基于納米材料的臨床檢驗與診斷技術(shù)研究進展

沈 俊，陳 瑩，王 鑫，張林艷，顧 兵，裴 兵，楊 歡

1徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221004；2蘇州工業(yè)園區(qū)疾病防治中心，江蘇 蘇州 215100；3羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司專業(yè)和分子診斷部，上海 200131；4宿遷市第一人民醫(yī)院臨床檢驗科，江蘇 宿遷 223800

隨著醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，臨床醫(yī)學(xué)實踐中各種疾病的早期診斷對體外診斷技術(shù)的靈敏度、檢測限、檢測速度等性能指標(biāo)提出了越來越高的要求，這使得許多傳統(tǒng)的、常規(guī)的體外診斷技術(shù)逐漸不能滿足疾病診斷的需要。同時，隨著“一帶一路”建設(shè)的展開和對外開放的進一步加深，我國防控輸入性疾?。?］和對外醫(yī)療援助［2］的難度與需求也空前增高，不同的應(yīng)用環(huán)境也對實驗診斷技術(shù)的分析速度、檢測成本、操作難度等提出了各種各樣的要求。近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料在體外診斷領(lǐng)域的應(yīng)用也引起了越來越多的關(guān)注和研究。這些基于納米材料的檢測技術(shù)常常具有高靈敏度、高特異度、檢測速度快等特點，因而在早期診斷、快速診斷、及時檢驗（point-of-care testing，POCT）等方面具有極大的潛力。此前，李萬萬等［3］和張?zhí)K琳等［4］分別對基于納米材料的體外診斷技術(shù)進行了介紹，其中前者側(cè)重對納米材料的介紹；后者側(cè)重于醫(yī)學(xué)研究。本文將對應(yīng)用于臨床檢驗與診斷領(lǐng)域的常見納米材料，以及近年來基于納米材料的蛋白、核酸檢測技術(shù)等方面的最新研究進展作一綜述。

1 常見納米材料

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸（0.1～100 nm），或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料，具有獨特的磁性、光學(xué)、熱力學(xué)性質(zhì)等尺寸依賴性理化性質(zhì)。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料在體外診斷領(lǐng)域的應(yīng)用也引起了越來越多的關(guān)注。在表面修飾抗體、探針或其他生物識別元件后，可使納米材料在自身特性的基礎(chǔ)上獲得對特定檢測對象的靶向性。在眾多納米材料中，磁性納米粒（magnetic nanoparticle，MNP）、量子點（guantum dot，QD）和納米金粒子（gold nanoparticles，AuNP）在體外診斷領(lǐng)域的研究較為常見。

1.1 MNP

MNP是一種具有超順磁性的納米材料，即當(dāng)外磁場存在時，MNP具有磁性，而當(dāng)外磁場撤離時磁性消失。在MNP上連接單克隆抗體、核酸探針等，靶向捕獲目標(biāo)物質(zhì)后，通過外加磁場，使目標(biāo)物質(zhì)被吸附而滯留于磁場中，而使其他物質(zhì)被分離。通過這種磁分離技術(shù)，可達到在短時間內(nèi)完成分離和富集的目的，從而提高檢出率。張俊仙等［5］用抗酸染色、普通PCR和磁納米捕獲-PCR方法檢測確診肺結(jié)核病患者痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌，結(jié)果顯示由于結(jié)核分枝桿菌得到濃縮、聚集和純化，除去了不利于PCR擴增的抑制因子，磁納米捕獲-PCR技術(shù)的檢測陽性率遠高于抗酸染色檢查（27.0%）和普通PCR檢測（47.4%），達到了82.9%。此外，徐源［6］、黃偉等［7］團隊也利用MNP的富集純化能力，分別構(gòu)建了對外周血循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）和手足口病腸道病毒的檢測方法，均具有較為可靠的診斷性能。

1.2 QD

熒光標(biāo)記技術(shù)是指將能發(fā)射熒光的物質(zhì)通過共價結(jié)合或物理吸附等方式標(biāo)記于所研究分子的某個基團上，用它的熒光特性來反映研究對象的信息。面世以來，熒光標(biāo)記技術(shù)以其獨特的優(yōu)勢和特性在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得了極為廣泛的應(yīng)用。目前常用的傳統(tǒng)熒光染料主要有熒光素染料、羅丹明類染料、菁染料等，在不同的檢測方法中發(fā)揮著重要作用［8］，但與此同時，這些染料也存在著光淬滅率高、對pH值敏感、發(fā)射光譜寬等問題。

QD 又稱膠體半導(dǎo)體納米晶，是一種具有獨特光物理性質(zhì)的半導(dǎo)體納米晶，自20 世紀(jì)80 年代發(fā)現(xiàn)以來，迅速成為納米科學(xué)和納米技術(shù)的前沿［9］。QD 具有抗光漂白性強、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、不易化學(xué)降解、熒光壽命長、發(fā)射光的顏色隨粒徑變化等特點［10］，可突破傳統(tǒng)染料的局限性，實現(xiàn)在同一激發(fā)波長下對不同物質(zhì)的檢測。QD 可用于檢測各種抗原物質(zhì)、病原體和生物分子，也可用于對組織、細胞進行免疫標(biāo)記等［11］，在分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物篩選、生物大分子相互作用等研究中有極大的應(yīng)用前景［12］。

Suzuki 等［10］用QD 和抗體開發(fā)了一種量子點連接免疫吸附法（QLISA），并基于這種方法建立了一種微量IL-6的檢測方法，可用于0.05 ng/mL 級別IL-6的檢測。Zhou等［13］對一種基于QD的高靈敏度肌鈣蛋白的檢測方法進行了評估，該方法將1～2 h 的檢測時長縮短至12 min，且使用全血標(biāo)本，保證了對急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）較高的診斷效率，更適用于POCT的檢測和快速診斷。

1.3 AuNP

AuNP 作為人類最早認(rèn)識并應(yīng)用的納米材料之一，在整個納米材料研究領(lǐng)域中占據(jù)著重要地位。AuNP具有易于表面修飾、較高的生物相容性、獨特的光學(xué)特性等特點［14］，應(yīng)用于諸多體外診斷的檢測體系中，如在生物條形碼技術(shù)（bio-barcode assay，BCA）中，利用AuNP 比表面積大、易于表面修飾等特性，在AuNP上修飾了大量單鏈DNA，這是實現(xiàn)該技術(shù)“信號擴增”的關(guān)鍵［15-16］；借助AuNP的納米材料表面能量轉(zhuǎn)移（nanometal surface energy transfer，NSET）特性，Yuan等［17］構(gòu)建了一種能對尿液標(biāo)本中精胺進行痕量檢測的方法，證明了其能成為有機染料猝滅劑的替代品，可以為各種生物分析物構(gòu)建可激活探針；此外，也有研究者發(fā)現(xiàn)，在PCR反應(yīng)體系中加入適量的AuNP，可減少引物和單鏈DNA 模板之間的錯配，提高PCR反應(yīng)的特異性［18］。

2 納米材料在蛋白質(zhì)檢測分析中的應(yīng)用

2.1 鄰位連接技術(shù)

鄰位連接技術(shù)（proximity ligation assay，PLA）是一種將蛋白定量檢測轉(zhuǎn)化為核酸定量檢測的技術(shù)，是用于檢測目標(biāo)蛋白或蛋白之間相互作用的特殊免疫分析方法。在PLA技術(shù)中，一對可識別目標(biāo)蛋白不同抗原表位的抗體通過共價交聯(lián)或者生物素-親和素分別與一條寡核苷酸探針（單鏈DNA）相連。這對抗體結(jié)合在目標(biāo)蛋白的相鄰表位后，加入一段可分別與前述兩個探針互補的寡聚脫氧核苷酸（connector oligonucleotides），在連接酶的作用下，3段單鏈DNA形成的雜交分子被連接形成一條新的DNA片段，隨即通過熒光定量PCR技術(shù)對DNA進行定量，從而實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白的定量檢測［19］。2007年，Schallmeiner 等［20］報道了一種3PLA 技術(shù)，提升了敏感性和檢測范圍；之后在2013 年，Nong 等［21］介紹了一種具有高特異性、樣本量變化范圍廣（從幾微升到幾毫升）的固相PLA技術(shù)?；诩{米材料的鄰位連接技術(shù)（nanoparticle-based proximity ligation assay，NP-PLA）是由Chen等［22］在PLA及其衍生技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)的超靈敏檢測技術(shù)。Chen等［22］在PLA中引入納米粒子，不再將核酸探針與抗體耦聯(lián)，而是將納米粒子耦聯(lián)在抗體上后，將生物素化的核酸探針結(jié)合在納米粒子表面空余的親和素位點上，由此，NP-PLA 兼具了3PLA 和固相PLA 的優(yōu)點。隨后，Chen 等［22］使用這一技術(shù)完成了對人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）的檢測和定量，其檢測限低至2.6 fmol/L，幾乎是ELISA 技術(shù)的1 000倍。

2.2 AuNP作標(biāo)記物的蛋白檢測技術(shù)

AuNP 是一種無毒、易于表面修飾、具有較高生物相容性和獨特光學(xué)特性的納米材料［14］。AuNP 由于其局部表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）、表面增強拉曼散射（surface enhancement of Raman scattering，SERS）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（F?rster resonance energy transfer，F(xiàn)RET）等獨特的物理和光學(xué)性質(zhì)被應(yīng)用于諸多領(lǐng)域［23］。在此討論AuNP在蛋白質(zhì)檢測中的應(yīng)用。

金納米簇（gold nanoclusters，AuNC）是一種小于2 nm 的新型熒光材料，由2～100 個金原子組成。根據(jù)組成和大小的不同，AuNC 的發(fā)射光譜可在紫外區(qū)到近紅外區(qū)改變，利用AuNC的這一特性，可選擇背景干擾小的波長［23］。由于AuNC 易于聚集，因此適當(dāng)?shù)呐潴w對于穩(wěn)定其熒光和大小必不可少，常用的配體有牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）等［24-25］。將AuNC 作為熒光基團，選用某種特定的物質(zhì)作為淬滅基團，通過FERT 淬滅其熒光；當(dāng)兩者形成的這一體系遇到目標(biāo)物質(zhì)時，AuNC 與淬滅基團分離，淬滅作用消失而使熒光恢復(fù)，以實現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的檢測（圖1）［24-27］。根據(jù)AuNC 的這種性質(zhì)，Xu 等［24］設(shè)計并制備了一種基于AuNC 和AuNP 的新型熒光探針，用于尿液L-半胱氨酸的檢測。Menon 等［25］使用BSA-AuNC 標(biāo)記胰島素抗體，構(gòu)建了一種檢出限為1.1×10-10g/mL 的胰島素檢測方法。

圖1 基于AuNC的檢測技術(shù)模式圖Figure 1 Basic principles of protein detection using AuNC

NSET 是一種類似于FRET 的現(xiàn)象。AuNP 已被證明是一種高效的能量受體，當(dāng)AuNP 和熒光基團接近到一定范圍時，熒光基團的能量即轉(zhuǎn)移至AuNP 表面，發(fā)生熒光淬滅。兩者不同之處在于FRET 有著嚴(yán)格的距離（100?，1?=10-10m）和方向限制，而NSET的偶極-納米表面?zhèn)鬟f距離可以在更長的距離上具有更高的淬滅效率，因此，AuNP有機會成為有機染料猝滅劑的替代品，為各種生物分析物構(gòu)建可激活的探針［17，23］。Yuan等［17］利用金納米棒、四羧基苯基卟啉和小牛胸腺DNA（ctDNA）的相互作用開發(fā)了一種基于NSET的惡性腫瘤生物標(biāo)志物精胺的檢測方法，實現(xiàn)了對尿液標(biāo)本中精胺的痕量檢測［17］。

在科學(xué)研究和許多疾病的早期診斷和治療中，實現(xiàn)檢測超低水平的蛋白質(zhì)標(biāo)志物至關(guān)重要。在這些方法中，NP-PLA 和BCA［15］（在后文中詳細介紹）將不可擴增的蛋白質(zhì)檢測轉(zhuǎn)化為核酸檢測，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的高靈敏度檢測。根據(jù)反應(yīng)體系中所用的抗體不同，NP-PLA 和BCA 的檢測對象非常廣泛，但同時意味著其特異性受所用抗體特異性的影響；AuNP 作標(biāo)記物的蛋白檢測技術(shù)，利用AuNP 的FERT或NSET特性，構(gòu)建了類似于實時熒光PCR中熒光探針的熒光信號系統(tǒng)，并以一定線性范圍內(nèi)熒光強度的增量［24-25］或減量［17］反映物質(zhì)間的相互作用，從而實現(xiàn)了超低水平的蛋白質(zhì)檢測。

3 納米材料在核酸檢測分析中的應(yīng)用

3.1 納米層析技術(shù)

納米層析試紙條是一類基于橫向流動檢測（lateral flow assay，LFA）可用于對PCR 擴增［28-29］、雜交鏈反應(yīng)（hybridization chain reaction，HCR）［30］、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［31］等擴增獲得的核酸產(chǎn)物進行快速驗證的裝置。相比傳統(tǒng)的電泳、成像等方法，使用基于納米層析試紙條的納米層析技術(shù)對核酸產(chǎn)物進行驗證不需要昂貴的儀器，操作簡便，且具有耗時短、特異性強等優(yōu)點，適合在設(shè)備條件有限的地區(qū)應(yīng)用，同時也可以滿足POCT的需求［31-32］。

Ying 等［30］使用納米層析試紙條檢測通過雜交鏈反應(yīng)獲得的擴增產(chǎn)物復(fù)合體，開發(fā)了一種針對沙門菌屬16S rRNA 的可視化檢測方法（圖2），其檢測限為3×103CFU/mL。

圖2 納米層析試紙條［30］Figure 2 lateral flow nucleic acid test strips［30］

3.2 納米材料輔助PCR技術(shù)

自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR 技術(shù)）出現(xiàn)以來，人類對DNA 和RNA 的檢測和分析能力不斷進步，現(xiàn)已成為診斷疾病的一項重要手段。PCR 技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)和體外診斷領(lǐng)域中最基本且最受歡迎的技術(shù)之一，可將極微量的DNA 擴增數(shù)百萬倍，使其達到可檢測的水平，被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域。自該技術(shù)誕生以來，大量研究人員從試劑、儀器和PCR 程序?qū)用鎸ζ溥M行了改進和優(yōu)化，大大提高了擴增效率，并逐漸發(fā)展出巢式PCR、多重PCR、RT-PCR、熒光定量PCR、數(shù)字PCR 等適用于不同目的、高靈敏度的方法［33］。但與敏感性的提高相比，PCR 技術(shù)的特異性仍未達到標(biāo)準(zhǔn)，并在對富含GC片段、DNA長片段擴增分析中存在一定問題［18］，盡管人們發(fā)現(xiàn)在PCR體系中加入如二甲基亞砜［34］、BSA［34］、單鏈結(jié)合蛋白（single strand DNA-binding protein，SSB）［35］等作為增強劑（enhencer）可促進PCR 擴增，但總體效果仍不甚理想。

隨著納米技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的逐步滲透，納米材料輔助PCR（nanoPCR）技術(shù)受到了廣泛關(guān)注?，F(xiàn)有研究表明，納米粒子在PCR反應(yīng)體系中的作用主要體現(xiàn)在3個方面。①與DNA 分子結(jié)合：納米粒子（如AuNP、碳納米管等）可與單鏈DNA結(jié)合，從而減少引物和單鏈DNA模板之間的錯配。此外，一些納米粒子也可以促進PCR 反應(yīng)過程中DNA 模板的雙鏈解離，降低解鏈溫度［18，36-37］。②與DNA 聚合酶相互作用：一些納米粒子可增強DNA 聚合酶的活性，但過高濃度的納米粒子會對DNA聚合酶產(chǎn)生抑制作用，這種抑制作用在一定程度上可以通過增加DNA聚合酶使用量來抵消［18，37］。③納米粒子具有優(yōu)良的熱傳導(dǎo)性，可使PCR反應(yīng)體系更快地達到設(shè)定溫度，提高擴增效率，并使引物和模板之間更高效地配對［18，36］。

有研究報道了一種對食腦阿米巴原蟲的NanoPCR 檢測方法，他們將石墨烯氧化物、氧化銅和氧化鋁3種納米材料加入普通PCR體系中，實現(xiàn)了對幾種阿米巴的快速診斷，且核酸擴增產(chǎn)物的電泳條帶灰度值為不加納米粒子對照組的1.25～2倍，可見其擴增產(chǎn)率增加［36］。Yang 等［37］在PCR 體系中加入不同濃度的AuNP，分別使用Pfu聚合酶和Taq聚合酶成功擴增了富含鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的片段，為基因組中富GC片段的擴增提供了一種可行的方法。

3.3 納米孔測序技術(shù)

上世紀(jì)70年代中期，以雙脫氧鏈終止法（Sanger法）［39］為代表的第1 代測序技術(shù)的出現(xiàn)開啟了人類對基因組探索的歷程。1990—2003 年的人類基因組計劃（human genome project，HGP）直接推動了測序技術(shù)的發(fā)展，此后，測序技術(shù)發(fā)展迅猛，第2代、第3代測序技術(shù)應(yīng)運而生。

納米孔是一種納米大小的孔，由生物分子自組裝或在固體基質(zhì)上進行物理鉆孔形成，可分為生物納米孔、固態(tài)納米孔以及由兩者結(jié)合而成的復(fù)合納米孔3類。納米孔測序的基本原理是將電流應(yīng)用于納米級的分子孔，然后使遺傳物質(zhì)從中通過，由于構(gòu)成遺傳物質(zhì)的堿基的分子結(jié)構(gòu)和體積存在差異，不同堿基穿過納米孔時引起不同的電流變化，由此即可得出所測DNA 或RNA 的序列信息（圖3）［40-41］。作為一種高通量、高讀長、實時數(shù)據(jù)輸出［42］的單分子測序技術(shù)，納米孔測序技術(shù)被認(rèn)為是第3 代測序技術(shù)的一個重要發(fā)展方向。此外，納米孔測序技術(shù)還因具有無需各種酶的參與、無需生物分子修飾標(biāo)記或表面固定化技術(shù)、低成本等優(yōu)勢［40］，而在美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）的“1 000美元基因組計劃”中脫穎而出。目前，由牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technology，ONT）開發(fā)的幾代產(chǎn)品已開始應(yīng)用于體外診斷和公共衛(wèi)生等領(lǐng)域。

圖3 納米孔測序Figure 3 Nanopore sequencing

此前，納米孔測序技術(shù)因為錯誤率相對較高、需要多次處理消除測序錯誤等問題而影響了其對于第2 代測序技術(shù)（next-generation sequencing technology，NGS）的競爭力［41，43-44］，但隨著該測序技術(shù)的成熟完善帶來的測序準(zhǔn)確率的提高，其高通量、高讀長、實時數(shù)據(jù)輸出以及可以進行直接RNA測序的優(yōu)勢逐漸得以體現(xiàn)。ORSINI 等［45］開發(fā)了一種基于納米孔測序的快速檢測BCR-ABL1 融合基因的方法，這對急性白血病等急需得出診斷結(jié)果的疾病診斷有極大意義。使用納米孔測序技術(shù)以原生RNA形式對流感病毒基因組進行直接測序，顛覆了以往先用逆轉(zhuǎn)錄酶合成DNA 后測序的流程，避免了CG偏倚，同時保留了基因組中的堿基修飾信息，在相關(guān)領(lǐng)域研究中具有重大價值［41］。除此以外也有利用納米孔測序技術(shù)在西非疫區(qū)實驗室對埃博拉病毒進行測序［46］和在7～12.5 h內(nèi)得到結(jié)核分枝桿菌鑒定全基因組測序的結(jié)果，并借此得出種屬鑒定和耐藥性推測的報道［47］。在新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）大流行期間，納米孔測序方法在病毒基因組測序［48］、進一步開發(fā)和完善檢測技術(shù)以應(yīng)對病毒變異［49-50］的過程中發(fā)揮著重要作用。

目前，實時熒光PCR技術(shù)是核酸檢測技術(shù)中的主流方法，具有極高的普及率。因此，在評價核酸檢測技術(shù)時，往往需要以該技術(shù)為參照。在上述核酸檢測技術(shù)中，納米層析技術(shù)作為一種單純的核酸產(chǎn)物的檢測手段，實驗步驟必然會多于集擴增、產(chǎn)物檢測于一體的實時熒光PCR方法，因此應(yīng)選擇諸如LAMP 等設(shè)備要求不高的核酸擴增方法，開發(fā)適用于現(xiàn)場的即時檢驗方法；PCR 方法普遍具有升降溫過程長、耗時、具有一定假陰性率的缺點，在體系中加入納米粒子后擴增效率和敏感性得到提升；納米孔測序技術(shù)作為一種高通量、高讀長的測序技術(shù)，已在多個研究和應(yīng)用領(lǐng)域中發(fā)揮作用，是核酸檢測技術(shù)的強力補充。

4 納米材料在體外檢測領(lǐng)域中的其他應(yīng)用

4.1 納米生物傳感器

生物傳感器是將生物活性材料與適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)元件組合在一起用來選擇性并且可逆性地檢測各種類型樣品中的生物化學(xué)物質(zhì)濃度或活性的裝置［51］，主要由識別元件和理化轉(zhuǎn)換器構(gòu)成。生物傳感器?？煞譃楣鈱W(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器和壓電傳感器，具有響應(yīng)迅速、靈敏度高、可實現(xiàn)實時和多重檢測、使用便捷、檢測成本低、體積小等優(yōu)點［52］，對海關(guān)和傳染病暴發(fā)現(xiàn)場的疾病防控以及相對落后國家或地區(qū)的疾病診斷具有重要意義。納米生物傳感器是將納米材料（如金納米簇［17］、金納米線［53］、碳量子點［54］等）與生物傳感器結(jié)合制成的復(fù)雜儀器，綜合應(yīng)用光、電、聲、色等各種先進檢測技術(shù)，以實現(xiàn)對核酸、蛋白質(zhì)、酶活性、微生物等［53-56］乃至重金屬離子等環(huán)境有毒物質(zhì)［57］進行檢測的復(fù)雜儀器，對臨床檢測、食品安全、環(huán)境監(jiān)測、國家安全等多個領(lǐng)域產(chǎn)生影響。Aghili 等［53］研發(fā)了一種用于檢測血清中帕金森病（Parkinson’s disease，PD）生物標(biāo)志物miR-195 的DNA 雜交電化學(xué)納米生物傳感器（圖4），使用納米材料增加電極的有效表面積，大大提高了檢測的靈敏度，可用于PD的早期診斷。Srivastava等［58］報道了一種基于表面增強拉曼光譜的納米生物傳感器，用于大腸埃希菌的檢測，具有高度特異性，實驗證實其具有較低的檢測限（1.5×102CFU/mL，可達單個細菌的濃度水平）。

4.2 BCA技術(shù)

圖4 基于DNA雜交的電化學(xué)納米生物傳感器［53］Figure 4 Electrochemical nanobiosensor based on DNA hybridization［53］

BCA 技術(shù)是本世紀(jì)初出現(xiàn)的一項以“信號放大”為基礎(chǔ)的新型分子診斷技術(shù)。該技術(shù)的檢測體系中包含AuNP和MNP兩種納米粒子，其中，表面帶有單克隆抗體（或單鏈DNA）的MNP 主要用于被檢測物質(zhì)的分離，表面帶有多克隆抗體（或單鏈DNA）及大量“條碼DNA”的AuNP 用于捕獲被檢測物質(zhì)。當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)存在時，兩種納米顆粒與被目標(biāo)物質(zhì)形成“AuNP-目標(biāo)物-MNP”三明治結(jié)構(gòu)（圖5）。利用磁場分離這一“三明治”結(jié)構(gòu)后，使用一定方法釋放生物條形碼DNA，并進行后續(xù)檢測。2003年首次報道用該技術(shù)成功進行了前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）的檢測，由于AuNP 表面結(jié)合有大量的生物條形碼DNA，可將檢測靈敏度提高2～3個數(shù)量級；Thaxton 等［59］使用BCA技術(shù)成功對前列腺癌根治性前列腺切除術(shù)后的男性血清中常規(guī)方法無法檢出的低濃度PSA 進行了檢測，從而實現(xiàn)了對前列腺癌復(fù)發(fā)狀況的預(yù)測；Yin 等［60］也使用BCA技術(shù)對藍舌病毒外核蛋白VP7進行了特異性檢測，其檢測限為0.1 fg/mL。其巧妙之處在于將無法擴增的蛋白檢測轉(zhuǎn)化為有多種擴增和檢測手段的核酸檢測，從而為蛋白質(zhì)檢測提供了新思路。

圖5 BCA在蛋白質(zhì)檢測［15］和DNA檢測［16］中所形成的三明治結(jié)構(gòu)Figure 5 Sandwich structures formed in protein［15］and DNA［16］detection using BCA

除在蛋白質(zhì)檢測中的應(yīng)用外，BCA 技術(shù)還在2007 年被報道用于枯草芽孢桿菌雙鏈DNA 的檢測［16］；Aminia等［61］用針對銅綠假單胞菌外毒素A基因的兩種核酸探針、AuNP 和MNP，構(gòu)建了外毒素A基因片段的檢測體系。用磁場分離出“AuNP-目標(biāo)核酸分子-MNP”的三明治結(jié)構(gòu)后，他們用二硫蘇糖醇溶液釋放結(jié)合在AuNP 上的DNA 條形碼并用熒光分光光度法進行檢測，其檢測限低至1.2 ng/mL，且具有檢測速度快、選擇性好、線性范圍寬等優(yōu)點。此外，BCA 技術(shù)也衍生出一些變體。Lin 等［62］開發(fā)了一種基于納米酶的生物條碼熒光檢測技術(shù)，他們利用鉑-金納米粒（Pt-AuNP）的過氧化物酶活性催化amplex red（AR）產(chǎn)生可檢測的熒光信號，實現(xiàn)了對艾滋病病毒和乙肝病毒DNA 的同時檢測。此類方法相比基于PCR 的核酸檢測技術(shù)更適用于POCT。

5 小結(jié)和展望

納米科學(xué)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的新興學(xué)科，與信息科學(xué)、生命科學(xué)并列為21 世紀(jì)最有前途的三大新技術(shù)科學(xué)領(lǐng)域，其應(yīng)用已涉及醫(yī)療衛(wèi)生、感染防控、食品工程、廢水處理等大量領(lǐng)域。目前，在臨床體外診斷檢測領(lǐng)域，特性各異的納米材料已成為研究者們優(yōu)化現(xiàn)有方法、開發(fā)新檢測技術(shù)的重要元件。基于納米材料的檢測方法對相關(guān)標(biāo)志物（PSA、HCG等）檢測中表現(xiàn)出的高特異性、低檢測限（表1），使其在某些疾病，特別是前列腺癌等惡性腫瘤的早期診斷和預(yù)后評估中具有較大的應(yīng)用價值［22，59］。在病原體檢測方面，將納米材料加入PCR反應(yīng)體系后，可提高PCR反應(yīng)的靈敏性和特異性［38］；在臨床上遇到難以分離鑒定的病原體時，可將測序技術(shù)作為最后手段使用，但目前常用的二代測序技術(shù)的速度、成本等因素還不能完全滿足臨床感染快速診斷的需求，而納米孔測序雖然仍在不斷改進完善中，卻因其低成本、使用簡單、高讀長、設(shè)備和環(huán)境要求低等特性，在病原體鑒定、白血病等基因突變引起的急性病快速診斷中顯示出獨特優(yōu)勢［45，47］。在熒光檢測中，以QD為主的納米材料具有抗光漂白性強、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄等特點，且可通過調(diào)整粒徑大小改變發(fā)射光波長避開易受到干擾的波段，從而使得整個檢測體系更具抗干擾性。得益于QD 的這一特性，開發(fā)者和臨床工作者們可以在實際應(yīng)用中嘗試使用全血標(biāo)本代替血清，簡化檢測流程，使之更加適合POCT，且縮短了檢驗周期［13，63］，更好地符合臨床需要。由此可預(yù)見，納米技術(shù)與臨床檢驗診斷的結(jié)合終將給體外診斷技術(shù)和醫(yī)學(xué)檢驗行業(yè)帶來一場變革。

表1 各種基于納米材料的體外診斷技術(shù)對比Table 1 Comparison of in-vitro diagnostics based nanomaterials

值得注意的是，基于納米材料的檢驗方法常常需要對納米材料進行表征，開發(fā)可重復(fù)程序，以保證檢測的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性［64］，這在臨床實踐中可行性較低。因此，大部分納米檢測技術(shù)進入臨床應(yīng)用仍需依賴體外診斷企業(yè)的投入和納米技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展；同時，盡管該類技術(shù)有眾多優(yōu)勢，但在進入臨床應(yīng)用之前，還需要一定人力物力的投入，培養(yǎng)相應(yīng)的技術(shù)人員，這也使得基于納米材料的檢驗技術(shù)距離臨床大規(guī)模應(yīng)用尚有距離。而在生產(chǎn)、使用、廢棄過程中進入環(huán)境的納米材料，可造成一定的生態(tài)效應(yīng)和人群暴露。根據(jù)國內(nèi)外納米毒理學(xué)的研究，納米材料可以通過引起人體氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)或抑制細胞自噬、在生理環(huán)境中吸附一系列蛋白質(zhì)形成“蛋白冠”等方式，對細胞和機體產(chǎn)生毒性作用［65-66］。因此，在應(yīng)用納米材料的同時，也應(yīng)加快制定完善的納米技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，避免走上“先污染后治理”的老路。

總之，基于納米材料的體外診斷技術(shù)由于靈敏度高、檢測快速等特點，具有臨床應(yīng)用的巨大潛力。與此同時，由于傳統(tǒng)檢測技術(shù)仍能應(yīng)對日常工作中的大部分需求，以及納米檢驗技術(shù)本身存在的商品化程度不足、產(chǎn)業(yè)鏈不成熟、自身技術(shù)不完善、需要相應(yīng)技術(shù)人員等原因，該類技術(shù)進入臨床應(yīng)用仍面臨一定阻礙?？梢灶A(yù)見的是，隨著醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)和納米科學(xué)的發(fā)展，以及體外診斷公司和區(qū)域檢驗中心的興起，未來這類技術(shù)將不斷進入臨床應(yīng)用，并揚長避短地滿足不同臨床需要，更好地服務(wù)臨床醫(yī)學(xué)乃至全人類。