原生質(zhì)體再生法復(fù)壯秀珍菇菌株初探

崔 曉 叢倩倩 王慶武

（泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院食用菌研究所，山東泰安 271000）

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius）學(xué)名為肺形側(cè)耳[1]，20 世紀(jì)后期由我國臺灣省引進并推廣[2]，其營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)高于香菇、草菇，且纖維含量少，口感脆嫩鮮美，深受歡迎[3]。秀珍菇的擴大再生產(chǎn)需要菌種的多次擴繁，而多次擴繁會導(dǎo)致菌種退化，子實體的質(zhì)量和產(chǎn)量下降等問題隨之而來。常見的復(fù)壯方法如挑取不同部位菌絲、組織分離、改良培養(yǎng)基配方等的效果不佳[4-8]，國內(nèi)外鮮有利用原生質(zhì)體再生的方法復(fù)壯秀珍菇的研究報道。筆者首次通過原生質(zhì)體再生的方法復(fù)壯秀珍菇，旨在驗證該方法在秀珍菇菌株復(fù)壯的有效性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

秀珍菇菌株秀-T。經(jīng)多次擴繁后，該菌株有母種在平板上出現(xiàn)角變，擴繁種長速變慢甚至停止生長，出菇試驗產(chǎn)量下降等退化現(xiàn)象。

1.2 母種培養(yǎng)基配方

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，瓊脂20 g，加水定容至1 L。每個平板定量為20 mL。

TB3 再生培養(yǎng)基：酸水解酪蛋白3 g，酵母提取物3 g，蔗糖200 g，葡萄糖10 g，瓊脂8 g，加水定容至1 L。

1.3 原生質(zhì)體制備與再生

供試秀-T 菌株原生質(zhì)體制備與再生的方法參考文獻[9]。

1.4 秀珍菇栽培試驗

以出發(fā)菌株為對照，進行復(fù)壯秀珍菇菌株栽培試驗，每處理重復(fù)3次。聚乙烯塑料折角袋裝料（約裝干料400 g），高壓高溫（115 ℃）滅菌8 h，待料溫降至25 ℃以下，按無菌操作規(guī)范兩端接種。栽培試驗配方及管理參照文獻[10]。記錄菌絲滿袋期、現(xiàn)原基時間、子實體形成時間、第1 潮采收時間，計產(chǎn)并計算生物學(xué)效率。

1.5 菌絲長速測定

母種以“十字交叉法”測量平板中菌絲直徑并計算菌絲長速，原種及栽培種采用“劃線法”測量并計算菌絲長速。每處理重復(fù)10次。

1.6 酶活性定義及復(fù)壯菌株酶活性測定

測定復(fù)壯菌株的羧甲基纖維素酶（CMC 酶）、木聚糖酶、漆酶活性，以出發(fā)菌株為對照（CK）。酶活性測定方法參考文獻[11]。

酶活性定義：特定條件下，1 L 酶液1 min 內(nèi)轉(zhuǎn)化生成1 μmol 葡萄糖所需的酶量，稱為一個國際單位（U）。酶活性用X表示，單位為酶活性單位每升（U/L）。木聚糖酶、CMC 酶活性計算參照文獻[12]。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取0.1 g 烘干后的葡萄糖，溶于水中，定容至100 mL 備用。將不同濃度的葡萄糖溶液與DNS 試劑反應(yīng)，530 nm 測OD 值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。

（2）木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取0.1 g 烘干后的木糖，溶于水中，定容至100 mL 備用。將不同濃度的木糖溶液與DNS 試劑反應(yīng)，530 nm 測OD 值，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進行整理并進行方差分析。采用Duncan’s 新復(fù)極差法統(tǒng)計分析。

1.7 得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.9922x+0.0595，R2=0.9924;木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.9106x+0.047，R2=0.9932。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體再生菌株篩選

2.1.1 原生質(zhì)體再生雙核菌株鏡檢

秀珍菇菌株原生質(zhì)體再生后，挑取的35個再生菌落中，通過分離培養(yǎng)及鏡檢獲得20個具有明顯鎖狀聯(lián)合（圖1）的雙核菌絲體。

圖1 鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)（箭頭所指）

2.1.2 原生質(zhì)體再生菌株初步篩選

將出發(fā)菌株與原生質(zhì)體再生得到的20 株雙核菌株分別接種于平板培養(yǎng)基中觀察，結(jié)果見表1。

由表1 可知，Re-1、Re-2、Re-5、Re-6、Re-9 這5株再生菌株具有明顯生長優(yōu)勢。

2.2 出菇試驗

2.2.1 再生菌株擴繁種生長情況

由圖2、表2可知，經(jīng)再生復(fù)壯后的菌株，其原種和栽培種的菌絲平均長速均高于出發(fā)菌株。原種菌絲平均長速依次為：Re-5＞Re-6＞Re-2＞Re-1＞Re-9＞秀-T（CK），Re-5 生長最快，滿瓶時間比出發(fā)菌株早6 d；栽培種菌絲平均長速依次為：Re-6＞Re-5＞Re-2＞Re-9＞Re-1＞秀-T（CK），且Re-2、Re-5與Re-6 之間差異不顯著，Re-2 與Re-5 生長最快，菌絲滿袋時間比出發(fā)菌株早10.5 d。

表1 異核體分離株的菌絲生物學(xué)特性

圖2 出發(fā)菌株與復(fù)壯菌株擴繁種生長情況

表2 出發(fā)菌株與復(fù)壯菌株擴繁種菌絲生長情況

2.2.2 再生菌株栽培結(jié)果

由圖3、表3可知，經(jīng)再生復(fù)壯后的菌株現(xiàn)原基、子實體形成、第1 潮菇采收時間均比出發(fā)菌株早。并且再生復(fù)壯后的菌株子實體分化快，出菇時間集中，出菇整齊，產(chǎn)量均有所提高。生物學(xué)效率由高到低依次為Re-2＞Re-5＞Re-9＞Re-6＞Re-1＞秀-T（CK），其中Re-2 生物學(xué)效率最高，為62.17%，增產(chǎn)27.90%。

圖3 出發(fā)菌株與復(fù)壯菌株子實體栽培出菇情況

表3 出發(fā)菌株與復(fù)壯菌株栽培結(jié)果

2.3 原生質(zhì)體再生菌株胞外酶活性

秀珍菇為一種木腐菌，能夠分泌一系列的胞外酶降解木質(zhì)纖維素，這些酶能夠通過協(xié)同作用將外界的木質(zhì)纖維素降解成小分子的物質(zhì)以供自身的利用[13]。結(jié)果表明（表4），復(fù)壯后的菌株羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、漆酶活性均高于出發(fā)菌株。復(fù)壯后菌株羧甲基纖維素酶活性由高到低依次為Re-2＞Re-9＞Re-5＞Re-6＞Re-1＞秀-T（CK）；木聚糖酶活性由高到低依次為Re-2＞Re-9＞Re-5＞Re-6＞Re-1＞秀-T（CK）；漆酶活性由高到低依次為Re-2＞Re-9＞Re-6＞Re-5＞Re-1＞秀-T（CK）。

表4 出發(fā)菌株與復(fù)壯菌株胞外酶酶活

3 小結(jié)與討論

在食用菌的菌種復(fù)壯中，采用的方法主要有挑取菌絲尖端法、組織分離法、原生質(zhì)體再生法等。其中，挑取菌絲尖端法操作簡易、技術(shù)難度較低，但往往要挑取多次，周期較長，且經(jīng)出菇驗證其復(fù)壯效果并不理想。組織分離法需用退化菌株的子實體分離，栽培出菇周期較長，而且一旦菌株退化嚴(yán)重或不出菇影響組織分離。原生質(zhì)體再生法的缺點是技術(shù)要求相對較高，優(yōu)點是復(fù)壯效果好，復(fù)壯周期短，減少了后續(xù)試驗的工作量。

近年來，原生質(zhì)體再生法在其他食用菌如平菇[14]、茯苓[15]復(fù)壯中都取得良好效果。樊曉琳等[4]采用灰色系統(tǒng)關(guān)聯(lián)度分析法將不同方法得到的提純復(fù)壯雙孢蘑菇菌株與出發(fā)菌株相比較，得出原生質(zhì)體再生法的提純復(fù)壯效果最好。伍虹蓉[16]利用原生質(zhì)體再生法得到毛木耳復(fù)壯菌株，并且證明其干耳產(chǎn)量同CMC 酶、木聚糖酶活性呈正相關(guān)。由此可見，原生質(zhì)體再生技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食用菌菌種復(fù)壯，但對秀珍菇鮮有報道。

秦俊哲等研究表明，纖維素酶活性高低可以反映菌株活性的強弱[17]，聶榮榮等[18]將漆酶作為金針菇液體菌種活力檢測的生物標(biāo)記物。Ivana Eichlerová 等[19]在研究不同低溫存儲方式對糙皮側(cè)耳菌種影響時，也是以漆酶作為主要參考指標(biāo)。試驗通過原生質(zhì)體再生法復(fù)壯秀珍菇，得到的再生菌株在平板培養(yǎng)基中菌絲恢復(fù)到退化前的長勢強、菌絲健壯、菌落邊緣整齊的菌絲狀態(tài)；復(fù)壯后菌株菌絲胞外酶活性有所提高；出菇試驗中，菇蕾分化及出菇時間提前，生物學(xué)效率提高。其中Re-2各方面指標(biāo)較為理想，可逐步推廣。另外，退化的秀珍菇菌株秀-T 的菌絲菌落不規(guī)則，存在角變，與缺乏氮源菌絲菌落形態(tài)相似[20]。筆者推測秀珍菇秀-T 的退化表現(xiàn)之一為營養(yǎng)元素特別是氮素的吸收不良。由此可見，針對退化秀珍菇的復(fù)壯方法，除了原生質(zhì)體再生法，是否可以通過調(diào)節(jié)母種或栽培料中配方配比來達到復(fù)壯效果（這種復(fù)壯方法已有復(fù)壯杏鮑菇、草菇報道[7，21]），還有待進一步研究。