評(píng)分之和/供試驗(yàn)仔豬總頭數(shù)。腹瀉指數(shù)越高,則試驗(yàn)仔豬腹瀉越嚴(yán)重。

    1.2 試驗(yàn)試劑

    DL2000 DNA Maker、DL5000 DNA Maker、PMD?18-T Vector Cloning Kit、NdeⅠ和MspⅠ限制性核酸內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司;Trans1-T1 Chemically Competent Cell、Trans DNA MakerⅠ均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自Axygen公司;2×TaqMaster Mix(Dye Plus)購自Vazyme公司;Agarose-Molecular Biology Grade購自Invitrogen公司。

    1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

    在NCBI和Ensemble數(shù)據(jù)庫查詢豬CXCL10基因。初步分析發(fā)現(xiàn)起始密碼子ATG位于第一外顯子,第一外顯子全長為121 bp。下載包含豬CXCL10基因起始密碼子ATG上游2 000 bp、第一外顯子和第一內(nèi)含子序列,以此序列為模板,利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物CXCL10-5′-F/R,用于擴(kuò)增5′側(cè)翼區(qū)域序列;設(shè)計(jì)引物CXCL10-1F/R用于在民豬和長白豬群體中檢測SNP rs337535939位點(diǎn)。按照文獻(xiàn)[16]合成引物CXCL10-2F/R用于CXCL10基因3′UTR區(qū)域SNP c.407T>C位點(diǎn)檢測(見表1)。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

    表1 豬CXCL10基因引物Table 1 Primers used for porcine CXCL10 gene amplification

    1.4 豬CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)遺傳變異和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析

    根據(jù)哺乳仔豬腹瀉記錄,分別選取嚴(yán)重腹瀉和健康未腹瀉民豬和長白仔豬各5頭,分別以這20頭豬基因組DNA為模板,利用引物CXCL10-5′-F和CXCL10-5′-R作CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)擴(kuò)增。

    PCR反應(yīng)體系總體系為20μL,包括10μL 2×TaqMaster Mix(Dye Plus),1μL基因組DNA,各0.8μL上下游引物,7.4μL滅菌水。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,57.7℃退火60 s,72℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。

    PCR擴(kuò)增結(jié)束后,用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測。按照凝膠回收試劑盒說明書,作PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收和純化。純化后產(chǎn)物與PMD18-T連接,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽性克隆菌液經(jīng)PCR鑒定后,送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

    利用Clustal Omega在線軟件對(duì)10頭民豬和10頭長白豬測序結(jié)果作多重序列比對(duì),分析尋找遺傳變異位點(diǎn)。使用在線軟件AnimalTFDB3(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#!/tfbs_predict)預(yù)測CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)一步分析遺傳變異位點(diǎn)是否引起轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)改變。利用DNA Club軟件分析遺傳變異是否引起特異限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)變化。

    1.5 PCR-RFLP檢測

    利用引物CXCL10-1F/R作CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)域擴(kuò)增,取8.5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,0.5μLNdeⅠ限制性內(nèi)切酶,1μL Buffer構(gòu)成NdeⅠPCR-RFLP反應(yīng)體系。利用引物CXCL10-2F/R作CXCL10基因3′UTR擴(kuò)增,取8.5μL擴(kuò)增產(chǎn)物,0.5μLMspⅠ限制性內(nèi)切酶,1μL Buffer構(gòu)成MspⅠPCR-RFLP反應(yīng)體系。兩種混合體系均于37℃水浴5 h,之后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,根據(jù)圖像結(jié)果分析并判斷基因型。

    1.6 數(shù)據(jù)分析

    利用popgene 1.32分別計(jì)算兩個(gè)SNPs位點(diǎn)在民豬和長白豬群體中基因型頻率、等位基因頻率、觀測雜合度、期望雜合度和有效等位基因數(shù)。

    采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件(Version 9.4)一般線性模型中GLM程序分別作兩個(gè)SNPs位點(diǎn)與民豬和長白豬哺乳仔豬腹瀉評(píng)分和生長性狀表型值關(guān)聯(lián)分析,建立模型如下:

    Yij表示仔豬腹瀉評(píng)分和生長性狀表型值,u表示群體均值,Gi表示基因型效應(yīng),eij表示隨機(jī)殘差效應(yīng)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 豬CXCL10基因多態(tài)性和性狀關(guān)聯(lián)分析

    2.1.1 豬CXCL10基因5′調(diào)控區(qū)克隆

    以豬基因組DNA為模板,設(shè)計(jì)引物對(duì)CXCL10基因5′調(diào)控區(qū)1 639 bp近端序列作PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測得到單一明亮條帶(見圖1),且條帶長度與預(yù)期結(jié)果1 639 bp相近。對(duì)PCR產(chǎn)物純化、克隆和測序,經(jīng)序列比對(duì)獲得1 639 bp片段,該片段包含1 477 bp ATG上游區(qū)域,121 bp外顯子1和101 bp內(nèi)含子1。

    圖1 豬CXCL10基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Agarosegel photograph of CXCL10 in pig

    2.1.2 豬CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)域遺傳變異和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析

    分別以嚴(yán)重腹瀉和健康未腹瀉民豬和長白仔豬基因組DNA為模板,利用引物CXCL10-5′-F/R作PCR擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物分別回收、純化、克隆和測序。比對(duì)分析序列測序結(jié)果發(fā)現(xiàn),通過PCR擴(kuò)增獲得1 639 bp豬CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)域存在15個(gè)遺傳變異,分別位于ATG上游-1341(C/T)、-1338(G/A)、-1040(A/G)、-1022(G/A)、-977(-/G)、-971(T/A)、-832(T/G)、-808(A/G)、-681(G/C)、-666(----/CCAA)、-552(T/A)、-551(-/G)、-462 bp(-/A/C)、-159(A/G)以及+6(C/T)。

    利用AnimlTFDB3在線軟件對(duì)該序列預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNPs位點(diǎn)引起轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力改變(見表2),5個(gè)SNPs中rs346260249、rs337535939、rs339657065和rs331393857均 多 發(fā)于民豬群體,10頭測序民豬中有6頭在這11個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基突變,而測序10頭長白豬中僅1頭在此位點(diǎn)處發(fā)生堿基突變(見表3)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)SNP rs337535939引起轉(zhuǎn)錄因子MLXIPL和NHLH1結(jié)合能力改變(見表2)。當(dāng)SNP rs337535939為G時(shí),存在MLXIPL和NHLH1結(jié)合位點(diǎn);當(dāng)SNP rs337535939為A時(shí),MLXIPL結(jié)合位點(diǎn)消失,NHLH1結(jié)合能力下降(見表2)。結(jié)合民豬和長白豬測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),在10頭測序長白豬中,僅1頭為A等位基因;而在10頭參與測序民豬中,6頭為A等位基因;在10頭測序健康個(gè)體中,4頭民豬和1頭長白豬為A等位基因;10頭參與測序嚴(yán)重腹瀉個(gè)體中,2頭民豬為A等位基因(見圖2)。

    SNP rs335118294和SNP rs339657065均引起轉(zhuǎn)錄因子EP300結(jié)合能力變化。當(dāng)SNP rs335118294和SNP rs339657065發(fā) 生AG突變時(shí),EP300結(jié)合能力均下降(見表2)。結(jié)合民豬和長白豬測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),對(duì)于SNP rs335118294,10頭測序長白豬中,3頭為G等位基因;而在10頭參與測序民豬中,7頭為G等位基因;10頭測序健康個(gè)體中,3頭民豬和2頭長白豬為G等位基因;10頭參與測序嚴(yán)重腹瀉個(gè)體中,1頭長白豬和4頭民豬為G等位基因(見表3)。對(duì)于SNP rs339657065,10頭測序長白豬中,僅1頭為G等位基因;而在10頭參與測序民豬中,6頭為G等位基因;10頭測序健康個(gè)體中,4頭民豬和1頭長白豬為G等位基因;10頭參與測序嚴(yán)重腹瀉個(gè)體中,2頭民豬為G等位基因(見表3)。

    進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),SNP rs337535939引起NdeⅠ酶切位點(diǎn)(CA|TATG)改變,當(dāng)SNP rs337535939為G等位基因時(shí),存在NdeⅠ酶切位點(diǎn);當(dāng)SNP rs337535939為A等位基因時(shí),NdeⅠ酶切位點(diǎn)消失(見圖2)。

    表2 豬CXCL10基因5'側(cè)翼區(qū)SNPs引起轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)變化Table 2 Changes of transcription factor binding sites caused by SNPs in the 5'flanking region of porcine CXCL10 gene

    表3 民豬和長白豬CXCL10基因SNPs統(tǒng)計(jì)Table 3 Summary of SNPs in CXCL10 gene of Min and Landrace piglets

    圖2 CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)中檢測到SNP rs337535939Fig.2 SNP rs337535939 in 5′flanking region of the CXCL10 gene

    2.1.3 豬CXCL10基因PCR-RFLP分析

    以民豬和長白豬基因組DNA為模板,利用引物CXCL10-2F/R作PCR擴(kuò)增獲得豬CXCL10基因包含SNP rs337535939位點(diǎn)共849 bp5′側(cè)翼區(qū)域片段,用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物消化,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后產(chǎn)生3種基因型。分別是AA基因型(849 bp)、GG基因型(230、619 bp)和AG基因型(230、619、849 bp)(見圖3)。

    對(duì)于報(bào)道的CXCL10基因3′UTR SNP位點(diǎn)c.407T>C,以文獻(xiàn)[16]報(bào)道引物擴(kuò)增獲得497 bp片段,用限制性內(nèi)切酶MspⅠ對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物消化,瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)共存在3種基因型,分別是TT基因型(497 bp)、CC基因型(378、119 bp)和TC基因型(378、11、497 bp)(見圖4)。

    圖3 CXCL10基因NdeⅠPCR-RFLP基因型分型結(jié)果Fig.3 NdeⅠPCR-RFLP genotyping results of CXCL10 gene

    圖4 CXCL10基因SNP c.407T>C MspⅠPCR-RFLP基因型分型結(jié)果Fig.4 SNP c.407T>C MspⅠPCR-RFLP genotyping results of CXCL10 gene

    2.1.4 豬CXCL10基因SNPs群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

    在民豬和長白豬群體中分析CXCL10基因兩個(gè)SNPs基因型頻率、等位基因頻率、雜合度和多態(tài)信息含量等群體遺傳參數(shù)。如表4所示,SNP rs337535939在民豬群體中存在AA、AG和GG 3種基因型,基因型頻率分別為0.22、0.56和0.23;A等位基因頻率為0.49,觀測雜合度為0.56,該位點(diǎn)在長白豬群體中僅檢測到4個(gè)AA基因型個(gè)體,AA基因型頻率為0.02,A等位基因頻率為0.18,觀測雜合度為0.32。SNP c.407T>C在民豬群體中存在TT、TC和CC 3種基因型,基因型頻率分別為0.17、0.61和0.21;T等位基因頻率為0.48,觀測雜合度為0.60,該位點(diǎn)在長白豬群體中僅檢測到4個(gè)TT基因型個(gè)體,TT基因型頻率為0.02,T等位基因頻率為0.12,觀測雜合度為0.20。觀測雜合度(Ho)=觀察得到雜和個(gè)體數(shù)/樣本個(gè)體數(shù)總數(shù)。SNP rs337535939和SNP c.407T>C的期 望 雜合度(Expected heterozygosity,He)在民豬和長白豬中分別為0.50、0.30;0.50,0.21。這兩個(gè)SNPs在兩個(gè)群體中多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)值分別為0.37、0.25;0.37、0.19。按照PIC多態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(PIC>0.5為高度多態(tài),0.25<PIC<0.5為中度多態(tài),PIC<0.25為低度多態(tài)),本研究新鑒定SNP rs337535939和報(bào)道SNP c.407T>C在民豬群體中均為中度多態(tài),而在長白豬群體中為低度多態(tài)。

    表4 CXCL10基因SNPs在民豬和長白豬群體中群體遺傳參數(shù)Table 4 Population genetic parameters of SNPs of the CXCL10 gene in Min and Landrace piglets

    2.1.5豬CXCL10基因SNPs與哺乳仔豬腹瀉和生長性狀關(guān)聯(lián)分析

    性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,CXCL10基因SNP rs337535939與民豬仔豬7、14、21、28、35日齡體重以及日增重相關(guān)(見表5);與長白仔豬腹瀉指數(shù)、14、28、35日齡體重和日增重相關(guān)(見表5)。在民豬群體中,SNP rs337535939各種基因型個(gè)體抗腹瀉能力差異不顯著;GG基因型仔豬35日齡斷奶重和日增重分別比AA基因型個(gè)體高0.75 kg和30 g(P<0.05)。在長白豬群體中,GG型仔豬抗腹瀉能力與AA型差異不顯著,顯著低于AG雜合子個(gè)體(P<0.05);GG基因型個(gè)體35日齡斷奶重和日增重分別比AA基因型個(gè)體高3.36 kg和0.08 kg(P<0.05)。

    CXCL10基因3′UTR區(qū)域SNP c.407T>C與民豬和長白仔豬腹瀉和生長性狀均無相關(guān)性。在長白豬群體中TT、TC和CC日增重分別為140、190和200 g,TT基因型個(gè)體與CC基因型個(gè)體日增重相差60 g。在民豬和長白豬群體中,與TT基因型個(gè)體比較,CC型個(gè)體具有較低腹瀉指數(shù)、較高35日齡斷奶重和日增重(見表6)。

    表5 CXCL10基因SNP rs337535939與民豬和長白仔豬腹瀉指數(shù)和生長性狀關(guān)聯(lián)分析Table 5 Association analysis of CXCL10 gene SNP rs337535939 with diarrhea index and performance traits in Min and Landrace piglets

    表6 CXCL10基因c.407T>C與民豬和長白仔豬腹瀉指數(shù)和生長性狀關(guān)聯(lián)分析Table 6 Association analysis of CXCL10 gene SNP c.407T>C with diarrhea index and performance traits in Min and Landrace piglets

    3 討論

    本研究通過直接測序在CXCL10基因5'側(cè)翼區(qū)域鑒定出13個(gè)SNPs,其中g(shù).71696440以及2個(gè)插入突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn),其他10個(gè)SNPs在Ensembl的SNPs數(shù)據(jù)庫中已標(biāo)注。對(duì)這些遺傳變異位點(diǎn)分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)SNP rs337535939由G到A堿基突變引起轉(zhuǎn)錄因子MLXIPL(MLX interacting protein like,MLXIPL)結(jié)合位點(diǎn)變化。MLXIPL也稱為碳水化合物反應(yīng)性元素結(jié)合蛋白(Carbohydrate-responsive element-binding protein,ChREBP)[19],該基因編碼Myc/Max/Mad超家族的基本螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)MLXIPL可直接激活多個(gè)參與糖酵解和脂肪合成基因表達(dá),調(diào)控糖代謝和脂肪酸合成[20]。

    轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)變化可能影響基因轉(zhuǎn)錄效率并最終導(dǎo)致表型性狀改變,因此本試驗(yàn)深入分析SNP rs337535939。通過序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該SNP多發(fā)于民豬群體;10頭測序長白豬中,僅1頭為A等位基因;而10頭參與測序民豬中,6頭為A等位基因。這表明民豬群體具有較高遺傳變異,長白豬經(jīng)長期人工選育后,在分子水平遺傳變異降低。

    群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在民豬和長白豬群體中G(或C)等位基因頻率均高于A(或T)。性狀關(guān)聯(lián)分析證實(shí),GG型民豬和長白仔豬35日齡體重和日增重(ADG)均高于AA型個(gè)體。GG型長白豬腹瀉指數(shù)低。民豬和長白豬群體研究表明,選育GG型個(gè)體(或淘汰AA型個(gè)體)可降低腹瀉發(fā)生,提高仔豬日增重。

    民豬廣泛分布于東北地區(qū),與引入品種相比較,具有抗逆性強(qiáng)、繁殖力高、耐粗飼、肉質(zhì)好等優(yōu)良特性。本研究發(fā)現(xiàn)長白豬SNP rs337535939G等位基因頻率高于民豬群體,在檢測長白豬群體中,僅有4個(gè)AA基因型個(gè)體。長白豬是著名引入品種,推測在長期人工選育過程中,具有高生長速度GG型個(gè)體得到選擇,而低斷奶重和日增重AA型個(gè)體被淘汰;民豬由于未經(jīng)嚴(yán)格人工選育,其群體中仍存在一定數(shù)量AA基因型個(gè)體。

    仔豬出生時(shí)脂肪組織中脂肪沉積量較小,但在哺乳期脂肪快速沉積。近年研究表明,轉(zhuǎn)錄因子MLXIPL在豬脂肪和能量代謝中發(fā)揮作用。Zhang等發(fā)現(xiàn)葡萄糖可直接通過ChREBP誘導(dǎo)豬前脂肪細(xì)胞中脂肪生成和成脂基因表達(dá)[21];高糖條件下,MLXIPL在豬皮下前脂肪細(xì)胞表達(dá)量高于肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞[22]。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)MLXIPL可與GG型個(gè)體CXCL10基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,性狀關(guān)聯(lián)分析表明GG型個(gè)體具有高抗腹瀉能力、斷奶重和日增重。MLXIPL是否通過SNP rs337535939影響CXCL10基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控,進(jìn)而影響哺乳仔豬抗病能力和生長性狀,有待后期深入研究。

    人類醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CXCL10啟動(dòng)子區(qū)域SNPs(-135G>A[rs56061981]和-1447A>G[rs4508917])影響血漿CXCL10基因表達(dá)水平,與腦型瘧疾等疾病易感性相關(guān)[23]。本研究在豬CXCL10啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測到STAT、EP300等多種促炎性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),其中預(yù)測EP300結(jié)合區(qū)域存在兩個(gè)SNP(rs335118294和rs339657065)。EP300可作為一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶,通過染色質(zhì)重塑調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,在細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮表觀調(diào)控作用。陳夢(mèng)等研究發(fā)現(xiàn)EP300高表達(dá)可通過調(diào)節(jié)H3K27ac修飾,促進(jìn)CXCL10基因表達(dá),影響小鼠腸道炎癥發(fā)生發(fā)展[24]。下一步可深入研究SNPrs335118294和rs339657065功能,分析EP300是否通過組蛋白修飾調(diào)控豬CXCL10基因表達(dá)參與仔豬腹瀉遺傳調(diào)控。

    Huang等分析CXCL10基因SNP c.407T>C與不同品種豬血紅蛋白濃度相關(guān)性時(shí),發(fā)現(xiàn)該SNP與20日齡仔豬血液中淋巴細(xì)胞百分率、80日齡生長豬血細(xì)胞比容和平均紅細(xì)胞量顯著相關(guān)(P<0.05);與80日齡生長豬血液中血紅蛋白濃度極顯著相關(guān)(P<0.01),而紅細(xì)胞在免疫反應(yīng)中起作用,表明該SNP對(duì)免疫反應(yīng)有影響[16]。本研究通過性狀關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)SNP c.407T>C與民豬和長白仔豬腹瀉和生長性狀均無相關(guān)性(P>0.05),但在長白豬群體中TT、TC和CC日增重分別為140、190和200 g,TT基因型個(gè)體與CC基因型個(gè)體日增重相差60 g。性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果不顯著極有可能因?yàn)樵囼?yàn)群體不夠大。該結(jié)果表明利用該標(biāo)記對(duì)免疫性狀選擇,不影響哺乳仔豬抗腹瀉能力,可能對(duì)生長性能存在影響。

    4 結(jié)論

    本研究在豬CXCL10基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)15個(gè)SNP位點(diǎn),轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測發(fā)現(xiàn)其中SNP rs337535939引起MLXIPL轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)改變,建立針對(duì)該SNP位點(diǎn)NdeⅠPCR-RFLP分型技術(shù)。性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)豬SNP rs337535939位點(diǎn)影響民豬和長白豬斷奶重和日增重,影響長白豬仔豬腹瀉;SNP c.407T>C對(duì)民豬和長白豬抗腹瀉能力和斷奶重等經(jīng)濟(jì)性狀無負(fù)面影響。

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