草莓種苗的脫毒技術(shù)試驗(yàn)研究

李曉亮 楊世先 楊光炤 王文智 張建康 錢(qián)遵姚 董 廣 張軍云

（玉溪市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 云南玉溪653100）

草莓（Fragaria ananassaDuch.)屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]，在我國(guó)很多地方被廣泛栽培，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益。

草莓是一種以匍匐莖無(wú)性繁殖的作物，因長(zhǎng)期種植，體內(nèi)病毒逐年積累加重，病毒病發(fā)生嚴(yán)重[2]。一旦草莓感染了病毒后，植株生長(zhǎng)緩慢、葉皺縮、果實(shí)逐年變小、畸形、品質(zhì)差，一般減產(chǎn)30%～80%[3]，草莓病毒病已成為了草莓生產(chǎn)中的一大危害。

草莓病毒病，目前還沒(méi)有一種比較好的藥劑可用于防治。培育無(wú)病毒母本苗，栽培無(wú)病毒苗木，是防治草莓病毒病的根本對(duì)策[4]。目前世界上生產(chǎn)草莓無(wú)毒苗最普通、最有效的方法是用莖尖培養(yǎng)法培育草莓無(wú)病毒苗[5]。

草莓脫毒技術(shù)的研究，國(guó)內(nèi)已有很多報(bào)道，上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院何歡樂(lè)等的研究結(jié)果[2]表明，最適宜的草莓脫毒法為改良熱處理+莖尖培養(yǎng)法，即先將草莓匍匐莖放在40℃熱水中處理4 h，再剝?nèi)　?.5 mm大小的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，脫毒效果良好；高山林[3]的研究結(jié)果表明，把切取的草莓芽洗凈后經(jīng)過(guò)高溫短時(shí)間熱處理，然后用莖尖培養(yǎng)法獲得無(wú)病毒草莓苗；劉健等[6]的研究表明，經(jīng)40～42℃高溫處理草莓匍匐莖后再剝?nèi)∏o尖，得到的試管苗能達(dá)到100%脫毒率；顧地周等[7]的研究表明，利用試管內(nèi)高溫處理（在溫度35～50℃條件下，培養(yǎng)30～80 d）結(jié)合莖尖脫毒的方法可以完全脫除草莓病毒，從而建立了草莓脫毒體系；覃蘭英等[8]的研究表明，將草莓在35℃下熱處理7 d后，逐步升溫至38℃，在濕度40%～68%、光照度4 000～5 000 lx條件下熱處理35 d后，將長(zhǎng)出的新莖莖尖再行組培，可獲得100%的脫毒苗；童堯明等[9]的研究表明，以草莓莖尖分生組織0.2～0.4 mm一次性培養(yǎng)出組培苗，出苗率83%～90%，脫毒率達(dá)100%；高遐虹、李梅[10]的研究結(jié)果表明，采用草莓的莖尖2次脫毒法，對(duì)寶交早生等6個(gè)草莓品種的莖尖進(jìn)行組培脫毒，經(jīng)檢測(cè)可全部脫除草莓斑駁病毒、草莓輕型黃邊病毒、草莓鑲脈病毒和草莓皺縮病毒，莖尖2次脫毒法操作簡(jiǎn)便、易掌握，脫毒率達(dá)100%，分化率達(dá)79%。

結(jié)合國(guó)內(nèi)已有的草莓脫毒技術(shù)報(bào)道，本研究開(kāi)展了草莓種苗的脫毒技術(shù)試驗(yàn)，旨在提出一種操作簡(jiǎn)便、脫毒率高的草莓種苗脫毒技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

玉溪市農(nóng)業(yè)科學(xué)院組培室。

1.2 試驗(yàn)材料

草莓莖尖采集于玉溪市農(nóng)業(yè)科學(xué)院研和賈井基地，3個(gè)參試的草莓品種為鬼怒甘、章姬、紅顏。

1.3 試驗(yàn)時(shí)間

2019年7～12月。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)置5種草莓種苗的脫毒技術(shù)試驗(yàn)處理，處理1：對(duì)草莓莖尖由外向內(nèi)逐層剝?nèi)デo尖的幼葉，切取肉眼可見(jiàn)的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)（1.0～1.5 mm）接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，然后增殖、生根獲得草莓組培苗；處理2：采用“直接莖尖培養(yǎng)”的脫毒技術(shù)，在解剖鏡（8～40倍）下由外向內(nèi)逐層剝?nèi)デo尖的幼葉，切取0.2～0.5 mm的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，然后增殖、生根獲得草莓組培苗；處理3：采用“改良莖尖培養(yǎng)”的脫毒技術(shù)，將通過(guò)“直接莖尖培養(yǎng)”法獲得的新生匍匐莖的莖尖再進(jìn)行第2次莖尖剝離，切取0.2～0.5 mm的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，然后增殖、生根獲得草莓組培苗；處理4：采用“直接莖尖培養(yǎng)+高溫處理”的脫毒技術(shù)，將通過(guò)“直接莖尖培養(yǎng)”法獲得的草莓組培苗放置于光照培養(yǎng)箱中，保持白天35～40℃光照培養(yǎng)12 h/d，夜間25℃暗培養(yǎng)12 h/d的條件下培養(yǎng)30 d，之后將存活的芽增殖、生根獲得草莓組培苗；處理5：采用“直接莖尖培養(yǎng)+冷處理”的脫毒技術(shù)，將通過(guò)“直接莖尖培養(yǎng)”法獲得的草莓莖尖放置于5℃的冰箱（組培苗需整瓶密封好）中培養(yǎng)60 d，然后增殖、生根獲得草莓組培苗。

1.4.2 草莓苗的組培 按照李曉亮等[1]的技術(shù)實(shí)施。

1.4.3 草莓苗的病原檢測(cè) 各處理的草莓組培苗送樣到云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所進(jìn)行病原檢測(cè)，檢測(cè)方法：將抽提樣品負(fù)染色制片，F(xiàn)EI透射電子電子顯微鏡檢測(cè)。

1.4.4 數(shù)據(jù)調(diào)查與分析 調(diào)查各種處理后的草莓組培苗存活情況、苗的質(zhì)量，根據(jù)病原檢測(cè)結(jié)果分析各處理對(duì)草莓病原脫毒效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓種苗的存活率

從表1可知，經(jīng)過(guò)處理1、處理2、處理3、處理5的試驗(yàn)處理后，草莓種苗的存活不受影響，存活率為100%，但經(jīng)過(guò)處理4試驗(yàn)處理后，絕大部分種苗死亡，存活率僅為20.12%～25.43%，說(shuō)明大部分草莓種苗不耐高溫。

2.2 草莓種苗的病原檢測(cè)結(jié)果

從表2可知，鬼怒甘、章姬、紅顏3個(gè)草莓品種的組培苗經(jīng)病原檢測(cè)后，處理1中均觀察到病毒粒子，而處理2、處理3、處理4、處理5中的組培苗中均未檢測(cè)到病毒粒子。說(shuō)明不同處理獲得的草莓組培苗其病原含量不同，處理2、處理3、處理4、處理5的脫毒效果較好。

2.3 最佳的草莓脫毒技術(shù)篩選

根據(jù)不同草莓脫毒處理后的存活率和草莓組培苗病原檢測(cè)結(jié)果（表1、表2）進(jìn)行分析，處理1檢測(cè)到病毒，首先淘汰該技術(shù)；在處理2、處理3、處理4、處理5中均未檢測(cè)到病毒，由于處理4試驗(yàn)處理后絕大部分種苗死亡，且還需高溫設(shè)備，所以處理4不入選，處理2、處理3對(duì)操作要求嚴(yán)格，莖尖需剝離到0.2～0.5 mm的生長(zhǎng)點(diǎn)，否則脫毒可能不完全（如處理1），處理5莖尖需剝離到0.2～0.5 mm的生長(zhǎng)點(diǎn)，還需冷處理（操作也簡(jiǎn)單）脫毒，由此使得該處理脫毒充分、完全。因此，根據(jù)脫毒效果、操作要求綜合考慮，處理5（直接莖尖培養(yǎng)+冷處理）是獲得草莓脫毒種苗最佳的脫毒技術(shù)。

表1 不同處理對(duì)草莓組培苗存活的影響

表2 不同處理對(duì)草莓組培苗病原含量的影響

3 結(jié)論

在本試驗(yàn)研究中，通過(guò)5種處理方法獲得的草莓組培苗，經(jīng)檢測(cè)后草莓種苗中的病原含量不同，比較分析篩選出了一種操作簡(jiǎn)便、脫病毒率高的草莓種苗脫毒技術(shù)，即為直接莖尖培養(yǎng)（0.2～0.5 mm莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)）+冷處理（組培苗置于5℃的冰箱中培養(yǎng)60 d）。該技術(shù)可推廣應(yīng)用于草莓脫毒種苗規(guī)?；缰?，同時(shí)對(duì)其他作物的脫毒技術(shù)的研究與應(yīng)用具有重要的參考價(jià)值。