黃芪甲苷對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心力衰竭大鼠模型心室重構(gòu)及心肌能量代謝的影響

張夢(mèng) 全毅紅 郭明星 甘盼盼 劉暢 黃芳

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院，湖北 武漢 430050)

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，歐洲老年心力衰竭患病率達(dá)6%～10%，5年存活率較低，且近年發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，不利于患者預(yù)后〔1〕。心力衰竭發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，一項(xiàng)動(dòng)物模型研究顯示，心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，心肌細(xì)胞線粒體代謝障礙可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，而心肌細(xì)胞凋亡是心室重構(gòu)重要病理基礎(chǔ)，可促進(jìn)心力衰竭發(fā)展〔2，3〕。因此，保護(hù)心力衰竭患者線粒體結(jié)構(gòu)及功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡成為臨床防治心力衰竭新靶點(diǎn)。目前，臨床治療心力衰竭患者常通過(guò)強(qiáng)心、利尿等對(duì)癥支持治療，雖可在一定程度上緩解患者癥狀，但整體效果不佳，輔以抗心肌細(xì)胞凋亡，預(yù)防心室重構(gòu)等方式可提高治療效果〔4～6〕。黃芪甲苷具有抗炎、改善心血管疾病等作用，還可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能，對(duì)心肌細(xì)胞具有一定保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚未明確〔7〕。本研究通過(guò)阿霉素建立心力衰竭大鼠模型，并使用曲美他嗪、黃芪甲苷治療，主要觀察黃芪甲苷對(duì)大鼠心室重構(gòu)及心肌能量代謝的影響，旨在指導(dǎo)未來(lái)心力衰竭的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠40只，均購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，大鼠均為清潔級(jí)，6～9周齡，平均(7.11±1.01)w；體重0.16～0.24 kg，平均(0.20±0.03)kg。飼養(yǎng)均在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下，每12 h晝夜交替1次，保證大鼠得到充足的飲水及食物。

1.2方法

1.2.1主要藥品與試劑 注射用鹽酸阿霉素由山西普德藥業(yè)有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字H14023879，規(guī)格：10 mg/瓶；黃芪甲苷由南京春秋生物工程有限公司提供，純度為98%；鹽酸曲美他嗪由南京正科醫(yī)藥股份有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字H20083803，規(guī)格20 mg/片；0.9%氯化鈉注射液由成都科倫藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20181161，規(guī)格100 ml/瓶；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)凋亡試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附試劑、免疫層分析法試劑盒均購(gòu)自萬(wàn)類(lèi)生物公司；北京樂(lè)普科技有限責(zé)任公司提供的LEPU Quant-Gold免疫定量分析儀。

1.2.2主要儀器與設(shè)備 加拿大VisualSonics公司提供的Vevo2100超高分辨率小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)；日本尼康公司提供的TE2000-s倒置熒光顯微鏡；廣州威佳公司提供的JW-3021HR型高速臺(tái)式離心機(jī)；德國(guó)萊卡公司提供的切片架；北京正開(kāi)儀器有限公司提供的電子秤及低溫冰箱；常州中威電子儀器廠提供的包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、組織漂烘儀。

1.2.3大鼠分組及處理

1.2.3.1分組 選取雄性SD大鼠40只，進(jìn)行常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)選擇其中10只大鼠作為空白對(duì)照組，另將30只大鼠通過(guò)阿霉素誘導(dǎo)建立心力衰竭模型，建模成功后隨機(jī)分為3組，每組各10只，分別設(shè)為模型組、曲美他嗪組、黃芪甲苷組。

1.2.3.2建立心力衰竭大鼠模型 除空白對(duì)照組外，其余動(dòng)物以3 mg/kg劑量阿霉素溶液腹腔注射；空白對(duì)照組給予等體積0.9氯化鈉溶液注射，1次/w，共8 w，累積劑量為24 mg/kg，建立心力衰竭大鼠模型。造模結(jié)束后2 w頸總動(dòng)脈插管測(cè)動(dòng)物心功能，取心臟組織常規(guī)蘇木素-伊紅染色，進(jìn)行病理組織檢查；病理檢查心肌呈心力衰竭樣病變?yōu)榻３晒?。建模成功后，曲美他嗪組給予鹽酸曲美他嗪10 mg/kg灌胃、黃芪甲苷組給予黃芪甲苷60 mg/kg灌胃，1次/d；連續(xù)給藥8 w，剩余兩組均給予同體積純凈水。

1.3相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1心室重構(gòu)指標(biāo)檢測(cè)法 干預(yù)結(jié)束后，稱(chēng)量大鼠體重并記錄，固定大鼠，采用超高分辨率小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)測(cè)定各組大鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)等心室重構(gòu)指標(biāo)。

1.3.2心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)法 切片常規(guī)脫蠟、水化后，根據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)中實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行染色操作，于熒光顯微鏡下觀察大鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況。每張切片選擇5個(gè)視野(×400)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞×100%，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)AI并取平均值。

1.3.3心肌能量代謝指標(biāo)檢測(cè)法 干預(yù)結(jié)束后，取材前一天停止大鼠食物供給，可正常飲水，標(biāo)本取材過(guò)程中，先用10%水合氯醛溶液，以0.3 ml/100 g劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，徹底麻醉后開(kāi)胸暴露心臟，使用一次性真空采血管針經(jīng)心尖部采集血液5 ml；收集血液置于恒溫箱中靜置30 min，2 000 r/min離心15 min，取出管內(nèi)上清液，置于-80℃冰箱中待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清N末端B型腦鈉肽前體(NT-proBNP)水平；采用免疫層分析法檢測(cè)血清心肌肌鈣蛋白(CTn)I水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.14組大鼠心室重構(gòu)指標(biāo)比較 與空白對(duì)照組比較，其他3組LVEDD、LVESD顯著升高，LVEF顯著下降(P<0.05)；黃芪甲苷組、曲美他嗪組LVEDD、LVESD低于模型組，LVEF高于模型組(P<0.05)，且黃芪甲苷組LVEDD、LVESD低于曲美他嗪組，LVEF高于曲美他嗪組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組心室重構(gòu)指標(biāo)比較

2.24組大鼠心肌細(xì)胞AI比較 空白對(duì)照組心肌細(xì)胞AI為(1.76±0.26)%；模型組心肌細(xì)胞AI為(20.16±2.36)%；曲美他嗪組心肌細(xì)胞AI為(8.69±1.10)%；黃芪甲苷組心肌細(xì)胞AI為(4.72±1.03)%。與空白對(duì)照組比較，其他3組大鼠心肌細(xì)胞AI顯著明顯升高(P<0.05)；黃芪甲苷組、曲美他嗪組心肌細(xì)胞AI顯著低于模型組(P<0.05)，且黃芪甲苷組心肌細(xì)胞AI顯著低于曲美他嗪組(P<0.05)。

2.34組心肌能量代謝比較 與空白對(duì)照組比較，其他3組NT-proBNP、CTnI顯著升高(P<0.05)；黃芪甲苷組、曲美他嗪組NT-proBNP、CTnI水平顯著低于模型組(P<0.05)，且黃芪甲苷組NT-proBNP、CTnI水平顯著低于曲美他嗪組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組心肌能量代謝比較

3 討 論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為心力衰竭與心腎陽(yáng)氣虧虛關(guān)系密切，而氣虛與機(jī)體細(xì)胞能量荷值有關(guān)，心肌能量代謝障礙是心氣虛的原因之一，故治療心力衰竭應(yīng)以補(bǔ)益心腎陽(yáng)氣為主，對(duì)改善心肌能量代謝具有重要作用〔8〕。黃芪甲苷是一種從黃芪中提取的高純度藥物，近年逐漸被臨床應(yīng)用心血管疾病治療中，可維持心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，具有抗細(xì)胞凋亡、改善心肌能量代謝等作用〔9,10〕。動(dòng)物模型研究顯示，黃芪甲苷不僅具有保護(hù)肝臟、抗炎、鎮(zhèn)痛等功效，還可加強(qiáng)機(jī)體心臟收縮力，保護(hù)心肌，起到抗心力衰竭等作用〔11〕。

心力衰竭因血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷較重，加之炎癥刺激可引起心肌結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生變化，隨著心室重構(gòu)不斷發(fā)展，心肌損傷及心功能進(jìn)一步惡化，進(jìn)而出現(xiàn)心肌凋亡，心肌細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)提示心力衰竭從代償發(fā)展為失代償〔12〕。本研究提示黃芪甲苷抑制心力衰竭心肌細(xì)胞凋亡作用更好，分析其原因可能與黃芪甲苷抗細(xì)胞凋亡機(jī)制有關(guān)。心室重構(gòu)是心力衰竭的主要病理基礎(chǔ)，故防治心室重構(gòu)成為臨床治療心力衰竭新靶點(diǎn)。LVEF是左心室收縮功能量化的重要指標(biāo)，是左心室單位容積內(nèi)射血量，不僅可反映左心室射血效率，還是心室重構(gòu)重要指標(biāo)；LVEDD、LVESD也是臨床常用的心室重構(gòu)評(píng)估指標(biāo)〔13〕。本研究結(jié)果提示黃芪甲苷用于心力衰竭的治療，可在一定程度上預(yù)防心室重構(gòu)。分析其原因可能為，黃芪甲苷中黃芪具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能、抗細(xì)胞凋亡作用，而細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心室重構(gòu)主要原因，故黃芪甲苷具有防治心室重構(gòu)作用〔14〕。

心肌能量代謝異常在心力衰竭發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。NT-proBNP是腦尿納肽的氮末端產(chǎn)物，具有利尿、擴(kuò)血管等作用，參與心室重構(gòu)整個(gè)過(guò)程，目前被臨床廣泛應(yīng)用于心力衰竭診斷中〔15〕。研究顯示，NT-proBNP水平升高與心功能損傷具有一定關(guān)系，其水平越高提示心肌受損程度越重，心肌能量代謝越差〔16〕。CTnI是一種理想的心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物，也是目前臨床診斷心肌損傷的重要指標(biāo)之一，在心肌收縮及舒張中起到重要作用，對(duì)評(píng)估心肌能量代謝具有一定作用〔17〕。本研究結(jié)果提示黃芪甲苷可改善心力衰竭大鼠心肌能量代謝。陳彥等〔18〕研究顯示，黃芪甲苷可通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞能量代謝治療心力衰竭患者，效果較好。該結(jié)果證實(shí)的藥物的改善心肌能量代謝效果與本研究一致，進(jìn)一步說(shuō)明黃芪甲苷在心力衰竭中的應(yīng)用價(jià)值之高。但因黃芪甲苷具體作用機(jī)制尚未明確，且臨床實(shí)際中相關(guān)研究較少，故本研究結(jié)果真實(shí)性、可靠性及其是否對(duì)臨床具有指導(dǎo)意義均需在未來(lái)展開(kāi)較多的動(dòng)物試驗(yàn)或臨床研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，經(jīng)阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠在經(jīng)黃芪甲苷治療后，心肌細(xì)胞凋亡抑制效果好，在防治心室重構(gòu)方面意義重大，大鼠心肌能量代謝改善明顯，應(yīng)用價(jià)值高。