聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解酶的研究進(jìn)展

趙彧瑾，陳仔君，趙晶晶，蘇婷婷*，王戰(zhàn)勇

(1.遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院，遼寧 撫順 113001；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

現(xiàn)代社會的日益商品化以及塑料與各行業(yè)的緊密關(guān)聯(lián)，使得全球?qū)λ芰系囊蕾嚦潭戎鹉晏岣?。?jù)研究統(tǒng)計，每年全球大約生產(chǎn)1億 t塑料制品，并呈逐年上升趨勢[1]。尤其在2020年于抗擊新冠肺炎疫情中，主要由塑料材料制成的手套、面罩、防護服等對病毒傳播的控制更是發(fā)揮了重要作用[2]。聚對苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate, PET)由于具有優(yōu)越的力學(xué)性能和良好的實用性，目前已成為廣泛使用的塑料材料之一[3]，在2020年全球PET產(chǎn)能就突破了1億t[4]。目前PET已應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)各個領(lǐng)域，如飲料或礦泉水瓶、薄膜以及滌綸服裝等[5]，由此也產(chǎn)生了大量的PET廢棄物。雖然很多國家已經(jīng)開始回收利用廢棄的PET，但數(shù)量很少，大部分廢棄PET未能得到有效回收，這些物質(zhì)經(jīng)過大氣紫外輻射、自由基氧化以及海水水解等作用發(fā)生脆化，產(chǎn)生肉眼不可見的微塑料，這些微塑料可被水生生物吸收，人類作為食物鏈的頂端，攝入這些水生生物后，可能會富集大量的微塑料于體內(nèi)，對人體健康造成難以預(yù)計的危害[6]。眾所周知，微生物在污染物的清除和生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。自20世紀(jì)90年代以來，微生物酶在降解高分子材料方面的應(yīng)用已開始引起人們的關(guān)注。酶的催化降解為解決塑料造成的環(huán)境問題提供了一個獨特的方案。自從2005年Müller等[7]從嗜高溫放線菌的褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)中發(fā)現(xiàn)了第一個PET降解酶，到現(xiàn)在已有多個研究團隊對多種微生物來源的PET降解酶進(jìn)行了一系列的研究。在相關(guān)研究領(lǐng)域尤其是針對PET降解酶的研究取得了一定進(jìn)展。本文就PET降解酶及其降解機制進(jìn)行了綜述，并進(jìn)一步對其在PET廢棄物處理的應(yīng)用及發(fā)展前景方面進(jìn)行了探討。

1 脂肪酶

脂肪酶又稱甘油酯水解酶，因其催化水解長鏈(>C10)的甘油三酯而廣為人知，屬于羧基酯水解酶類，其特點是界面活化現(xiàn)象。脂肪酶可通過增強PET織物的潤濕性、染色性和吸收性，在一定程度上對其進(jìn)行降解[7]。2005年Müller等[7]首次報道，源于褐色嗜熱裂孢菌芳香族聚酯酶能夠降解聚己二酸-對苯二甲酸丁二酯，在后來的研究中發(fā)現(xiàn)其也可以降解PET。德國研究者從褐色嗜熱裂孢菌的培養(yǎng)上清液中純化出一種可水解聚丁烯對苯二甲酸-共己二酸酯的降解酶(BTA-1)[8]，在55 ℃條件下該降解酶能在3周內(nèi)將商業(yè)PET飲料瓶和PET顆粒水解40%～50%。此后Lykidis等[9]對褐色嗜熱裂孢菌＿ YX的全基因組進(jìn)行了測序，確定了兩個三?；视椭久富虻拇嬖冢渲蠺fu0883與BTA-1完全匹配。Eberl等[10]通過陽離子染色和X射線光電子能譜等技術(shù)確定了從綿毛嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)中分離得到的脂肪酶不僅能水解PET組成的單體寡聚物——雙(苯甲氧基乙基)對苯二甲酸乙二醇酯(bis-(benzoyloxyethyl)terephthalate, 3PET)，還能水解多聚物，如PET織物和薄膜。但是脂肪酶在活性位點上具有“蓋子”結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的存在抑制了大分子進(jìn)入活性位點的可能性，使得聚合物與催化中心結(jié)合困難，導(dǎo)致脂肪酶對PET的水解活性偏低。該研究還表明非離子洗滌劑Triton X-100能夠激活脂肪酶的“蓋子”結(jié)構(gòu)，使其對3PET的降解能力明顯增強。

2 酯 酶

酯酶通常裂解水溶性短鏈甘油酯(

2010年Billig等[11]將嗜熱放線菌褐色嗜熱裂孢菌KW3b在含有PET纖維的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生了分子量為50 kDa的酯酶(TfCa)。TfCa能夠水解回收的PET薄膜，且TfCa對短鏈和中等鏈長(C2～C8)的對硝基苯基酯均具有水解活性，但對長鏈?；]有裂解作用(C16)。相比之下，此前報道的褐色嗜熱裂孢菌DSM 43793角質(zhì)酶(TfH)對C2～C6?；満虲8、C10、C12、C18酰基鏈酯均具有酶促活性，因此，該角質(zhì)酶同時具有酯酶和脂肪酶的特性[8]。在之后的研究中Ribitsch等[16]發(fā)現(xiàn)來自裂孢菌屬(Thermobifida)Thh_Est的酯酶(Thh_Est)對PET表現(xiàn)出有效的表面水解，且其作用與來自裂孢菌屬的角質(zhì)酶相似。

3 PETase與MHETase

2016年Yoshida等[17]從PET瓶回收廠收集了包括沉淀物、土壤、廢水和活性污泥等250個樣本，從中篩選出一種可利用低結(jié)晶度(1.9%)PET膜作為主要碳源的菌株Ideonellasakaiensis201-F6。將該細(xì)菌產(chǎn)生的PETase在30 ℃下與PET薄膜(1.9%)孵育6周后，將PET薄膜降解為低分子量的低聚物或單體，如對苯二甲酸雙(2-羥乙基)酯(bis(2-hydroxyethyl)terephthalate, BHET)和對苯二甲酸單(2-羥乙基)酯(mono(2-hydroxyethyl)terephthalate, MHET)。Yoshida等還比較了PETase和部分角質(zhì)酶的催化效率，發(fā)現(xiàn)PETase的活性優(yōu)于其他角質(zhì)酶。研究中還發(fā)現(xiàn)了一種MHET水解酶(MHETase)，能與PETase配合，將PET的主要中間產(chǎn)物MHET特異性水解成對苯二甲酸(terephthalic acid, TPA)和乙二醇(ethylene glycol, EG)，對PET的完全降解起著重要作用，具體水解過程如圖1所示[17]。雖然PETase已經(jīng)引起了相當(dāng)大的關(guān)注，但相比于其他的PET降解酶[18-19]，PETase的降解能力和穩(wěn)定性較差，37 ℃下其大部分降解活性在12 h內(nèi)基本消失[19-20]。Cui等[19]發(fā)現(xiàn)PETase的降解能力僅發(fā)生在微摩爾水平，并將PETase突變?yōu)楦葻岬念愋虳uraPETase，雖然結(jié)果表明該突變酶在60 ℃高溫下孵育3 d仍能保持活性，且在溫和溫度下對半結(jié)晶PET薄膜的降解率達(dá)到23%，但綜合來看其熱穩(wěn)定性和降解率仍然偏低。

圖1 源于Ideonella sakaiensis 的PETase降解PET的過程[17]

4 角質(zhì)酶

角質(zhì)酶是一種α/β-水解酶，屬于胞外絲氨酸酯酶，存在于某些細(xì)菌和真菌中。最初被發(fā)現(xiàn)于某些植物病原菌和昆蟲病原菌中，其中以源于腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)的角質(zhì)酶被研究的最為廣泛[21-22]。Carvalho等[23]對角質(zhì)酶在水解和合成反應(yīng)中的生物催化潛力進(jìn)行了總結(jié)，并通過對聚酯降解的研究，發(fā)現(xiàn)角質(zhì)酶在聚酯的降解中起著決定性作用[24-25]。2009年，Ronkvist等[26]發(fā)現(xiàn)一種嗜熱真菌特異腐質(zhì)霉(Humilicainsolens)的角質(zhì)酶(HiC)能夠在70 ℃下完全降解非晶態(tài)PET，而且HiC還具有很好的熱穩(wěn)定性。同時Ronkvist等也證明了門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)的角質(zhì)酶(PmC)和腐皮鐮刀菌的角質(zhì)酶(FsC)均能夠?qū)ET降解成TPA和EG。2012年，Sulaiman等[27]利用宏基因組方法從植物堆肥中克隆了一種能夠降解PET的角質(zhì)酶(LCC)，LCC被認(rèn)為可能是來自堆肥中的放線菌。Danso等[28]開發(fā)了一種搜索算法，從各種數(shù)據(jù)庫中識別出504個可能的PET降解酶候選基因。其中包含了從IMG數(shù)據(jù)庫中獲得的108個海洋宏基因組和25個陸地宏基因組中超過16 GB的序列信息，檢測到了349個可能的PET降解酶，并表征了兩種具有較高應(yīng)用潛力的新型耐高溫酶。基于氨基酸的相似性對這504種候選酶的聚類表明，這些PET降解酶主要來自放線菌門、變形菌門(β、δ和γ)和擬桿菌門。值得注意的是，在海洋環(huán)境中，隸屬于擬桿菌門的細(xì)菌似乎是PET降解酶基因的主要宿主。在陸地環(huán)境中，PET降解酶主要來自放線菌。此外，基于數(shù)據(jù)庫和宏基因組的分析還發(fā)現(xiàn)，PET降解酶是一類相對罕見的酶，雖然數(shù)據(jù)庫和宏基因組涵蓋了陸地和海洋環(huán)境，但是這些環(huán)境的某些特殊地區(qū)仍有待充分分析，特別是極端環(huán)境，如火山、兩極地區(qū)、深海和湖泊、酸性和堿性環(huán)境以及高鹽度地區(qū)。此外，還有研究證明了無脊椎動物體內(nèi)的微生物群也有可能是塑料降解酶的重要來源[29-30]。

總之，降解PET的角質(zhì)酶一般都具有良好的降解活性和熱穩(wěn)定性。其中來自嗜熱放線菌和綠色糖單孢菌、植物堆肥(可能是放線菌的混合基因)和嗜熱真菌特異腐質(zhì)霉的角質(zhì)酶被認(rèn)為是嗜熱PET降解酶，到目前為止，從特異腐質(zhì)霉中提取的商業(yè)化角質(zhì)酶對非晶態(tài)PET薄膜的水解效果最為顯著，但其具體的水解途徑和其他因素尚未有報道。此外，與脂肪酶相比，角質(zhì)酶具有開放的、淺的活性位點，沒有“蓋子”結(jié)構(gòu)，可以容納大量的聚酯鏈，并使其與活性絲氨酸在催化三聯(lián)體(Ser-His-Asp)處接觸。Joo等[31]將催化三聯(lián)體中的Ser、His和Asp突變?yōu)锳la，發(fā)現(xiàn)角質(zhì)酶對PET薄膜和BHET的降解失去了催化活性，說明這3個殘基是酶催化反應(yīng)的關(guān)鍵組成。

4.1 角質(zhì)酶來源

角質(zhì)酶最早發(fā)現(xiàn)于植物和昆蟲病原真菌。在研究過程中逐漸發(fā)現(xiàn)角質(zhì)酶不僅能夠降解植物角質(zhì)還具備降解脂肪族聚酯(尤其是PET)的能力。2005年，Silva等[32]利用腐皮鐮刀菌角質(zhì)酶對幾種合成纖維的表面進(jìn)行改性，發(fā)現(xiàn)該角質(zhì)酶可將PET水解為TPA和EG，而且反應(yīng)最佳溫度低于50 ℃。Yang等[33]從太瑞斯梭孢殼霉中分離得到一種低分子角質(zhì)酶(TtcutA)，研究發(fā)現(xiàn)TtcutA能夠有效降解各種酯類聚合物，包括PET、聚己內(nèi)脂和聚丁二酸丁二酯。重要的是太瑞斯梭孢殼霉能夠在50 ℃或以上的條件生長良好。關(guān)于PET的酶促表面修飾的研究大約開始于40年前，并在隨后的許多研究中表明真菌角質(zhì)酶適合用于PET織物/纖維的改性[18,25]。這些真菌角質(zhì)酶屬于表面修飾酶，并沒有直接降解PET的特性，而是能夠?qū)ET薄膜或纖維表面酯鍵部分進(jìn)行酶解導(dǎo)致表面性質(zhì)發(fā)生改變，使其親水性能提高。唯一例外的是一種商品化真菌角質(zhì)酶HiC，其最佳催化溫度為75～80 ℃，可在70 ℃下高效水解非晶態(tài)PET[26]。相比之下，其他真菌角質(zhì)酶的最佳反應(yīng)溫度一般為50 ℃左右。因此，其對非晶態(tài)PET的降解率非常低。

在已報道的PET降解酶中大多數(shù)角質(zhì)酶均來自于放線菌。Thumarat等[34]報道了源自白色高溫雙歧菌(Thermobifidaalba)AHK119的兩種角質(zhì)酶基因(est1和est119)的遺傳圖譜，兩種角質(zhì)酶具有95 %的同源性和98%的相似性。目前報道的所有裂孢菌屬微生物均顯示存在角質(zhì)酶基因且基因序列相似度很高，因此，具有降解PET能力的角質(zhì)酶可能均來自裂孢菌屬微生物[8]。Kawai等[35]從綠色糖單孢菌AHK190中克隆出一種角質(zhì)酶(Cut190)基因，并實現(xiàn)了其在大腸埃希菌(Escherichiacoli)中的表達(dá)，且Ca2+能夠使該酶在75 ℃仍然具有較高的熱穩(wěn)定性。除此之外，之前提到的源于褐色嗜熱裂孢菌[7]的角質(zhì)酶和堆肥宏基因組的LCC[27]也是為數(shù)不多的嗜熱角質(zhì)酶，與其他角質(zhì)酶相比，其具有較高的水解活性和熱穩(wěn)定性，這可能是因為它們均來自于高溫環(huán)境。

角質(zhì)酶尤其是放線菌角質(zhì)酶能夠降解PET薄膜，且可以有效地將低結(jié)晶度的薄膜完全降解成對人體無害的CO2和H2O等。PET表面親水性越高，降解PET所需溫度就越低，因此對PET表面進(jìn)行改性可使PET更容易被降解。而PET降解酶的作用也可以有助于PET的表面親水，因此可以利用這一點對PET表面進(jìn)行改性，篩選鑒定或設(shè)計更有效的PET降解酶也已成為當(dāng)前的PET酶促降解研究的工作重點。

4.2 角質(zhì)酶PET降解機制

基于Joo等[31]對PET降解酶結(jié)構(gòu)觀察和生化研究，提出了以下PET降解機制(圖2)。以PET降解酶的代表性角質(zhì)酶TfCut2[36]為例，PET的初始降解是由TfCut2的殘基Y60和M131的主鏈氮原子與底物PET的羰基氧原子形成氧陰離子空穴，I178和Y60為底物PET提供疏水作用力，使易裂解的酯鍵靠近催化三聯(lián)體中的活性絲氨酸[1]被催化斷裂，進(jìn)而形成兩條末端不同的PET鏈(TPA末端鏈和HE末端鏈)。隨后TPA末端鏈和HE末端鏈被降解成多種PET二聚體或單體，如2-HE(MHET)2、(MHET)2、BHET、MHET、TPA等，最終被消化為MHET、TPA和EG形式的單體。該過程說明PET降解過程中TPA的積累主要來源于TPA末端鏈的末端消化步驟。

圖2 角質(zhì)酶PET降解機制[31]

4.3 角質(zhì)酶的分子改造

目前，許多提高PET降解性能的研究實驗正在接近實際可應(yīng)用的水平，現(xiàn)有的某些PET降解酶能夠有效地降解非晶態(tài)PET。最近，法國科學(xué)家Tournier等[37]通過分子改造后的手段將先前報道的LCC進(jìn)行優(yōu)化以提高其酶活性和熱穩(wěn)定性。經(jīng)10 h以上的作用，PET至少有90%可被改造后的LCC解聚成單體(TPA)，這一改造酶的性能優(yōu)于之前報道的所有PET水解酶，包括Ideonellasakaiensis201-F6中的PETase以及最近引起關(guān)注的改造酶[31,38-40]。此外，該酶催化所產(chǎn)生的PET單體經(jīng)過純化后再次合成PET，最終制成塑料瓶，從而實現(xiàn)了循環(huán)經(jīng)濟。

到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的PET降解酶分別為脂肪酶、酯酶和角質(zhì)酶等，其中角質(zhì)酶是研究最廣泛也是最有效的一類PET降解酶，角質(zhì)酶不僅可以使PET表面改性，還能夠在適宜溫度下顯著降解PET。同時角質(zhì)酶有優(yōu)于其他酶類的晶體結(jié)構(gòu)，因此降解PET的角質(zhì)酶具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

5 展 望

目前，對PET降解酶的研究已有一定的進(jìn)展，根據(jù)已報道的降解酶的晶體結(jié)構(gòu)及其降解機理，有望篩選或設(shè)計出更有效的PET降解酶。盡管高結(jié)晶度和PET水瓶材料的新型聚酯降解酶的開發(fā)仍然具有挑戰(zhàn)性，但非晶態(tài)PET薄膜(主要是包裝材料)的降解已經(jīng)能夠很好地實現(xiàn)。因此，從環(huán)境中篩選新的PET降解酶仍是十分必要的，事實上目前這一領(lǐng)域的研究還不夠充分。未來PET生物降解研究的工作重點應(yīng)該集中在兩個主要方面：①改善降解酶的熱穩(wěn)定性：為了解決這一問題，既需要篩選新的高效降解酶，也需要對已經(jīng)存在的或新鑒定的降解酶進(jìn)行分子改造。此外，還必須研究降解產(chǎn)物是否會產(chǎn)生抑制。②PET材料的改性：在不改變材料基本性能的前提下，通過化學(xué)或物理方法控制分子量、降低結(jié)晶度或者增加表面積，使得PET更易被降解酶作用。這些工作需要生物化學(xué)和高分子化學(xué)等多個領(lǐng)域的研究人員共同完成，如果能解決上述這些挑戰(zhàn)性的工作，使得無論是非晶態(tài)還是高結(jié)晶度PET都可以進(jìn)行酶促降解并實現(xiàn)產(chǎn)物回收利用，將有助于從根本上解決白色污染帶來的環(huán)境污染問題，實現(xiàn)循環(huán)經(jīng)濟發(fā)展。