郭文韜,努日耶·木合太爾,羅順剛,鐘 問,胡紅英
(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830046)
【研究意義】多眼蝶屬KiriniaMoore隸屬于鱗翅目Lepidoptera、眼蝶科Satyridae,世界已知6種均分布于古北區(qū),中國(guó)目前已知1種:多眼蝶Kiriniaepaminondas,主要分布于北京、黑龍江、遼寧、山東、河南等地[1]。通過對(duì)近年來在新疆伊犁哈薩克自治州霍城縣中華福壽山景區(qū)采集的蝴蝶標(biāo)本進(jìn)行整理,發(fā)現(xiàn)了該屬1中國(guó)新紀(jì)錄種:艾弗斯曼多眼蝶Kiriniaeversmanni。目前關(guān)于鱗翅目中的分類鑒定主要依據(jù)翅和雄性外生殖器的特征[2],主要以物種間因外生殖器的不同形成的種間生殖隔離為出發(fā)點(diǎn),雄性外生殖器的結(jié)構(gòu)復(fù)雜且種間差異明顯為據(jù)[3]。研究將雄性外生殖器的形態(tài)特征與DNA條形碼技術(shù)相結(jié)合,對(duì)艾弗斯曼多眼蝶進(jìn)行識(shí)別和鑒定,為其鑒定提供可靠依據(jù),同時(shí)豐富國(guó)內(nèi)多眼蝶屬物種記錄情況,為該屬物種的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。 【前人研究進(jìn)展】目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于多眼蝶屬物種的相關(guān)研究工作甚少,且關(guān)于該屬的詳細(xì)鑒定工作暫無研究。Hebert等[4]在提出DNA條形碼技術(shù)后將這一技術(shù)應(yīng)用到昆蟲鑒定,分析了200個(gè)親緣關(guān)系較近的鱗翅目昆蟲的COI片段,結(jié)果表明,200個(gè)鱗翅目昆蟲100%被準(zhǔn)確區(qū)分;Hajibabaei等[5]研究了鱗翅目中的弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)和大蛾科(Saturniidae)521個(gè)物種4 260個(gè)樣本,97.9% 的物種能夠準(zhǔn)確無誤的被鑒定,證明DNA條形碼對(duì)于物種鑒定的有效性;Vladimir等[6]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)乩砀采w范圍擴(kuò)大后并不妨礙物種分子水平的鑒定,結(jié)果表明,即使是在一個(gè)大的地理區(qū)域的分類單元采樣,DNA條形碼仍然是一個(gè)有效的識(shí)別工具。武宇鵬[7]為檢驗(yàn)DNA條形碼在鱗翅目中鑒定的可行性選取71頭夜蛾科Noctuidae標(biāo)本利用系統(tǒng)發(fā)育樹、遺傳距離、閾值等方法進(jìn)行了鑒定和比較分析,發(fā)現(xiàn)基于cox1基因的鑒定成功率達(dá)到了100% ,而基于28S則很低,為64.8%。用不同方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,鑒定結(jié)果均相同。然而DNA條形碼也有一些爭(zhēng)議,有些分類學(xué)家認(rèn)為DNA條形碼作為物種分類鑒定依據(jù)時(shí)其分子數(shù)據(jù)權(quán)重過大,片段單一,以及受限于數(shù)據(jù)庫中參照序列的多少等[8]。DNA條形碼仍不失為一種極為有效的昆蟲物種鑒定工具,如ITS2[9]、rRNA[10]以及cytb[11]等適當(dāng)增加和補(bǔ)充一些其他基因序列信息也很必要。Bonfantt等[12]研究了新熱帶螯蛺蝶亞科Charaxinae 13屬31種的雄性外生殖器超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其在屬、種之間均有明顯差異。洪健等[13]對(duì)虎鳳蝶屬Luehdorfia雄外生殖器的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較,認(rèn)為抱握器,鉤形突、陽莖、陽莖軛片等部位超微結(jié)構(gòu)的差異可作為虎鳳蝶屬不同種的形態(tài)鑒定依據(jù);蔣玲玲、曹文秋等[14-15]通過對(duì)雄性外生殖器的結(jié)構(gòu)比較對(duì)云粉蝶屬Pontiadaplidice以及新疆7種具有代表性的蛺蝶科(Nymphalidae)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定并制作檢索表。隨著對(duì)整合分類學(xué)的認(rèn)識(shí)不斷加深,對(duì)于物種的鑒定技術(shù)的綜合運(yùn)用也越來越廣泛,集形態(tài)、分子及生態(tài)數(shù)據(jù)為一體的綜合分類法將會(huì)使昆蟲未來物種鑒定更為科學(xué)和準(zhǔn)確[16-18]。如陳光輝[19 ]等通過DNA條形碼技術(shù)與外生殖器特征鑒定相結(jié)合的方法成功鑒定榆綠毛螢葉甲Pyrrhaltaaenescens。 【本研究切入點(diǎn)】目前國(guó)內(nèi)對(duì)多眼蝶屬的相關(guān)研究極少。在新疆伊犁州霍城縣清水河鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)該屬中國(guó)新紀(jì)錄種,利用DNA條形碼技術(shù)結(jié)合其雄性外生殖器特征和翅面結(jié)構(gòu)對(duì)該物種進(jìn)行描述鑒定,為該物種提供更多的分類特征。 【擬解決的關(guān)鍵問題】采集艾弗斯曼多眼蝶標(biāo)本, 運(yùn)用整合分類學(xué)方法,為該中國(guó)新紀(jì)錄種提供可靠鑒定依據(jù)。
1.1.1 昆蟲
艾弗斯曼多眼蝶標(biāo)本采于2016~2017年,采集地點(diǎn)為新疆霍城縣清水河鎮(zhèn)大西溝鄉(xiāng)中華福壽山景區(qū)廟內(nèi)。標(biāo)本保存于新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院昆蟲標(biāo)本館。表1
表1 標(biāo)本采集信息Table 1 Collecting information of specimens
1.1.2 儀器設(shè)備與試劑
捕蟲網(wǎng)、三角紙袋、體視顯微鏡、解剖鏡、酒精燈、試管、鐵架臺(tái)、試管夾、10%KOH溶液、75%酒精、木餾油、丁香油、加拿大樹膠、PCR儀;電泳儀;凝膠成像儀等。
1.2.1 標(biāo)本采集與前期處理
通過捕蟲網(wǎng)采集到蝴蝶后,用雙手捏蝴蝶翅基部使其失去飛行能力,將蝴蝶裝至三角袋臨時(shí)保存至蝴蝶死亡后利用昆蟲針三角片和展翅板進(jìn)行展翅,放在通風(fēng)處使其干燥,附上標(biāo)簽后收入標(biāo)本盒保存。
1.2.2 雄性外生殖器標(biāo)本的制作、觀察及保存
將艾弗斯曼多眼蝶標(biāo)本編號(hào)1,2,3,剪下腹部末端1/3處(一般蝶類雄性外生殖器位于第9~10腹節(jié))剪下放置于試管中,加入約試管1/5容積的10%KOH溶液,將試管放置于酒精燈上均勻加熱直至溶液沸騰后保持7~8 min以溶解其肌肉組織,待溶液冷卻后用鑷子取出腹部置于75%酒精溶液中,在解剖鏡下用解剖針取出雄性外生殖器,用75%的酒精反復(fù)清洗去除附著于雄性外生殖器的透明絮狀物[12,20]。使用體視顯微鏡觀察洗凈的雄性外生殖器并進(jìn)行不同角度的拍照,之后在75%酒精中拆除雄性外生殖器,觀察并拍攝各個(gè)結(jié)構(gòu)。表1
永久保存,需將解剖處理后的雄性外生殖器置于木餾油中脫水20~25 min,之后取出置于丁香油中,待置于載玻片上吸干多余的丁香油用蓋玻片固定,用加拿大樹膠封片,最后將載玻片移入35℃的恒溫箱中烘干3~4 d后附上標(biāo)簽放入切片盒中保存。
1.2.3 DNA 的提取
將艾弗斯曼多眼蝶剩余腹部組織分別剪下于干凈離心管中研磨編號(hào)1,2,3,利用按照凱杰(QIAGEN)公司生產(chǎn)的血液/組織基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取艾弗斯曼多眼蝶DNA。
1.2.4 目的片段擴(kuò)增、檢測(cè)及測(cè)序
選用線粒體基因細(xì)胞色素氧化酶I(COI)的部分片段作為分子標(biāo)記,選用擴(kuò)增該片段的通用引物L(fēng)CO1490/HCO2198作為引物,上游引物堿基序列:5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’,下游引物堿基序列:5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL;上、下游引物各0.5 μL(引物濃度10 μmol/ L),2×PCRMix預(yù)混液10 μL,DNA模板5 μL,用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至20 μL。擴(kuò)增程序:95℃ 5 min,94℃50s,45~50℃退火,72℃50s,35℃循環(huán),72℃10 min,4℃保存,PCR產(chǎn)物均用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,電壓110V 20 min,待電泳結(jié)束后,將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下觀察,并拍照。利用純化試劑盒將目的片段電泳條帶單一且明亮的PCR產(chǎn)物再次純化。委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序。
1.2.5 目的序列拼接與確認(rèn)
利用DNAStar7.1.0的SeqMan Pro軟件查看序列峰圖質(zhì)量并進(jìn)行人工校對(duì),將校對(duì)后的正、反向序列進(jìn)行序列拼接。將拼接好的艾弗斯曼多眼蝶COI基因序列分別與GenBank數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比對(duì)與分析,進(jìn)一步確認(rèn)測(cè)定的目標(biāo)序列來自多眼蝶屬昆蟲,排除因試驗(yàn)污染而導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果不準(zhǔn)確。
研究表明,翅正面呈黃褐色,前后翅外緣呈黑色。前翅亞頂區(qū)有3個(gè)黑斑,中區(qū)具1個(gè)黑斑;后翅亞外緣區(qū)有1列黑圓斑。前翅反面中室有4條黑色豎紋,后翅反面中區(qū)到基區(qū)為黑褐色。前緣中區(qū)斑紋外帶白色,亞外緣區(qū)有6個(gè)黑色眼斑,黃眶白瞳。圖1
注:A:背面觀;B:腹面觀
研究表明,與鱗翅目大多數(shù)種類一樣,艾弗斯曼多眼蝶的雄性外生殖器由第9、10腹節(jié)特化而成,基本結(jié)構(gòu)主要由背兜 (tegumen)、基腹弧(vinculum)、陽莖(aedeagus)、鉤形突(uncus)、陽莖軛片(juxta)、囊形突(saccus) 、抱器瓣(valvae)等幾部分構(gòu)成。基腹弧條狀呈U型結(jié)構(gòu);背兜較寬為馬鞍狀,腹面光滑;囊形突為頭粗尾細(xì)的管狀突起,長(zhǎng)寬比約為2∶1;抱器瓣為扁平囊狀,基部開口,抱器端圓滑,外緣外側(cè)著生密集而整齊的剛毛(圖3B,C);鉤形突為末端尖鉤狀結(jié)構(gòu),呈三角形,兩側(cè)外緣平滑;陽莖為棒狀,表面粗糙近透明段部位斜截式開口(圖3D);陽莖軛片為盾狀結(jié)構(gòu),正面呈U型。圖2,圖3
注:tg:背兜;vin:基腹??;ae:陽莖;un:鉤形突;jx:陽莖軛片;sa:囊形突; vla:抱器瓣
注:A:基腹弧將背兜與囊形突相連;B-C:抱器瓣側(cè)面觀;D:陽莖
研究表明,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)試驗(yàn)選取的艾弗斯曼多眼蝶COI基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。其中1~3條帶為1號(hào)樣本,4~6條帶為2號(hào)樣本,7~9條帶為3號(hào)樣本。1,2號(hào)樣本條帶亮度強(qiáng)且單一,3號(hào)條帶亮度一般,均無其他干擾帶。圖4
圖4 艾弗斯曼多眼蝶COI基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of COI gene PCR products of Kirinia eversmanni
研究表明,3頭艾弗斯曼多眼蝶的基因序列相似性達(dá)到100%,其片段大小為696 bp,堿基平均含量分別為:A30%、C15%、G15%及T41%;序列中G+C含量為30%,A+T含量為71%,表現(xiàn)出明顯的A/T偏向性。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)所獲得的基因序列與數(shù)據(jù)庫所記錄物種Kiriniaeversmanni(登入號(hào):FJ663540.1)的COI基因長(zhǎng)度相同且相似度高達(dá)99.70%,僅有部分單個(gè)堿基存在差異,說明試驗(yàn)所獲得的基因片段與數(shù)據(jù)庫中所記錄種為同一物種。圖5,圖6
圖5 3頭艾弗斯曼多眼蝶的COI基因序列對(duì)比Fig.5 COI gene sequence comparison between three Kirinia eversmanni
圖6 試驗(yàn)樣本COI基因與NCBI中艾弗斯曼多眼蝶序列比對(duì)Fig.6 Comparison results between the COI gene of the experimental sample and the sequence of Kirinia eversmanni in NCBI
艾弗斯曼多眼蝶翅面正面呈黃褐色,前后翅外緣呈黑色,前翅亞頂區(qū)有3個(gè)黑斑,中區(qū)具1個(gè)黑斑,后翅反面中區(qū)到基區(qū)為黑褐色;雄性外生殖器囊形突為頭粗尾細(xì)的管狀突起,長(zhǎng)寬比約為2∶1,抱器瓣抱器端圓滑,外緣外側(cè)著生密集而整齊的剛毛,鉤形突為末端尖鉤狀結(jié)構(gòu),呈三角形,陽莖為棒狀,盲囊端無彎曲;COI基因序列長(zhǎng)度為696 bp,表現(xiàn)出明顯的A/T偏向性。
研究中,DNA條形碼與雄性外生殖器特征相結(jié)合,準(zhǔn)確鑒定了中國(guó)新紀(jì)錄種艾弗斯曼多眼蝶并對(duì)翅面特征進(jìn)行完整描述。胡曉雯、劉德星等[20-21]利用DNA條形碼技術(shù)與外生殖器特征鑒定相結(jié)合分別對(duì)8種蛾類和國(guó)內(nèi)新紀(jì)錄種澳洲麻蠅(Sarcophagaaustralis)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定。與前人不同,研究中對(duì)物種成蟲翅面特征進(jìn)行了描述,一方面豐富了艾弗斯曼多眼蝶的紀(jì)錄情況,另一方面也對(duì)今后學(xué)者對(duì)艾弗斯曼多眼蝶的研究奠定基礎(chǔ)提供便利。
國(guó)內(nèi)外有關(guān)多眼蝶屬的研究極少,而關(guān)于艾弗斯曼多眼蝶,僅有Vladimir等[6]在研究隨著地理區(qū)域覆蓋范圍擴(kuò)大DNA條形碼是否仍然是一個(gè)有效的識(shí)別工具時(shí),選擇了艾弗斯曼多眼蝶作為研究對(duì)象之一,并將艾弗斯曼多眼蝶的DNA條形碼上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫。研究中得到的艾弗斯曼多眼蝶的COI基因序列與Vladimir的結(jié)果比對(duì)相吻合,豐富了國(guó)內(nèi)艾弗斯曼多眼蝶的DNA條形碼記錄信息。
在對(duì)艾弗斯曼多眼蝶雄性外生殖器進(jìn)行解剖過程中,易對(duì)外生殖器官結(jié)構(gòu)造成損傷,但可以直觀展現(xiàn)其雄性外生殖器結(jié)構(gòu),便于描述及研究借鑒引用。利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)艾弗斯曼多眼蝶進(jìn)行鑒定,試驗(yàn)操作流程簡(jiǎn)單方便,對(duì)于標(biāo)本完整度的要求小于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類,效率高,結(jié)果準(zhǔn)確性高。結(jié)合翅面特征的描述,準(zhǔn)確的對(duì)艾弗斯曼多眼蝶進(jìn)行描述鑒定,彌補(bǔ)了國(guó)內(nèi)關(guān)于該物種記錄的空白,同時(shí)在形態(tài)及分子鑒定層面給出鑒定依據(jù)。
DNA條形碼技術(shù)在鱗翅目昆蟲的分類鑒定過程中運(yùn)用最為廣泛。國(guó)內(nèi)外關(guān)于鱗翅目昆蟲DNA條形碼的研究,極大的推動(dòng)了DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展,使其逐步成為高效的物種鑒定工具。在研究中,基于艾弗斯曼多眼蝶線粒體COI基因與NCBI中已記錄的基因序列對(duì)比結(jié)果,結(jié)合近年來在物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)研究,相較于DNA條形碼技術(shù)剛提出時(shí)引起的爭(zhēng)議,在今天該技術(shù)已取得了較好的效果。但目前已登錄至GenBank系統(tǒng)中用于鑒定的COI序列有限,也為該技術(shù)帶來了一定的局限性。已有研究嘗試將ITS、Cytb等多基因片段用于DNA條形碼鑒定中,并取得較好效果。黃蓬英等[22]利用ITS1和ITS2序列成功對(duì)刺桐姬小蜂(Quadrastichuserythrinae)進(jìn)行快速分子鑒定;王利華等[23]利用COI與Cytb基因片段對(duì)6種鲌屬魚類進(jìn)行有效區(qū)分,COI序列和Cytb序列相結(jié)合進(jìn)行物種鑒定的可行性;陳光輝[24]利用ITS1、ITS2、Cytb、COI、COII5種基因片段成功鑒定玉米象Sitophiluszeamais。同時(shí)DNA條形碼技術(shù)在物種的不同發(fā)育階段的基因條形碼識(shí)別、物種的系統(tǒng)發(fā)育分析等方面也有很大的研究前景。陳珊等[25]選取巨癤蝙蛾(Endoclitadavidi)的成蟲、卵、幼蟲、蛹不同時(shí)期的COI基因片段進(jìn)行測(cè)序比對(duì),并選取NCBI 中記錄的6 種蝙蝠蛾科蛾類以鄰接法(neighbor-joining,NJ)和最大簡(jiǎn)約法(maximumparsimony,MP)2種方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,聚類分析與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果均一致。
形態(tài)學(xué)鑒定過程中對(duì)分類學(xué)家的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)依賴性很強(qiáng),對(duì)標(biāo)本外部形態(tài)特征的完整性要求很高,而DNA條形碼技術(shù)操作簡(jiǎn)單高效,這便使得形態(tài)學(xué)發(fā)展面臨巨大挑戰(zhàn)。雖然DNA條形碼技術(shù)相較于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類存在較多優(yōu)點(diǎn)并且有一定的應(yīng)用前景[26],但其并不能取代傳統(tǒng)分類方法,在分類鑒定中,仍需綜合形態(tài)學(xué)特征來確保鑒定的準(zhǔn)確性,二者相輔相成,保持相互補(bǔ)充的關(guān)系。通過DNA條形碼技術(shù)可以直接鑒定至種級(jí)水平,但單純依據(jù)分子鑒定仍存有局限性,有些物種進(jìn)化時(shí)間較短,表現(xiàn)出較小的種間遺傳距離以及物種基因雜交等情況均會(huì)出現(xiàn),實(shí)際鑒定中,不能僅僅依據(jù)分子數(shù)據(jù),脫離形態(tài)學(xué)鑒定的復(fù)核確認(rèn)[27,28]。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定作為昆蟲鑒定的經(jīng)典方法仍不失為在物種鑒定過程中的重要手段之一,在集形態(tài)分子為一體的整合分類法也會(huì)使得物種鑒定更為科學(xué)和準(zhǔn)確。
獲得的艾弗斯曼多眼蝶的COI基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已記錄物種Kiriniaeversmanni對(duì)比,二者為同一物種。在DNA條形碼技術(shù)的基礎(chǔ)上,結(jié)合艾弗斯曼多眼蝶翅面特征及雄外生殖器的形態(tài)描述,對(duì)艾弗斯曼多眼蝶進(jìn)行了準(zhǔn)確的鑒定,確定其為中國(guó)新紀(jì)錄種。