分子生物學技術(shù)在檢測機構(gòu)食品微生物檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀、技術(shù)制約因素與發(fā)展趨勢

丁衛(wèi)平，楊夕宇，朱可瀅，蔡雙鳳*

(1.濱州市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濱州 256600；2.華僑大學 生物醫(yī)學學院/醫(yī)學院，福建 廈門 361021)

食源性疾病的暴發(fā)與食品受食源性微生物污染密切相關(guān)。據(jù)文獻報道，在食源性疾病疫情中，由微生物引起的暴發(fā)事件起數(shù)和發(fā)病人數(shù)最多[1]。 不僅如此，從食品安全長遠發(fā)展來看，農(nóng)獸藥殘留以及非法添加物等食品安全問題是國民經(jīng)濟發(fā)展到特定階段必然出現(xiàn)的問題, 也會隨著國民經(jīng)濟的發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式的轉(zhuǎn)變而弱化，但是致病微生物卻將長期存在，并將是國民經(jīng)濟進一步發(fā)展后食品安全的主要問題[2]。要保障食品安全，離不開食品中微生物的精準檢測。出于對食品中微生物可能引起的食品安全問題的擔憂，人們一直在研究食品微生物檢測的相關(guān)技術(shù)，分子生物學相關(guān)技術(shù)就是研究的重點之一[3-4]。下面首先對分子生物學技術(shù)在檢測機構(gòu)食品微生物檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀進行總結(jié)。

1 分子生物學技術(shù)在檢測機構(gòu)食品微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀

根據(jù)國家食品安全監(jiān)督抽檢實施細則要求，我國目前各檢測機構(gòu)一般采用國家標準來檢測判定食品中的微生物[5]。從當前的食品微生物檢測國家標準來看，對于致瀉大腸埃希氏菌的檢驗，GB 4789.6-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》要求[6]，生化反應(yīng)符合大腸埃希氏菌特征的菌落需要進行PCR確認試驗；GB 4789.12-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗》要求[7]，對于肉毒梭菌的檢驗，生化反應(yīng)符合肉毒梭菌的菌落需要進行毒素基因檢測，以確定肉毒梭菌具體類型；對于大腸埃希氏菌O157:H7/NM毒力基因的測定，GB 4789.36-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》中規(guī)定此項檢驗屬于選做項目[8]；對于諾如病毒的檢測，GB 4789.42-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 諾如病毒檢驗》則要求采用實時熒光RT-PCR方法檢測[9]。

以上是采用分子生物學技術(shù)進行微生物檢驗的強制性國家標準，如果把采用分子生物學技術(shù)進行檢驗的標準拓展到推薦性國家標準、行業(yè)標準、地方標準，那么采用分子生物學技術(shù)的標準數(shù)量將大大增加，這些標準用到的分子生物學技術(shù)有常規(guī)PCR、熒光定量PCR、數(shù)字PCR、基因芯片等。

出入境檢驗檢測機構(gòu)由于要與國際接軌，因此其對新技術(shù)的運用要超前一些，采用分子生物學技術(shù)進行檢驗的行業(yè)標準數(shù)量也比較多。對于國內(nèi)檢測機構(gòu)來說，從GB 29921-2013《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》以及歷年的國家食品安全監(jiān)督抽檢實施細則中可以看出[10]，當前的食品檢測中，致病菌檢測的重點是沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌及大腸埃希氏菌 O157:H7。大腸埃希氏菌O157:H7/NM毒力基因的測定由于屬于選做項目，檢測機構(gòu)做的比較少。其他重點檢測的致病菌基本都按照國家標準使用傳統(tǒng)的檢測方法包括增菌培養(yǎng)篩選及后續(xù)計數(shù)檢測、生化反應(yīng)鑒定或血清學鑒定等環(huán)節(jié)，沒有使用分子生物學技術(shù)。因此，雖然分子生物學技術(shù)在食品微生物檢測中的研究日益走向深入，但是分子生物學技術(shù)在檢測機構(gòu)食品微生物檢測中的應(yīng)用仍然比較少。

2 分子生物學技術(shù)在檢測機構(gòu)食品微生物檢測領(lǐng)域應(yīng)用的技術(shù)制約因素

隨著檢驗要求的提升和檢驗規(guī)模的擴大，食品微生物傳統(tǒng)檢測方法的缺點日益凸顯，如由于不可培養(yǎng)微生物的存在，僅依靠培養(yǎng)手段，在生物多樣性上不能反映微生物的真實狀況以及檢測周期長、檢測流程復(fù)雜、特異性不足等缺點[11]。盡管存在這些缺點，但是新的技術(shù)并未完全取代原有的技術(shù)，這是因為新的技術(shù)也存在各種缺點。在一種技術(shù)的優(yōu)越性未得到完全確認時，出于對食品安全的負責，監(jiān)管部門不得不繼續(xù)要求檢測機構(gòu)采用原有的較為成熟的技術(shù)。制約分子生物學技術(shù)在食品微生物檢驗中應(yīng)用的因素有很多，下面僅對相關(guān)技術(shù)制約因素進行簡單總結(jié)。

2.1 微生物死活的有效區(qū)分

與傳統(tǒng)的微生物檢驗方法相比，采用分子生物學技術(shù)進行微生物檢驗可實現(xiàn)對不可培養(yǎng)微生物的鑒定，在這方面科學家進行了大量的研究并取得了一定的成果[12-13]。這是采用分子生物學方法進行微生物檢驗的優(yōu)點之一，但采用此方法進行微生物檢驗同樣存在不足之處，比如在食品微生物檢驗中應(yīng)用最多的分子生物學技術(shù)是PCR技術(shù)，采用PCR技術(shù)檢測食品微生物的主要缺陷是不能區(qū)分微生物的死活，從樣品中提取的微生物即使死掉其DNA同樣能作為模板進行特異性擴增, 因此在檢測過程中會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。開發(fā)快速、準確的活菌檢測技術(shù)是食品微生物檢測領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。當前國內(nèi)外一些科學家在開發(fā)利用PMA/EMA-PCR技術(shù)，根據(jù)他們的文章報道[14-15]，這項技術(shù)能消除死去的微生物對PCR擴增的影響, 使擴增信號只來源于活的微生物，近年來這項技術(shù)已經(jīng)開始進行探索性應(yīng)用，但由于PMA(疊氮溴化丙錠)、EMA(疊氮溴化乙錠)毒性較大，污染消除也比較困難，大規(guī)模推廣應(yīng)用難度較大。

2.2 微生物難以有效富集的缺點

如果想利用分子生物學技術(shù)對食品中的微生物進行快速檢測，菌體的富集分離技術(shù)必不可少。當前的菌體富集分離技術(shù)有離心分離技術(shù)、改良增菌培養(yǎng)基富集技術(shù)、膜分離技術(shù)及免疫磁性分離技術(shù)等，但這些方法大都存在一定的缺點。離心分離技術(shù)存在著粘附食品基質(zhì)、大量細菌損失等缺點[16]。高質(zhì)量的改良增菌培養(yǎng)基的研發(fā)比較困難。采用膜分離技術(shù)時分離后的菌體常濃縮于食品或濾膜上，還需要進一步洗脫和分離，并且洗脫效果嚴重影響著細菌的回收率[17]。使用免疫磁性分離技術(shù)時，由于食品基質(zhì)復(fù)雜，微生物菌群復(fù)雜多樣，對于抗體的干擾較大，選擇的抗原靶標不特異，將導致富集到很多雜菌，無法正確檢測到目標菌[18]。同時免疫磁性分離技術(shù)存在著成本高、需要預(yù)處理、不適合大體積樣品分離等缺點。

2.3 微生物定量的缺點

微生物所造成的毒害作用不但與其類型有關(guān)，也與其數(shù)量密切相關(guān)，GB 29921-2013《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》對于食品中致病菌的限量都做了相關(guān)規(guī)定。因此，在進行食品微生物檢測時，需要比較準確地檢測食品中微生物的數(shù)量，而這恰恰是PCR等傳統(tǒng)分子生物學技術(shù)的缺點之一。不過現(xiàn)在隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，科學家創(chuàng)造性地發(fā)明了數(shù)字PCR技術(shù)，這種技術(shù)是對起始樣品的絕對定量，利用這種技術(shù)可以使得基于 PCR 技術(shù)的食源性微生物的檢測真正成為定量檢測[19]。但在當前，數(shù)字PCR檢測的成本仍然比較高，相關(guān)技術(shù)更多地用于科學研究，在檢測機構(gòu)推廣難度較大。

3 分子生物學技術(shù)在檢測機構(gòu)食品微生物檢測領(lǐng)域的發(fā)展趨勢

3.1 傳統(tǒng)鑒定技術(shù)與分子生物學技術(shù)相結(jié)合

實際上，現(xiàn)在利用分子生物學技術(shù)進行檢驗的國家標準基本就是將傳統(tǒng)鑒定技術(shù)與分子生物學技術(shù)相結(jié)合，比如致瀉大腸埃希氏菌、肉毒梭菌的檢驗。這些微生物的檢驗一般都是先進行增菌、生化反應(yīng)鑒定然后再進行分子生物學鑒定，傳統(tǒng)的涂布平板法可以比較準確地對微生物數(shù)目進行定量，而分子生物學技術(shù)則可以對微生物進行快速定性，但在定量方面仍然存在不足，這種檢驗方法的好處是可以將兩種技術(shù)的優(yōu)勢結(jié)合起來，這也是未來分子生物學技術(shù)用于食品微生物檢驗的發(fā)展趨勢之一。

3.2 進一步挖掘現(xiàn)有技術(shù)的潛力

如果能將現(xiàn)有技術(shù)的潛力進一步發(fā)掘，可能會產(chǎn)生巨大的應(yīng)用價值。比如數(shù)字PCR技術(shù)，這項技術(shù)具有能對樣品DNA絕對定量的獨特優(yōu)勢，但當前的一個缺點就是價格太高，這大大限制了其應(yīng)用。如果隨著科技的進步，這項技術(shù)的成本能夠降下來，那么此項技術(shù)的應(yīng)用范圍會大大增加。再比如，如果能夠?qū)MA等染料與數(shù)字PCR技術(shù)相結(jié)合，則能夠?qū)崿F(xiàn)對活菌的絕對定量。除此之外，微流控芯片、全自動PCR技術(shù)、液相芯片等技術(shù)也已經(jīng)展現(xiàn)出了各自的獨特優(yōu)勢[20-22]，需要進一步發(fā)掘這些技術(shù)的潛力加以推廣應(yīng)用。

3.3 新技術(shù)的開發(fā)利用

要利用分子生物學技術(shù)對食品中的微生物進行檢測，一些配套的技術(shù)也必不可少，如增菌培養(yǎng)富集技術(shù)、DNA提取技術(shù)、菌體直接富集分離技術(shù)等，這些技術(shù)與最后的檢測結(jié)果密切相關(guān)。當前這些技術(shù)都有很大的發(fā)展空間，需要科學家們進行進一步的研究。如果我們能夠開發(fā)出高效率的沒有前增菌過程的菌體富集分離技術(shù)，再配套分子生物學技術(shù)，就可以真正實現(xiàn)食品微生物的快速檢測，這在發(fā)生食品安全事件時顯得特別重要，可以使我們更快地確定病原體。

4 展望

任何一種技術(shù)都有其缺點，但科學就是在不斷發(fā)現(xiàn)問題與解決問題中不斷取得進步。分子生物學技術(shù)作為當前生物學領(lǐng)域發(fā)展最快、應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域，已經(jīng)在食源性病毒如諾如病毒的檢測中起著不可替代的作用，理應(yīng)也能夠在食品微生物檢測領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。隨著分子生物學技術(shù)及其他技術(shù)的發(fā)展，食品微生物檢測技術(shù)必將迎來廣闊的發(fā)展空間。