正交試驗(yàn)法優(yōu)選益氣活血顆粒水提工藝△

翁燕，范智毅，劉志輝*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029

益氣活血方來(lái)源于江蘇省中醫(yī)院，由黃芪、炙黃芪、黨參、麥冬、五味子等中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、涼血散瘀的功效。該方在心內(nèi)科門(mén)診已使用多年，以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)組方，不含具有毒性的中藥、無(wú)配伍禁忌、無(wú)藥味超量，若按傳統(tǒng)工藝制備，申報(bào)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑則可以免藥效、毒理和臨床研究資料[1]。本研究采用正交試驗(yàn)法對(duì)益氣活血方進(jìn)行水提取工藝優(yōu)選，為其研究、開(kāi)發(fā)及申報(bào)醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑備案提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KQ-1000E型醫(yī)用超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器公司)；e2695-2998型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；Alltech-ELSD 2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)Alltech公司)；WSK-A型自動(dòng)空氣發(fā)生器(天津市津分分析儀器制造有限公司)；AR2140型電子分析天平(美國(guó)Ohaus公司)。

1.2 試藥

黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110781-201213)；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(南京寧歧醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：150326)；乙腈、甲醇(色譜級(jí)，Merck公司)；甲酸(色譜級(jí)，ROE Scientific Inc)；水為超純水；正丁醇和氨水為分析純。

處方飲片均來(lái)自江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部，由顧和亞主任中藥師鑒定，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷的含量測(cè)定

2.1.1色譜條件 Hedera C18ODS-2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(32∶68)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；漂移管溫度：103 ℃；載氣流量：2.7 L·min-1[2-3]。

2.1.2溶液的制備 對(duì)照品溶液制備：精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量于量瓶中，以甲醇定容，得質(zhì)量濃度為1.051 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

供試品溶液制備：量取益氣活血方水提液30 mL，每次加入水飽和正丁醇溶液30 mL萃取，共4次。每次以40 mL氨試液充分洗滌合并得正丁醇液，共洗滌2次后，棄氨試液，取正丁醇液于水浴蒸干，甲醇溶解殘?jiān)?，定容?0 mL量瓶中，取續(xù)濾液。

陰性樣品溶液制備：取缺黃芪/炙黃芪陰性制劑，按供試品溶液制備方法操作，即得[4-6]。

2.1.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取2.1.2項(xiàng)下各溶液，注入高效液相色譜儀，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，得高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD)圖(圖1)。結(jié)果表明，益氣活血方供試品與對(duì)照品在相同保留時(shí)間處均有較大吸收，陰性無(wú)干擾。

注：A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.黃芪甲苷。圖1 益氣活血方黃芪甲苷色譜圖

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線 將黃芪甲苷對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋至質(zhì)量濃度分別為1 051.00、840.80、525.50、262.75、131.38、105.10 μg·mL-1，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。得回歸方程Y=1.694 1X+4.973 4(r=0.999 5)。結(jié)果表明，黃芪甲苷的檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為1.051～10.51 μg。

2.1.5精密度試驗(yàn) 將質(zhì)量濃度為262.75 μg·mL-1的黃芪甲苷對(duì)照品，按2.1.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣6次測(cè)定，以黃芪甲苷峰面積計(jì)，RSD為0.45%，表明儀器精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一益氣活血方(批號(hào)：1607002)供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下條件，于供試品配制后0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測(cè)定，結(jié)果以黃芪甲苷峰面積計(jì)，RSD為3.54%，表明該方法12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批益氣活血方樣品(批號(hào)：1607002)，共6份，依2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定得黃芪甲苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.14 mg·g-1，RSD為4.92%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8加樣回收試驗(yàn) 取已知指標(biāo)成分含量的益氣活血方樣品6份，并精密加入黃芪甲苷對(duì)照品適量，依2.1.2、2.1.1項(xiàng)下方法制備、測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 HederaC18ODS-2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫(0～10 min，10%～20%A；10～20 min，20%～30%A；20～25 min，30%A；25～27 min，30%～10%A；27～30 min，10%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL[7-8]。

2.2.2溶液的制備 對(duì)照品溶液制備：精密稱定毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，加甲醇制成對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度為1.02 mg·mL-1。

供試品溶液制備：精密吸取益氣活血方水提液2 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇適量使溶解并定容，取續(xù)濾液，即得。

陰性樣品溶液制備：取缺黃芪/炙黃芪的陰性制劑，依“供試品溶液”方法制備缺黃芪/炙黃芪陰性溶液。

2.2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性溶液，按2.2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。益氣活血方供試品與對(duì)照品在相同位置均有較大吸收，且陰性無(wú)雜質(zhì)干擾。

注：A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性樣品；2.毛蕊異黃酮葡萄糖苷。圖2 益氣活血方中毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜圖

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取上述對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為255.000、127.500、25.500、12.750、6.375、3.188、1.594 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，得回歸方程Y=23 473X+25 945(r=0.999 9)。毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.016～2.550 μg·mL-1響應(yīng)值與質(zhì)量濃度之間線性關(guān)系良好。

2.2.5精密度試驗(yàn) 精密吸取25.5 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分值，RSD為0.34%，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批益氣活血方樣品(批號(hào)：1607002)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品，按2.2.1項(xiàng)下條件，分別于配制后0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測(cè)定，結(jié)果以峰面積計(jì)RSD為0.54%，表明該方法12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批益氣活血方樣品(批號(hào)：1607002)6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定，結(jié)果平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.13 mg·g-1，RSD=1.83%(n=6)，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.2.8加樣回收率試驗(yàn) 取已知指標(biāo)成分含量的益氣活血方樣品，共6份，精密加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 出膏率的測(cè)定

精密吸取益氣活血方水提液樣品適量，置干燥的恒重蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，放入烘箱中，設(shè)定溫度為105 ℃，干燥3 h，取出后再于干燥器中冷卻20 min，精密稱定并按公式(1)計(jì)算。

(1)

2.4 單因素試驗(yàn)

影響水煎煮的因素有很多，如飲片大小、浸泡與否等，但主要影響因素還是提取次數(shù)、提取時(shí)間和加水量。

2.4.1提取次數(shù)的考察 按益氣活血處方稱取飲片共5份，分別加入10倍量的水，浸泡1 h，按提取次數(shù)為1、2、3、4、5次煎煮，每次1 h，濾過(guò)，濃縮，再加水定容至適量。按2.1～2.3項(xiàng)下方法制備供試品、測(cè)定、計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 益氣活血方提取次數(shù)與轉(zhuǎn)移率、出膏率關(guān)系

由圖3可知，煎煮液中黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率在煎煮3次后增加不明顯，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉(zhuǎn)移率在煎煮第1～4次間呈緩慢線性增加，兩者的轉(zhuǎn)移率在煎煮4次后均稍有降低；出膏率在煎煮2次后增加不明顯。

2.4.2提取時(shí)間的考察 按益氣活血處方稱取飲片5份，分別加入10倍量的水，浸泡1 h，按提取時(shí)間為0.5、1、1.5、2、2.5 h，分別提取1次，濾過(guò)，濃縮，再加水定容至適量。按2.1～2.3項(xiàng)下方法制備供試品、測(cè)定、計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 益氣活血方提取時(shí)間與轉(zhuǎn)移率、出膏率關(guān)系

由圖4可知，煎煮液中黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率在煎煮1.5 h后開(kāi)始下降；毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉(zhuǎn)移率及出膏率隨時(shí)間增加變化不明顯。

2.4.3加水量的考察 按處方稱取飲片5份，按加水量6、8、10、12、14倍分別加水，浸泡1 h，提取1次，每次1 h，濾過(guò)，濃縮，再加水定容至適量。按2.1～2.3項(xiàng)下方法分別制備供試品、測(cè)定、計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 益氣活血方加水量與轉(zhuǎn)移率、出膏率關(guān)系

由圖5可知，煎煮液中黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率在加入10倍水的條件下增加明顯，加入12、14倍水轉(zhuǎn)移率差別不大；毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉(zhuǎn)移率在加入6、8、10倍水時(shí)變化不明顯，加入12倍水時(shí)稍有增加。出膏率的增加幅度較小。

2.5 正交試驗(yàn)

2.5.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇提取時(shí)間(A)、提取次數(shù)(B)和加水量(C)為考察因素，平行操作條件下，以黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率、毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉(zhuǎn)移率、出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按 L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

2.5.2水煎煮工藝因素水平的選擇 選用正交試驗(yàn)表L9(34)，見(jiàn)表3。

表3 益氣活血方水煎煮工藝因素水平

2.5.3水煎煮正交試驗(yàn)結(jié)果 黃芪、炙黃芪為方中君藥，所占比例較大，將兩者主要有效成分設(shè)為主要指標(biāo)，出膏率為次要指標(biāo)。設(shè)黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率權(quán)重為0.4，毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉(zhuǎn)移率權(quán)重為0.4，出膏率權(quán)重為0.2，結(jié)果見(jiàn)表4～5。

綜合得分=黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率×0.4+
毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉(zhuǎn)移率×0.4+出膏率×0.2

(2)

表4 益氣活血方水煎煮工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析

表5 益氣活血方水煎煮工藝正交方差分析

由表4可知，B對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較顯著。選擇的3個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響由大到小順序?yàn)锽>C>A，最佳提取工藝條件為 A2B3C3。由表5可知，B影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，A、C對(duì)結(jié)果影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合考慮生產(chǎn)的各方面因素，確定加12倍量水，提取3次，每次煎煮1 h為最佳提取工藝。

2.5.4水煎煮工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按益氣活血處方稱取3份與正交試驗(yàn)相同批次的飲片，按優(yōu)選的提取工藝參數(shù)進(jìn)行煎煮，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 益氣活血方水煎煮工藝正交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) %

所得結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果最大值基本接近?？膳袛啵瑑?yōu)選的工藝可行、穩(wěn)定。

2.6 傳統(tǒng)煎煮法

2.6.1傳統(tǒng)煎煮的方法 稱取益氣活血處方中各味飲片，平行5份，煎煮2次，第一煎加水500 mL浸泡1 h，武火煮沸后文火煎煮0.5 h，濾過(guò)；第二煎藥渣加水200 mL煎煮0.5 h，合并濾液備用。

2.6.2試驗(yàn)方法與結(jié)果 按2.1～2.3項(xiàng)下方法制備供試品、測(cè)定、計(jì)算，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 益氣活血方傳統(tǒng)煎煮法試驗(yàn)結(jié)果 %

2.6.3傳統(tǒng)煎煮方法與優(yōu)選工藝結(jié)果比較 將傳統(tǒng)煎煮方法與優(yōu)選工藝結(jié)果比較，見(jiàn)圖6。

圖6 益氣活血方傳統(tǒng)煎煮法與優(yōu)選工藝結(jié)果比較

由圖6可知，優(yōu)選工藝煎煮液的出膏率及有效成分的轉(zhuǎn)移率均高于傳統(tǒng)煎煮方法，進(jìn)一步驗(yàn)證了優(yōu)選工藝的可靠性。

3 討論

黃芪、炙黃芪為方中君藥，所占比例較大，且補(bǔ)氣升陽(yáng)作用明顯，與本方專于治療氣虛血瘀型冠心病相一致。故選取黃芪、炙黃芪主要成分作為考察指標(biāo)。

在建立毛蕊異黃酮葡萄糖苷HPLC時(shí)，曾參考《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版梯度洗脫方法，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫(0～20 min，20%～40%A；20～30 min，40%A)，發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮葡萄糖苷與其他成分的分離并不理想。后改現(xiàn)用的梯度洗脫方法，可以較好地與其他組分分離。

益氣活血方已應(yīng)用多年，臨床上患者使用的是中藥湯劑，其攜帶、貯存及服用不方便，劑量也不十分準(zhǔn)確，因此，需進(jìn)行劑型改進(jìn)。以湯劑為基礎(chǔ)的內(nèi)服制劑可有合劑、顆粒劑等多種口服劑型選擇。合劑保持了湯劑的用藥特點(diǎn)，但其攜帶、貯存不便。顆粒劑不僅具備湯劑相對(duì)用藥量大、起效迅速的特點(diǎn)，還具有攜帶、貯存運(yùn)輸方便、穩(wěn)定性好、服用量準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn)，也克服了膠囊劑和片劑載藥量相對(duì)有限、服用量達(dá)不到治療劑量的缺陷，因此，選擇了顆粒劑作為益氣活血方的劑型。顆粒劑的成型工藝及設(shè)備有多種，如濕法制粒、干法制粒、一步制粒法等。一步制粒是目前最常用的工藝方法，便于自動(dòng)控制，生產(chǎn)環(huán)境更加符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，并在很大程度上解決了中藥浸膏黏性大、成型困難等問(wèn)題。后續(xù)按照優(yōu)選工藝采用一步制粒法進(jìn)行了3批中試研究，即加12倍量水，煎煮3次，每次1 h。濾液先減壓濃縮(70～75 ℃，-0.04～-0.08 MPa)至相對(duì)密度為1.20(60 ℃)左右，趁熱將甜菊素加入，備用。一步制粒前，將稠浸膏加純化水稀釋至相對(duì)密度為1.15～1.20(20 ℃)。制粒時(shí)，先將糊精吸入流化床中，設(shè)置進(jìn)風(fēng)溫度為90～100 ℃，待物料溫度達(dá)到70～80 ℃時(shí)，開(kāi)始進(jìn)液。根據(jù)實(shí)際情況及時(shí)調(diào)節(jié)進(jìn)樣速度(80～150 r·min-1)、霧化壓力(1.5～2.0 kg·cm-2)、進(jìn)風(fēng)量(800～1800 m3·h-1)。進(jìn)液結(jié)束后，70 ℃干燥約1 h。3批中試產(chǎn)品黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率分別為40.49%、40.90%、41.16%，毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉(zhuǎn)移率分別為46.36%、41.82%、41.45%。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝，為益氣活血顆粒開(kāi)發(fā)為醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑提供了參考。

醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑多選取醫(yī)院臨床應(yīng)用效果良好的處方研制，療效確切、使用方便、價(jià)格低廉，同時(shí)也能體現(xiàn)中醫(yī)藥特色治療優(yōu)勢(shì)?！吨腥A人民共和國(guó)中醫(yī)藥法》、2018年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布關(guān)于的“對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)用傳統(tǒng)工藝配制中藥制劑實(shí)施備案管理的公告(2018年第19號(hào))”等相關(guān)法規(guī)及細(xì)則的出臺(tái)，將給醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑研制與開(kāi)發(fā)帶來(lái)更多的激勵(lì)、機(jī)遇和挑戰(zhàn)[9-11]。