參芎葡萄糖注射液通過激活PI3K-Akt-eNOS信號通路對冠心病大鼠Caspase-12、ICAM-1表達(dá)的影響

周巍，馬曉峰，鄧勇，王紅，鐘侖

近年來，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病，CHD）發(fā)病呈明顯上升趨勢[1]。參芎葡萄糖注射液（SGI）為復(fù)方制劑，具有治療閉塞性腦血管疾病的作用，副作用較少，目前關(guān)于其治療機(jī)理的研究有限[2]。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）是一類富含半胱氨酸的蛋白酶，其中Caspase-12是其參與細(xì)胞凋亡的主要蛋白，在CHD患者中水平顯著升高[3]。細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）參與血管內(nèi)皮的損傷過程[4]。PI3K-Akt-eNOS信號通路的抑制是引起心肌細(xì)胞大量凋亡損傷的機(jī)制，既往研究認(rèn)為丹參具有激活PI3K-Akt通路抑制凋亡的作用[5]。本文主要探究SGI對CHD大鼠Caspase-12、ICAM-1及PI3KAkt通路的影響，探其治療機(jī)制，為臨床更好的應(yīng)用SGI治療CHD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物建模雄性Sprague-Dawley級大鼠45只（Laboratory Animal Center，中國），體重180～210 g，隨機(jī)分為對照組、模型組和SGI組3組，每組各15只。模型組和SGI組均使用高脂飲食方法建模[6]，大鼠使用高脂飼料（白砂糖20%，豬油20%，膽固醇1%，酪蛋白20%，其他為基礎(chǔ)飼料）喂養(yǎng)4周。CHD大鼠模型判斷標(biāo)準(zhǔn)：使用心電圖檢查，當(dāng)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，測定J點位移＞0.1 mV時認(rèn)為CHD建模成功。SGI組靜脈注射SGI（貴州景峰注射劑有限公司，國藥準(zhǔn)字H52020703），劑量20 mg/kg 1/d，連續(xù)注射7 d，另2組注射生理鹽水進(jìn)行對照。本研究中包括糖尿病誘導(dǎo)和犧牲手術(shù)在內(nèi)的所有方案均已獲得機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會及中國動物保護(hù)協(xié)會的批準(zhǔn)。

1.2 觀察指標(biāo)及方法

1.2.1 J點位移幅度干預(yù)后使用生理記錄儀（型號SLY-808，廣州深華）記錄各組大鼠心電圖J點位移幅度：大鼠麻醉后固定于試驗臺，將檢測點置于四肢皮下，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖中J點的位移。

1.2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色將大鼠處死后取出心肌組織，立即在福爾馬林液中室溫固定24 h。胰島組織用酒精脫水并包埋于石蠟中。將樣品切成5 μm厚的薄片置于APES涂覆的載玻片上。使用二甲苯將切片脫石蠟并水合并用HE試劑染色，將蘇木精在室溫下溫育5 min。洗滌后，將曙紅在室溫下溫育1～3 min，用梯度乙醇洗滌后，中性凝膠密封。

1.2.3 心肌細(xì)胞凋亡情況大鼠處死后收集心肌組織細(xì)胞，使用流式細(xì)胞術(shù)用于檢測細(xì)胞凋亡。凋亡試劑盒購自BD Pharmingen（USA），按照說明書分別加入PE及7-AAD，應(yīng)用流式細(xì)胞儀（Becton Dickerson，SanJose，CA，USA）計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western Blot使用Western Blot檢測大鼠干預(yù)后的心肌組織中Caspase-12、ICAM-1、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）及PI3K-Akt-eNOS通路蛋白的表達(dá)水平。在液氮的保護(hù)下裂解細(xì)胞，在12 000 rpm，4℃下離心15 min收集上清液，使用BCA方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以確定蛋白質(zhì)濃度。使用10%的SDS-PAGE凝膠并用于電泳，電泳后使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（Bio-Rad，USA）并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗室溫震蕩2 h后，4℃孵育過夜，加入二抗，室溫下孵育1.5～2 h，使用ECL試劑（Huiying，Shanghai，China）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。使用GAPDH作為內(nèi)參，相關(guān)試劑均購于美國Abcam公司。

1.2.5 RT-PCRRT-PCR用于檢測組織中Caspase-12、ICAM-1、TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。將組織在液氮保護(hù)下研磨并裂解，用Trizol法提取組織總RNA并溶解于DEPC水（Sigma）中。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，Japan）對RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄測定以合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃，反應(yīng)15 min，逆轉(zhuǎn)錄酶失活條件為85℃，反應(yīng)15 s。用SYBR Prellix Ex TaqTM實時PCR試劑盒（TaKaRa，Japan）進(jìn)行RT-qPCR實驗。通過在95℃下激活DNA聚合酶5 min進(jìn)行PCR，進(jìn)行40個循環(huán)的兩步PCR（95℃ 10 s和60℃ 30 s），最終延伸75℃ 10 min，保持在4℃。所有引物均獲自Genewiz（中國江蘇蘇州）公司，使用2-ΔΔCT法分析mRNA表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 19進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（）表示。三組樣本單因素對比采取方差分析（ANOVA）評估組間差異。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果將三組大鼠心肌組織切片進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，對照組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，心肌細(xì)胞排列整齊緊密；模型組大鼠心肌細(xì)胞核仁出現(xiàn)變性或成簇狀排列，心肌纖維排列紊亂、間隔增寬，間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤；SGI組心肌細(xì)胞核仁清晰，細(xì)胞水腫情況不明顯，纖維排列緊密（圖1）。

2.2 三組大鼠J點位移情況和心肌細(xì)胞凋亡率比較與對照組相比，模型組的J點位移幅度和心肌細(xì)胞的凋亡率明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，SGI組的J點位移幅度和心肌細(xì)胞的凋亡率均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表1。

圖1 三組大鼠心肌HE染色情況（A：對照組；B模型組；C：SGI組）

表1 三組大鼠J點位移情況和心肌細(xì)胞凋亡率比較（）

表1 三組大鼠J點位移情況和心肌細(xì)胞凋亡率比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

2.3 三組心肌組織Caspase-12、ICAM-1比較與對照組相比，模型組心肌細(xì)胞的Caspase-12、ICAM-1的蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，SGI組的心肌細(xì)胞Caspase-12、ICAM-1的蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表2和圖2。

2.4 三組大鼠PI3K-Akt-eNOS通路比較與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中PI3K蛋白、p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，SGI組大鼠心肌組織中PI3K蛋白、p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS表達(dá)水平均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表3和圖3 。

3 討論

隨著我國人口老齡化加劇和生活水平提高，CHD發(fā)病率也逐年升高。冠心病發(fā)展至后期會出現(xiàn)心力衰竭、心肌梗死等疾病，嚴(yán)重威脅人們生命健康?？寡“逅幬锖驼{(diào)脂藥物是治療冠心病的主要方法，由于冠心病病程較長，需長期服用藥物，中藥因其具有較好的療效和較低的不良反應(yīng)引起了更多學(xué)者的重視[7]。

SGI主要成分包括川芎和丹參，主要有效活性物質(zhì)為鹽酸川芎嗪及丹參素，具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、消炎等作用，在治療心血管疾病中有著廣泛應(yīng)用[8]。本研究結(jié)果顯示建模后J點位移幅度顯著升高并高于0.1 mV，同時模型組的心肌纖維細(xì)胞排列整齊緊密；模型組大鼠心肌細(xì)胞核仁出現(xiàn)縮變性或成簇狀排列，出現(xiàn)細(xì)胞水腫和淋巴細(xì)胞浸潤，心肌纖維排列紊亂、間隔增寬，說明心肌細(xì)胞受損，提示大鼠CHD模型建立成功。而SGI組的心肌細(xì)胞核仁清晰，細(xì)胞水腫情況不明顯，纖維排列緊密，J點位移幅度顯著降低，證明靜脈注射SGI具有治療CHD保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。過往研究結(jié)果顯示SGI在治療CHD不穩(wěn)定型心絞痛中具有較好的臨床效果，可緩解心肌組織纖維化、改善心臟功能[9]，同時顯示SGI具有較高的安全性[10]，說明SGI具有治療CHD和保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

表2 三組心肌組織Caspase-12、ICAM-1比較（）

表2 三組心肌組織Caspase-12、ICAM-1比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

圖2 三組大鼠心肌組織Caspase-12、ICAM-1蛋白和mRNA的表達(dá)水平比較（A：蛋白電泳圖；B：mRNA電泳圖）

表3 三組大鼠PI3K-Akt-eNOS通路比較（）

表3 三組大鼠PI3K-Akt-eNOS通路比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

圖3 三組大鼠PI3K-Akt-eNOS通路蛋白表達(dá)比較

Caspase-12隸屬于Caspase蛋白家族，Caspase-12的激活可通過激活下游的Caspase-3等凋亡執(zhí)行因子誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，過往有研究顯示丹參具有下調(diào)Caspase-12水平而發(fā)揮抗凋亡的作用[11,12]。ICAM-1具有黏附單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的作用，從而釋放炎癥因子引起動脈粥樣硬化。ICAM-1是炎性細(xì)胞向粥樣斑塊游走和浸潤的必要條件，過往研究顯示ICAM-1與CHD的發(fā)生相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示模型組心肌細(xì)胞的Caspase-12、ICAM-1蛋白和mRNA的表達(dá)水平顯著高于對照組，SGI組的心肌細(xì)胞的Caspase-12、ICAM-1蛋白和mRNA的表達(dá)水平顯著低于模型組，且模型組的心肌細(xì)胞的凋亡率顯著高于對照組，SGI組的心肌細(xì)胞的凋亡率顯著低于模型組，提示SGI可顯著抑制心肌細(xì)胞中Caspase-12、ICAM-1的水平，并抑制細(xì)胞凋亡，治療CHD。

為進(jìn)一步探究SGI治療CHD的機(jī)理，我們檢測了炎癥因子和PI3K-Akt-eNOS信號通路的影響。過往研究顯示PI3K-Akt-eNOS通路在CHD中發(fā)揮著極為重要的作用。一方面，PI3K-Akt通路的抑制會通過上調(diào)Caspase-12、Caspase-3等凋亡蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；另一方面，PI3K-Akt-eNOS通路的抑制影響NO的釋放，加劇心臟動脈的縮血管效應(yīng)，加重冠脈粥樣斑塊形成加劇心肌缺血，此外，PI3K-Akt-eNOS通過炎性通路影響動脈粥樣硬化的形成[14,15]。本研究結(jié)果顯示模型組大鼠心肌組織中PI3K蛋白、p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS水平顯著降低，SGI組PI3K蛋白、p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS顯著高于模型組。過往研究顯示，丹參飲提取物A通過上調(diào)PI3K-Akt信號通路水平起到抗心肌缺血的作用[16]。劉楊等[17]研究顯示丹參具有激活PI3K-Akt-mTOR信號通路的作用。楊洋等[18]研究結(jié)果顯示SGI具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的作用。本研究結(jié)果顯示SGI可能通過上調(diào)PI3K-Akt-mTOR信號通路的活化水平發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，從而治療CHD。

綜上所述，SGI具有保護(hù)心肌細(xì)胞、抑制CHD引起的心肌細(xì)胞凋亡的作用，同時SGI可有效降低Caspase-12、ICAM-1的水平治療CHD，可能是由于SGI中的活性物質(zhì)具有上調(diào)PI3K-AkteNOS通路的作用有關(guān)。