蛋白酶種類對龜肉酶解液品質的影響

楊昭，曾琳琦，凌葉婷，莫芷晴，何春蘭

廣東食品藥品職業(yè)學院（廣州 510520）

水產(chǎn)品營養(yǎng)價值高，特征性風味突出，由其制備的調味料可滿足消費者對食品健康和營養(yǎng)的需求，具有廣闊的市場前景[1]。我國擁有豐富的水產(chǎn)品資源，利用水產(chǎn)品制備高品質海鮮調味料是我國調味品發(fā)展的一個重要趨勢[2]。

廣東省是龜鱉養(yǎng)殖和消費大省。中華草龜（Chinemys reevesiis）、中華花龜（Ocadia sinensis）和鱷龜（Chelydra serpentina）為廣東省重要的大宗養(yǎng)殖龜類品種[3]。中華草龜、中華花龜和鱷龜均含有豐富的蛋白質，味道鮮美，一般以鮮食為主，現(xiàn)有研究集中于營養(yǎng)成分分析和生物活性肽制備，未有酶解制備呈味基料的報道[4-5]。堿性蛋白酶有較強的蛋白質水解能力，被廣泛應用于水產(chǎn)品調味料的制備[6-8]。胰蛋白酶具有較強的水解能力，風味蛋白酶的酶解液具有較好的感官品質。胰蛋白酶和風味蛋白酶組成復合蛋白酶進行酶解，不僅水解效率高，而且可以獲得品質較佳的酶解液，已在在水產(chǎn)品酶解液的制備過程中廣泛應用[9]。

因此，為探究蛋白酶種類對3種龜肉酶解液品質的影響，采用堿性蛋白酶和復合蛋白酶對中華草龜、中華花龜和鱷龜肉進行水解，考察其對酶解液感官品質、蛋白質含量、蛋白質回收率、肽的分子質量分布和抗氧化活性的影響，以期為龜肉資源的深加工和高值化利用提供理論基礎和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中華草龜、中華花龜、鱷龜，產(chǎn)自廣東肇慶，均為人工室外養(yǎng)殖，宰殺后取出可食用部位肉，于-18℃凍存；風味蛋白酶（酶活 500 LAPU/g）：諾維信中國公司；堿性蛋白酶（酶活20萬 U/g）、胰蛋白酶（酶活 4 000 U/g）：重慶市全新祥盛生物制藥有限公司；卵清蛋白（43 000 Da）、細胞色素C（12 384 Da）、抑肽酶（6 512 Da）、維生素B12（1 355 Da）、氨基酸混合標準品：美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

TSK gel G2000 SWXL色譜柱（300 mm×7.8 mm，5 μm，東曹（上海）生物科技有限公司）；LC-20A高效液相色譜儀（配PDA檢測器，日本島津制作所）；K9840凱氏定氮儀（濟南海能儀器股份有限公司）；DKZ-3B電熱恒溫振蕩水槽（上海一恒科學儀器有限公司）；3K15臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 龜肉酶解液制備

龜肉堿性蛋白酶酶解液制備：取適量冰凍中華草龜肉，室溫解凍后，用絞肉機將其攪碎成糜狀。準確稱取40 g肉糜，加入320 g蒸餾水，攪拌均勻后，調整漿液pH至8.0，加入1%的堿性蛋白酶，迅速攪拌均勻后，在60 ℃水浴搖床中水解3 h。待水解結束，在沸水浴中煮沸滅酶20 min，冷卻后，在8 000 r/min 4 ℃條件下離心20 min，收集上清液，即為中華草龜肉堿性蛋白酶酶解液，記為ACRH。中華花龜肉和鱷龜肉堿性蛋白酶酶解液制備方法與上述方法相同，分別記為AOSH和ACSH。

龜肉復合蛋白酶酶解液制備：取適量冰凍中華草龜肉，室溫解凍后，用絞肉機將其攪碎成肉糜狀。準確稱取40 g肉糜，加入320 g蒸餾水，攪拌均勻后，調整漿液pH至7.0，加入0.3%的風味蛋白酶和0.6%的胰蛋白酶，迅速攪拌均勻后，在55 ℃水浴搖床中水解3 h。待水解結束，在沸水浴中煮沸滅酶20 min，冷卻后，在8 000 r/min 4 ℃條件下離心20 min，收集上清液，即為中華草龜肉復合蛋白酶酶解液，記為CCRH。中華花龜肉和鱷龜肉復合蛋白酶酶解液制備方法與上述方法相同，分別記為COSH和CCSH。

1.2.2 酶解液的感官評價

參照鄧嫣容[10]的方法進行酶解液的感官評價，分別對酶解液的滋味、風味和外觀形態(tài)進行打分，感官評價標準如表1所示。感官評價小組由10名受過感官分析培訓的學生組成（5名男性和5名女性，年齡16-20歲）。感官評價在標準感官評價室進行，選用白光作為光源。

表1 龜肉酶解液感官評價標準

1.2.3 酶解液蛋白質含量及回收率[11]

采用凱氏定氮法測定龜肉原料和酶解液中的總氮含量。按式（1）計算蛋白質回收率。

1.2.4 酶解液肽的分子質量分布

采用高效液相色譜儀對酶解液肽的分子質量分布進行檢測[12]。用流動相將2 mL酶解液在10 mL容量瓶中定容，用0.22 μm微孔濾膜過濾后供進樣。標準肽樣品為卵清蛋白（43 000 Da）、細胞色素C（12 384 Da）、抑肽酶（6 512 Da）和維生素B12（1 355 Da）。檢測波長為220 nm，柱溫箱溫度為30 ℃，流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL。流動相為乙腈-超純水-三氟乙酸（體積比為45∶55∶0.1）。

1.2.5 酶解液抗氧化活性分析

酶解液用蒸餾水稀釋3倍后，取2.0 mL稀釋樣品溶液于離心管中，依次加入2.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和2.0 mL 8 mmol/L H2O2溶液，混勻，于37 ℃水浴10 min，再加入2.0 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，混勻，于37 ℃水浴30 min，在510 nm波長處測定吸光度。用蒸餾水做空白對照[13-14]。羥自由基清除率按式（2）計算。

式中：A1為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL FeSO4溶液+2.0 mL H2O2溶液+2.0 mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度；A2為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL FeSO4溶液+2.0 mL無水乙醇+2.0 mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度；A3為2.0 mL蒸餾水+2.0 mL FeSO4溶液+2.0 mL H2O2溶液+2.0 mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測定均進行3次重復試驗，取平均值。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類對龜肉酶解液感官的影響

酶解液的感官對其應用有重要影響，通常作為呈味基料的酶解液，應具備較強的鮮味、無苦味和無異味，具有特征性風味。酶解液的滋味特性與蛋白酶的種類、酶解條件（溫度、pH、水解程度和料液比等）、底物（肉的種類、預處理方式）有關[15]。由圖1可知，堿性蛋白酶和復合蛋白酶對中華草龜、中華花龜和鱷龜肉酶解液的感官分值有較大影響。6種酶解液感官分值從大到小分別是ACRH、ACSH、COSH、CCSH、CCRH和AOSH。ACRH的感官分值最高，為92.0分，其酶解液呈現(xiàn)澄清、淺黃色、無腥味、強烈鮮味和濃郁肉香味。表明中華草龜肉經(jīng)堿性蛋白酶處理，其酶解液具有較佳的感官分值。AOSH的感官分值最低，為72.5分，其酶解液有較強腥味，且滋味淡，風味差，溶液渾濁。經(jīng)堿性蛋白酶處理，酶解液感官分值從大到小的龜肉品種分別是中華草龜（92.0分）、鱷龜（85.8分）和中華花龜（72.5分）。經(jīng)復合蛋白酶處理，酶解液感官分值從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（84.8分）、鱷龜（83.0分）和中華草龜（77.5分）。

2.2 蛋白酶種類對龜肉酶解液蛋白質含量及回收率的影響

蛋白質含量是酶解液重要的營養(yǎng)指標。由圖2可知，堿性蛋白酶和復合蛋白酶對中華草龜、中華花龜和鱷龜肉酶解液的蛋白質含量有較大影響。6種酶解液蛋白質含量從大到小分別是AOSH、COSH、CCSH、CCRH、ACRH和ACSH。AOSH的蛋白質含量最高，為0.718 g/100 g；ACSH的蛋白質含量最低，為0.520 g/100 g。經(jīng)堿性蛋白酶處理，酶解液蛋白質含量從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（0.718 g/100g）、中華草龜（0.569 g/100 g）和鱷龜（0.520 g/100 g）。經(jīng)復合蛋白酶處理，酶解液蛋白質含量從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（0.700 g/100 g）、鱷龜（0.639 g/100 g）和中華草龜（0.597 g/100 g）。

圖1 蛋白酶種類對龜肉酶解液感官分值的影響

圖2 蛋白酶種類對龜肉酶解液蛋白質含量的影響

圖3 蛋白酶種類對龜肉酶解液蛋白質回收率的影響

由圖3可知，堿性蛋白酶和復合蛋白酶對中華草龜、中華花龜和鱷龜肉酶解液的蛋白質回收率影響較大。6種酶解液蛋白質回收率從大到小分別是AOSH、COSH、CCRH、CCSH、ACRH和ACSH。AOSH的蛋白質回收率最高，為38.54%；ACSH的蛋白質回收率最低，為24.85%。經(jīng)堿性蛋白酶處理，酶解液蛋白質回收率從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（38.54%）、中華草龜（27.89%）和鱷龜（24.85%）。經(jīng)復合蛋白酶處理，酶解液蛋白質回收率從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（34.53%）、中華草龜（29.97%）和鱷龜（29.19%）。中華花龜肉堿性蛋白酶和復合蛋白酶酶解液的蛋白質含量和蛋白質回收率均最高，表明中華花龜肉可能更容易受到這2種蛋白酶的水解。

2.3 蛋白酶種類對龜肉酶解液肽的分子質量分布的影響

酶解液的呈味特性、功能特性、營養(yǎng)價值和生物活性等性質與其所含的小分子肽密切相關。Ogasawara等[16]發(fā)現(xiàn)大豆水解液中分子質量為1 000～5 000 Da的肽具有明顯的鮮味。韓國豆醬水提物中鮮味最強的組分是分子質量為500～1 000 Da的短肽[17]。因此探究蛋白酶種類對龜肉酶解液肽的分子質量分布的影響有重要意義。由圖4可知，6種龜肉酶解液蛋白均含有豐富的小肽，特別是小于1 000 Da的小肽。小于1 000 Da肽面積百分比最高的是COSH（97.10%），最低的是ACRH（71.11%）。1 000～2 000 Da肽面積百分比最高的是ACRH（18.73%），最低的是COSH（1.53%）。通常認為小于2 000 Da的肽都可能具有較強的呈味特性和生物活性，分析龜肉酶解液中小于2 000 Da肽的分子質量分布對了解其組成和活性有一定的指導意義。經(jīng)堿性蛋白酶處理，酶解液中小于2 000 Da肽面積百分比從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（92.01%）、鱷龜（91.45%）和中華草龜（89.84%）。經(jīng)復合蛋白酶處理，酶解液中小于2 000 Da肽面積百分比從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（98.64%）、鱷龜（97.19%）和中華草龜（96.42%）。

圖4 蛋白酶種類對龜肉酶解液肽的分子質量分布的影響

2.4 蛋白酶種類對龜肉酶解液抗氧化活性的影響

羥自由基清除率是抗氧化活性評價的重要方法之一。羥自由基是細胞內反應活性最強的氧族自由基。在金屬離子存在的條件下，羥自由基可由超氧陰離子和過氧化氫作用產(chǎn)生。它能與生物體內蛋白質、多肽和DNA等物質發(fā)生反應，對生物大分子產(chǎn)生最強的氧化破壞效應，引起細胞與組織的氧化損傷，導致器官的病變和機體的衰老[14]。由圖5可知，堿性蛋白酶和復合蛋白酶對中華草龜、中華花龜和鱷龜肉酶解液的羥自由基清除率影響較大。6種酶解液蛋白質回收率從大到小分別是COSH、AOSH、ACRH、ACSH、CCSH和CCRH。COSH的羥自由基清除率最大，為59.70%；CCRH的羥自由基清除率最小，為33.03%。經(jīng)堿性蛋白酶處理，酶解液羥自由基清除率從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（54.72%）、中華草龜（53.63%）和鱷龜（50.77%）。經(jīng)復合蛋白酶處理，酶解液羥自由基清除率從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（59.70%）、中華草龜（33.03%）和鱷龜（37.07%）。中華花龜肉堿性蛋白酶和復合蛋白酶酶解液的羥自由基清除率均最高，表明中華花龜肉可能是較佳的抗氧化肽篩選的原料。

圖5 蛋白酶種類對龜肉酶解液羥自由基清除率的影響

3 結論

此次試驗采用堿性蛋白酶和復合蛋白酶對中華草龜、中華花龜和鱷龜肉進行酶解，考察其對酶解液感官、蛋白質含量、蛋白質回收率、肽的分子質量分布和抗氧化活性的影響。結果表明：ACRH的感官分值最高，為92.0分，其酶解液呈現(xiàn)澄清、淺黃色、無腥味、強烈鮮味和濃郁肉香味。AOSH的蛋白質含量和蛋白質回收率均最高，分別為0.718 g/100 g和38.54%。COSH的小于1 000 Da和小于2 000 Da肽面積百分比均最高，分別為97.10%和98.64%。COSH的羥自由基清除率最大，為59.70%。綜合考慮，COSH的感官分值為84.8分，具有肽面積百分比最高的小分子肽，且具有最大的羥自由基清除率，表明中華花龜肉復合蛋白酶酶解液可能具有較大的研究價值和開發(fā)前景，后續(xù)可以繼續(xù)深入研究其酶解條件優(yōu)化和功能性肽的挖掘與鑒定。