棉花根際土壤古菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的建立及時(shí)空分布特征

管力慧，劉 萍，黨文芳，楊紅梅，牛新湘，楚 敏，李 萍，高 雁，曾 軍，霍向東，張 濤，林 青，歐提庫(kù)爾·馬合木提，李玉國(guó)，婁 愷，史應(yīng)武,3,5

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091；3. 新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；4. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所，烏魯木齊 830091；5. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北綠洲農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；6. 新疆庫(kù)爾勒市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，新疆庫(kù)爾勒 841000)

0 引 言

【研究意義】古菌(Archaea)作為生物領(lǐng)域的一類具有特殊性質(zhì)，其細(xì)胞核無核膜包裹，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)難區(qū)分，和細(xì)菌都屬于原核生物，但是在進(jìn)化樹上與其有親緣關(guān)系的卻是真核生物。古菌不僅耐高溫、高鹽、低氧、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，還廣泛存在湖泊、土壤等普通環(huán)境中而且含量非常高[1]。棉花連作導(dǎo)致棉花黃萎病等土傳病害發(fā)生，影響棉花產(chǎn)量及品質(zhì)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同生育時(shí)期與地區(qū)棉花根際土壤古菌數(shù)量，有利于探索根際土壤古菌與黃萎病之間的聯(lián)系以及防治棉花黃萎病。【前人研究進(jìn)展】顧美英等[2]用平板計(jì)數(shù)法研究棉花的根際土壤，分析根際土壤微生物生態(tài)特征的變化情況以及根際土壤微生物特征變化與黃萎病病原菌的關(guān)系。Tellenbach等[3]建立了植物內(nèi)生真菌實(shí)時(shí)熒光定量的方法。王晶等[4]運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)和16S rDNA多態(tài)性分析對(duì)玉米不同生長(zhǎng)時(shí)期土壤古菌多樣性變化進(jìn)行研究。高峰等[5]用PCR定性測(cè)定土壤病原菌，沒有定量研究。2011年，肖蕊等[6]運(yùn)用SYBR Green I PCR技術(shù)快速檢測(cè)棉花根際病原菌數(shù)量。PCR技術(shù)的發(fā)展，該方法也可用于古菌數(shù)量的檢測(cè)[7-8]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)常用的檢測(cè)方法有SYBR Green I法和TaqMan探針法，TaqMan探針法原理是把含熒光素的TaqMan探針加入到反應(yīng)體系中，通過變性、復(fù)性和延伸TaqMan探針被切斷，導(dǎo)致反應(yīng)體系中熒光信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生變化后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分析未知樣品[9-11]。【本研究切入點(diǎn)】目前有關(guān)熒光定量的檢測(cè)方法廣泛應(yīng)用于細(xì)菌和真菌的檢測(cè)，在古菌上的應(yīng)用較少，且國(guó)內(nèi)外對(duì)棉田古菌TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量的相關(guān)研究還未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】運(yùn)用TaqMan探針法檢測(cè)新疆不同地區(qū)及生育時(shí)期棉花根際土壤古菌數(shù)量，研究其根際土壤古菌的數(shù)量分布特征。對(duì)根際土壤古菌群落進(jìn)行測(cè)序，分析其群落組成并進(jìn)行風(fēng)度比較。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試土樣

在棉花苗期、棉花蕾期、棉花花鈴期以及吐絮期對(duì)新疆北疆地區(qū)的石河子、烏蘇和精河；南疆的庫(kù)爾勒、圖木舒克和阿拉爾以及東疆的哈密共7個(gè)地區(qū)的棉花病株根際土壤(10～15 cm)進(jìn)行采樣，用10目篩網(wǎng)將土壤過篩，混勻后裝入密封袋中于4℃冰箱中保存，待測(cè)[12]。

1.1.2 主要試劑

Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒、 SanPrep柱式質(zhì)粒 DNA小量抽提試劑盒均來自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 主要儀器

德國(guó)艾本德Centeifuge 5418R型離心機(jī)(北京東南儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司) ；DW-40L188 型醫(yī)用低溫保存箱(杭州艾普儀器設(shè)備有限公司) ； TPersonal型PCR儀(杭州博日科技有限公司) ；DYCP-31E型電泳儀(北京六一儀器廠) ；WD-9413B型凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠) ；OSE-260型超微量分光光度計(jì)(濟(jì)南利科醫(yī)療器械有限公司) ；Roche Light Cycle 480Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(羅氏醫(yī)學(xué)儀器公司) 。

1.2 方 法

1.2.1 土壤微生物基因組總DNA的提取

在每個(gè)棉區(qū)隨機(jī)選取4個(gè)生育期的土樣，按照Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒上的操作步驟提取土壤基因組總DNA，將提取到的DNA樣品進(jìn)行標(biāo)記并放入-20℃的冰箱保存[13]。

1.2.2 RT-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

以土壤基因組總DNA為模板，采用古菌16S rDNA基因特異引物524F(5’-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3’)和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)[14]對(duì)不同時(shí)期的根際土壤基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，探針兩端用FAM和BHQ1進(jìn)行標(biāo)記，把不加模板的作為陰性對(duì)照，每個(gè)操作重復(fù)3次。反應(yīng)體系為: 模板5 μL，引物各0.8 μL，F(xiàn)S Essential DNA Probes Master 10.0 μL，探針0.4 μL，ddH2O 3 μL，總體系為20 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性25 s，56℃退火120 s，72℃延伸90 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)[15]。用1.8%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增的基因序列進(jìn)行高通量測(cè)序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

用DNA膠回收試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物，然后進(jìn)行質(zhì)粒的構(gòu)建并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐青霉素平板上進(jìn)行藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌[16]。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以拷貝數(shù)1.145×108copies/g (FRW)的質(zhì)粒為基礎(chǔ)，獲得6個(gè)拷貝數(shù)分別為1.145×107、1.145×106、1.145×105、1.145×104、1.145×103、 1.145×102copies/g (FRW)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。將7個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。

用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌DNA，再用超微量分光光度計(jì)測(cè)定OD600值，計(jì)算得出質(zhì)粒濃度并按梯度進(jìn)行稀釋，檢測(cè)已稀釋的不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，在Roche Light Cycle 480軟件內(nèi)拷貝數(shù)據(jù)，用Origin 8.5軟件作圖并生成方程，建立Ct值與棉花根際土壤古菌濃度之間的線性關(guān)系。

1.2.5 樣品的熒光定量PCR檢測(cè)

對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，將得到的樣品Ct值帶入上述重組質(zhì)粒DNA構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算棉花根際土壤古菌的含量(copies/g FRW)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Origin8.5和Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)作圖。用Flash軟件對(duì)測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，用Uchime軟件去除嵌合體，獲得高質(zhì)量序列。在Usearch(version 7.0)平臺(tái)上將相似性不小于97%的序列為同一操作分類單元(operation taxonomic unit, OTU)，為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)中基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，采用RDP classifier算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列分析在分類學(xué)水平上根際土壤古菌群落組成[17,18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

研究表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與循環(huán)數(shù)Ct存在極強(qiáng)的相關(guān)性。曲線的截距為45.5，斜率為-3.546 9。出棉花根際土壤古菌x(DNA起始濃度對(duì)數(shù)值)與y(Ct值)之間的關(guān)系為y=-3.546 9x+45.5 。圖1，圖2

圖1 10倍梯度稀釋陽(yáng)性質(zhì)粒的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.1 Real-time PCR amplification curve of serial 10 fold dilutions of positive recombinant plasmids

圖2 10倍梯度稀釋陽(yáng)性質(zhì)粒的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 RT-qPCR standard curve of serial 10 fold dilutions of positive recombinant plasmids

2.2 不同生育時(shí)期新疆棉田根際土壤古菌數(shù)量變化及群落豐度

研究表明，哈密、石河子、圖木舒克和烏蘇變化趨勢(shì)在苗期至絮期呈相似狀態(tài)，從苗期后一直在減少，花鈴期達(dá)到最低隨后開始增加，在吐絮期數(shù)量最大，其中哈密根際古菌數(shù)量吐絮期達(dá)到最大值1.75×106copies/g (FRW)；精河和庫(kù)爾勒的變化都是從苗期緩慢增加，蕾期后又減少，花期又增加，在吐絮期兩地根際古菌數(shù)量達(dá)到生育期最大值1.0×106copies/g (FRW)；而在阿拉爾地區(qū)苗期為5.4×105copies/g (FRW)，從苗期開始一直在降低，吐絮期降到最低1.1×104copies/g (FRW)。 Soil_Crenarchaeotic_Group_SCG在4個(gè)生育時(shí)期豐度最高是在蕾期達(dá)79.94%，苗期最低為75.5%。Unclassified_p_Thaumarchaeota在生育時(shí)期豐度差異最大，吐絮期最高達(dá)7.12%，苗期為1.06%。Halobacteria的豐度極低在蕾期僅為0.01%，苗期最高只有0.4%。圖3，圖4

圖3 不同生育時(shí)期棉花根際土壤古菌數(shù)量變化Fig.3 Variation of number of Archaea in rhizosphere soil of cotton in different growth stages

圖4 不同生育時(shí)期棉花根際土壤古菌群落豐度Fig.4 Abundance of Archaea community in cotton rhizosphere soil in different growth stages

2.3 不同地區(qū)根際土壤古菌的數(shù)量變化及群落豐度

研究表明，在北疆地區(qū)，烏蘇土壤古菌數(shù)量高于石河子和精河；南疆地區(qū)庫(kù)爾勒土壤古菌數(shù)量在棉花苗期、蕾期和花鈴期均比阿拉爾與圖木舒克高，但在吐絮期比圖木舒克低、比阿拉爾高。除阿拉爾外不同采樣點(diǎn)的棉花病株根際土壤古菌在吐絮期數(shù)量較高，其中顯著較高的地區(qū)依次為哈密、烏蘇、圖木舒克；苗期精河棉花病株根際土壤古菌的數(shù)量同其他幾個(gè)地區(qū)相比最少僅有1.4×104copies/g(FRW)，此外精河、石河子和烏蘇3個(gè)地區(qū)除在吐絮期外的生育時(shí)期的土壤古菌數(shù)量都很少；庫(kù)爾勒地區(qū)的根際土壤古菌的數(shù)量在整個(gè)生育期變化不大呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)。棉花根際土壤古菌群落中SCG綱豐度最高在哈密地區(qū)為88.84%，最低是在阿拉爾為58.24%；相反熱原體綱(Thermoplasmata)豐度最高是在阿拉爾地區(qū)為26.19%，哈密最低是9.66%；Marine_Group_I豐度最高是在阿拉爾為7.13%，哈密和石河子僅有0.01%；Halobacteria綱在精河地區(qū)豐度最高為0.43%，阿拉爾為0.03%，在哈密和石河子卻不存在這一類群。圖5，圖6

圖5 不同地區(qū)棉花根際土壤古菌數(shù)量變化Fig.5 Variation of number of Archaea in rhizosphere soil of cotton in different locations

圖6 不同地區(qū)棉花根際土壤古菌群落豐度Fig.6 Abundance of Archaea community in cotton rhizosphere soil in different locations

3 討 論

近年來，我國(guó)關(guān)于土壤微生物的研究越來越多，古菌作為一類耐高溫、高鹽、低氧、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的生物，在生態(tài)環(huán)境中具有不容忽視的作用。陳金全等[19]通過構(gòu)建克隆文庫(kù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對(duì)珠江口海岸帶沉積物氨氧化細(xì)菌和古菌組成及定量進(jìn)行研究。王晶等[4]運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)和16S rDNA多態(tài)性分析對(duì)玉米不同生長(zhǎng)時(shí)期土壤古菌多樣性變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)提高土壤古菌的多樣性對(duì)生態(tài)環(huán)境大有好處并促進(jìn)植物生長(zhǎng)。研究對(duì)棉花不同生育時(shí)期以及不同地區(qū)的土壤古菌數(shù)量進(jìn)行研究，但土壤古菌的多樣性以及是否對(duì)棉花生長(zhǎng)有促進(jìn)作用有待進(jìn)一步研究。棉花根際微生物對(duì)棉花健康有很重要的影響，因此，探究土壤微生物對(duì)棉花黃萎病的影響對(duì)棉花黃萎病的防治有十分重要的意義。目前已經(jīng)有很多學(xué)者對(duì)棉花土壤中的微生物進(jìn)行了定量研究，但對(duì)于棉花根際土壤古菌的研究還較少，張濤等[12]運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)新疆棉花根際土壤細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行時(shí)空動(dòng)態(tài)分析，黨文芳等[13]采用熒光定量PCR方法研究新疆不同地區(qū)以及不同生育時(shí)期棉花根際土壤真菌數(shù)量變化并探討真菌與病原菌之間關(guān)系。研究首先建立了土壤古菌的實(shí)時(shí)熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)新疆棉花根際土壤古菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。劉珊珊等[20]對(duì)棉花不同發(fā)育時(shí)期根際微生物的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，但尚未發(fā)現(xiàn)針對(duì)不同地區(qū)土壤古菌的研究。采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同地區(qū)及不同生育時(shí)期的棉花土壤古菌數(shù)量進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化研究。研究了棉花黃萎病病株根際土壤古菌數(shù)量變化趨勢(shì)，對(duì)于古菌在不同土壤環(huán)境中的適應(yīng)能力還需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

建立快速檢測(cè)棉花根際古菌數(shù)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)新疆棉花根際土壤古菌數(shù)量在不同地區(qū)以及不同生育時(shí)期的變化較為明顯，哈密、石河子、圖木舒克和烏蘇根際古菌數(shù)量均呈現(xiàn)先減少后增加的變化趨勢(shì)，其中哈密的病株土壤古菌的數(shù)量與其余幾個(gè)地區(qū)相比是最高的，在棉花的4個(gè)生育時(shí)期內(nèi)，土壤古菌的數(shù)量在吐絮期最高達(dá)1.75×106copies/g (FRW)，SCG綱豐度最高是在蕾期為79.94%。精河和庫(kù)爾勒根際古菌數(shù)量變化趨勢(shì)為先升后降再升，精河地區(qū)土壤古菌數(shù)量在苗期最低為1.4×104copies/g(FRW)。阿拉爾根際古菌數(shù)量一直在減少，吐絮期最低1.1×104copies/g (FRW)。SCG綱在阿拉爾地區(qū)豐度最高為88.84%。