蠟樣芽胞桿菌族毒素研究進(jìn)展

鄭慶芳，王東澍，呂宇飛，王恒樑，劉先凱*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所 病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071)

廣義的蠟樣芽胞桿菌族主要包括幾個(gè)具有密切關(guān)系的芽胞桿菌，分別為炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)、蕈狀芽胞桿菌(Bacillusmycoides)、假蕈狀芽胞桿菌(Bacilluspseudomycoides)、韋氏芽胞桿菌(Bacillusweihenstephanensis)和新種(Bacilluscytotoxicus)[1]。其中關(guān)于炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌的研究較為充分。蠟樣芽胞桿菌族細(xì)菌具有非常相似的生化特征和極高的基因組同源性[2]，導(dǎo)致物種的區(qū)分在分類學(xué)上很具挑戰(zhàn)性；蠟樣芽胞桿菌族不同物種之間普遍存在質(zhì)粒水平或垂直轉(zhuǎn)移，這可能會(huì)改變它們的表型[3]，在轉(zhuǎn)座子、整合子、共軛元件的作用下，在該族成員間傳播遺傳多樣性。決定蠟樣芽胞桿菌族物種表型和致病性的基因大多在質(zhì)粒上，由于蠟樣芽胞桿菌族物種攜帶了大小和數(shù)量不同的質(zhì)粒[4-5]，使其在致病性和宿主特異性方面表現(xiàn)出明顯的差異。但是否含有相關(guān)致病質(zhì)粒不能作為區(qū)分蠟樣芽胞桿菌族菌種的依據(jù)，需依靠全基因組單核苷酸多態(tài)性分析(SNP)和多位點(diǎn)序列分型(MLST)等基因分析。例如分離株ISS的生理特性和生化測試顯示屬于蠟樣芽胞桿菌，缺乏能編碼炭疽毒力因子的pXO1、pXO2的質(zhì)粒，但多位點(diǎn)序列分型和全基因組單核苷酸多態(tài)性分析表明其屬于炭疽芽胞桿菌[6]。蠟樣芽胞桿菌族細(xì)菌侵入宿主后，一旦不能快速準(zhǔn)確診斷治療，其分泌的毒素上升后將會(huì)對宿主造成很大的危害。本文對炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生的毒素在毒素特性、作用原理及致病性等幾個(gè)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述(表1)，簡單介紹蠟樣芽胞桿菌族成員之間的密切關(guān)系，并對疾病預(yù)防、治療和生物應(yīng)用的前景進(jìn)行了展望。

表1 蠟樣芽胞桿菌族的主要毒力因子——毒素

1 炭疽芽胞桿菌毒素

炭疽芽胞桿菌是革蘭陽性菌，引起的炭疽是一種嚴(yán)重的人畜共患傳染病[3],一般通過直接接觸、呼吸道吸入、消化道進(jìn)食和針頭注射等途徑感染宿主。炭疽芽胞曾被用于生物恐怖襲擊，是一種潛在的生物戰(zhàn)劑[4]。

1.1 炭疽毒素的來源及結(jié)構(gòu)特性

炭疽毒素由炭疽芽胞桿菌產(chǎn)生，是導(dǎo)致人畜炭疽感染甚至致死的主要原因[9]，是一種AB型復(fù)合毒素，保護(hù)性抗原(Protective antigen，PA)為B亞單位，水腫因子(Edema factor，EF)和致死因子(Lethal factor，LF)為兩種A亞單位。PA與EF形成水腫毒素(Edema toxin，ET)，可引起宿主細(xì)胞水腫；PA與LF形成致死毒素(Lethal toxin，LT)，導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡[10]。

PA是由pXO1質(zhì)粒上的pag基因座編碼，735個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈蛋白[11]，分子量為83 kD；EF是由pXO1質(zhì)粒上的cya基因編碼，767個(gè)氨基酸組成的鈣調(diào)蛋白依賴的腺苷酸環(huán)化酶，是第一個(gè)在炭疽毒素中發(fā)現(xiàn)的具有酶活性的組分[12]；LF由pXO1質(zhì)粒上的lef基因座編碼，共有776個(gè)氨基酸，是一種Zn2+依賴的金屬蛋白酶，包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域[13]，其中結(jié)構(gòu)域4具有配位Zn2+的HEFGF基序，能實(shí)現(xiàn)催化活性。

1.2 炭疽毒素作用原理及致病性

炭疽芽胞桿菌的芽胞在休眠狀態(tài)下進(jìn)入人體，被局部的吞噬細(xì)胞吞噬并在惡劣條件下生存，在此過程中芽胞萌發(fā)形成繁殖體，并隨著細(xì)菌大量繁殖釋放炭疽毒素[14]，部分細(xì)菌從吞噬細(xì)胞逃逸(圖1)。

圖1 炭疽桿菌與宿主細(xì)胞的相互作用[15]

炭疽毒素的作用過程：首先PA與靶細(xì)胞表面的受體CMG2 或 TEM8結(jié)合[16]，然后被弗林蛋白酶(furin)等細(xì)胞膜內(nèi)切酶裂解，PA裂解后的多肽片段PA63迅速寡聚化形成寡聚體[11]；一旦形成寡聚體，PA63便與EF或LF結(jié)合，引發(fā)依賴網(wǎng)格蛋白(clathrin)的內(nèi)吞過程(圖2)。在低pH環(huán)境下，PA63寡聚體可在脂質(zhì)雙層細(xì)胞膜上形成具有陽離子選擇性的孔狀結(jié)構(gòu)通道[11]。當(dāng)PA與TEM8結(jié)合時(shí)，PA在初級內(nèi)體形成孔；當(dāng)PA與CMG2結(jié)合，則需要轉(zhuǎn)運(yùn)至次級內(nèi)體。EF和LF可通過該孔狀通道從內(nèi)體直接轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)或者通過次級內(nèi)體的腔內(nèi)囊泡(ILV)到達(dá)細(xì)胞質(zhì)[17]發(fā)揮其生物學(xué)活性。EF使細(xì)胞內(nèi)cAMP升高，引起宿主組織水腫，影響宿主的心血管、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)等[18]。LF裂解MEKs會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞缺氧或壞死，也可能通過轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)吞體分選復(fù)合物(ESCRT)中的Alix、Tsg101蛋白和分選神經(jīng)毒素(Sorting Nexin 3，SNX3)至腔內(nèi)囊泡，在Rab11和Rab35的作用下長期保持活性并且能釋放至細(xì)胞外。

圖2 炭疽毒素的內(nèi)吞過程[20]

人畜感染炭疽后，會(huì)有1～6 d的無癥狀潛伏期，隨后可能出現(xiàn)1～5 d的類似流感的癥狀，然后會(huì)發(fā)作菌血癥，持續(xù)1～2 d，最后因呼吸衰竭、膿毒癥和休克而死亡[19]。

2 蠟樣芽胞桿菌毒素

蠟樣芽胞桿菌能夠產(chǎn)生腸毒素，部分菌株可產(chǎn)生嘔吐毒素(Ccereulide)。人攝入被污染的食品后會(huì)食物中毒，主要臨床表現(xiàn)為嘔吐和腹瀉。有的蠟樣芽胞桿菌致病菌株也會(huì)感染人的眼部，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)突發(fā)性肝臟衰竭，導(dǎo)致死亡[21]。

2.1 腹瀉型毒素

2.1.1 腹瀉型毒素的來源及特性 蠟樣芽胞桿菌引起的腹瀉是由于人攝入污染食物后，在小腸中產(chǎn)生腸毒素而引發(fā)的感染。蠟樣芽胞桿菌腸毒素主要包括溶血素BL(Hbl)、腸毒素Nhe、細(xì)胞毒素K(Cyt K)、腸毒素T(Bce T)和腸毒素(Hly II)[4-5]，其中只有腸毒素Nhe、溶血素BL 和細(xì)胞毒素K 被證明與胃腸道食物中毒有關(guān)[22]。腸毒素基因廣泛存在于蠟樣芽胞桿菌族中，具有高度分子多樣性[23]。溶血素BL具有溶血性，由L2蛋白、L1蛋白、B蛋白組成, 分別由hblC、hblD、hblA編碼[24]，分子量分別為43.5、38.2、37.5 kD；非溶血性的腸毒素Nhe是一種典型的α穿孔類毒素，由nheA、nheB和nheC編碼的NheA、NheB和NheC三種蛋白質(zhì)組成[25]，分子量分別為45、39和105 kD；細(xì)胞毒素K也具有溶血性，是一種由CytK編碼的分子量為34 kD的細(xì)胞毒性蛋白，最初在法國爆發(fā)了嚴(yán)重的食物中毒事件后從蠟樣芽胞桿菌NVH391/98中分離出來[26]。

2.1.2 腹瀉毒素作用原理及致病性 腹瀉毒素的臨床表現(xiàn)主要為攝入污染食物8～16 h后出現(xiàn)腹痛、腹瀉的癥狀，持續(xù)12～24 h。但是腹瀉毒素導(dǎo)致人腹瀉的反應(yīng)機(jī)制尚不完全清晰，普遍認(rèn)為毒素是穿孔毒素使小腸上皮細(xì)胞形成孔洞，Na+和Ca2+流失，細(xì)胞因電位失去平衡而凋亡。具有溶血活性的Hbl毒株會(huì)改變血管的通透性并導(dǎo)致皮膚壞死[4]。Beecher等[27]認(rèn)為Hbl是蠟樣芽胞桿菌導(dǎo)致腹瀉的主要毒力因子，并且在L2蛋白、L1蛋白和B蛋白三種組分的共同參與下使腸毒素毒力達(dá)到最大[4]。腸毒素Nhe的三個(gè)蛋白NheA、NheB、NheC接近10∶10∶1的比例產(chǎn)生，三者共同作用[25]。Nhe蛋白復(fù)合物與細(xì)胞的結(jié)合還可能導(dǎo)致胞漿內(nèi)Ca2+和活性氧(ROS)的積聚，激活Fas通路，使細(xì)胞周期在G0/G1期阻滯，引發(fā)細(xì)胞凋亡[28]。劉曉曄等[29]研究表明，Nhe的毒性靶細(xì)胞主要為上皮細(xì)胞，對細(xì)胞的侵襲力呈濃度依賴性，通過抑制其誘導(dǎo)的凋亡信號通路特異性中和抗體可以有效延遲和減弱細(xì)菌對細(xì)胞的侵染。細(xì)胞毒素K有CytK1和CytK2兩種不同的存在形式，CytK1的細(xì)胞毒作用更強(qiáng)[30]。根據(jù)氨基酸序列分類，CytK屬于β-桶孔形成毒素[31]，其對人類腸道Caco-2上皮細(xì)胞具有毒性[4，32]。細(xì)胞毒素K通過含甘氨酸的片段穿透細(xì)胞膜，在脂質(zhì)雙分子層中形成陰離子選擇性通道或孔洞。這種毒素的作用方式是在上皮細(xì)胞中形成毛孔，細(xì)胞因胞內(nèi)液體流出而壞死。Castiaux等[33]認(rèn)為細(xì)胞毒素K參與使人腹瀉的過程，但不是腹瀉的致病因子。

2.2 嘔吐型毒素

2.2.1 嘔吐型毒素的來源及結(jié)構(gòu)特性 嘔吐型毒素是一種非核糖體產(chǎn)生的離子型環(huán)狀十二肽，分子量為1.152 kD，分子式為(D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val)3[31](圖3)，由位于一個(gè)270 kb的大質(zhì)粒上的嘔吐毒素合成酶(ces)基因簇合成[25，34]。該質(zhì)粒與炭疽桿菌毒力質(zhì)粒pXO1具有較高的序列相似性[35]，被命名為蠟樣芽胞桿菌E4810，也被稱為pCER270[36]。Apetroaie等[37]對13株產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行基因組分析，發(fā)現(xiàn)其16S rRNA基因序列與炭疽芽胞桿菌Ames、Sterne和NC 08234-02完全相同。因此產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽胞桿菌也被單獨(dú)分為一個(gè)亞群，被歸入新種副炭疽芽胞桿菌(Bacillusparanthracis)[38]。

圖3 嘔吐毒素結(jié)構(gòu)式[1]

2.2.2 嘔吐毒素作用原理及致病性 嘔吐毒素具有耐熱、耐酸的特性，活性也不受胃蛋白酶的影響[39]。目前還沒有明確嘔吐毒素引起人類嘔吐的機(jī)制，推測嘔吐毒素進(jìn)入人體后與5-HT3受體結(jié)合，刺激迷走神經(jīng)導(dǎo)致嘔吐。嘔吐毒素毒理與纈氨霉素很相似, 但毒性更強(qiáng)[40]，能將K+轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)[4]，通過抑制脂肪酸的氧化來破壞線粒體的活性，淀粉能促進(jìn)嘔吐毒素的產(chǎn)生[41]，因此嘔吐食物中毒事件多與進(jìn)食米面等淀粉含量高的食物有關(guān)[4]。嘔吐毒素在宿主中的潛伏期很短，誤食被污染的食品后0.5 h就會(huì)有頭暈嘔吐，伴有腹瀉、發(fā)燒和四肢無力等現(xiàn)象。瑞士一名17歲男孩進(jìn)食放置了4 d的意大利面和香蒜醬后患上了急性腸胃炎，2 d后出現(xiàn)肝衰竭隨后死亡[21]。嘔吐性食物中毒案例表明，嘔吐毒素還會(huì)導(dǎo)致肝功能衰竭，嚴(yán)重可致死

3 蘇云金芽胞桿菌毒素

蘇云金芽胞桿菌的宿主是昆蟲，常被用于病蟲害的生物防治，其芽胞形成過程中產(chǎn)生的伴胞晶體蛋白是區(qū)別于蠟樣芽胞桿菌家族其他菌株最典型的特征。蘇云金芽胞桿菌作為一種天然的殺蟲細(xì)菌，制成的殺蟲劑安全有效[42]，在全世界廣泛應(yīng)用。

3.1 分泌型毒素

3.1.1 分泌型毒素的來源及結(jié)構(gòu)特性 蘇云金芽胞桿菌在對數(shù)生長期產(chǎn)生營養(yǎng)期殺蟲蛋白(vegetative insecticidal proteins, VIPs)和分泌型殺蟲蛋白(secreted insecticidal protein，Sip)等可溶性毒素[8]。VIP類蛋白可分為Vip1、Vip2、Vip3和Vip4四類。Vip1和Vip2構(gòu)成二元毒素，能抑制肌動(dòng)蛋白聚合，主要作用于鞘翅目和半翅目昆蟲[11]；Vip3的研究最為深入，特異于鱗翅目昆蟲；Vip4是新發(fā)現(xiàn)的一類蛋白，其作用方式和靶標(biāo)范圍尚不清楚[43]。目前已知的Sip蛋白Sip1A對鞘翅目幼蟲有毒性[44]。這些可溶性毒素在天然條件下沒有活性，都是通過氨基酸序列的構(gòu)象變化，將非活性毒素轉(zhuǎn)化為活性毒素。Sip和VIP蛋白的分泌還增強(qiáng)了Cry蛋白的殺蟲活性[45]。在蠟樣芽胞桿菌族中，殺蟲毒素并不是蘇云金芽胞桿菌特有的，有的蠟樣芽胞桿菌分離株也能產(chǎn)生Vip2，并且作用機(jī)理與蘇云金芽胞桿菌一致[46]。

3.1.2 分泌型毒素的作用原理及致病性 Vip1和Vip2形成典型的AB型二元毒素，Vip2為細(xì)胞毒性A亞基，Vip1為負(fù)責(zé)細(xì)胞毒性Vip2移位到宿主細(xì)胞中的受體亞基[47-49]。B(Vip1)的蛋白水解酶活性被激活后，與細(xì)胞表面受體相互作用，形成同源七聚體，隨后通過內(nèi)吞體將A(Vip2)有毒成分轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中[47]。一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，A組分就破壞絲狀肌動(dòng)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞紊亂。目前對于Vip3蛋白的作用方式知之甚少，但是有證據(jù)表明Vip3蛋白是通過在細(xì)胞膜上形成孔隙發(fā)揮毒素作用的。被激活的Vip3A毒素與易感昆蟲的中腸上皮細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞溶解，幼蟲因腸道被破壞而死亡[8，48]。Sip蛋白的作用方式尚不清晰，可能是毒素使細(xì)胞膜形成孔隙引起細(xì)胞凋亡[44]，昆蟲出現(xiàn)敗血癥而死。

3.2 晶體毒素

3.2.1 晶體毒素的來源及結(jié)構(gòu)特性 蘇云金芽胞桿菌在芽胞形成期會(huì)產(chǎn)生伴胞晶體。伴胞晶體是一種不溶性殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs)，也稱δ-內(nèi)毒素(delta-endotoxin)，可分為Cry(crystal)毒素和Cyt(cytolytic)毒素兩大家族[50-52]。Cry毒素包含3-結(jié)構(gòu)域毒素類、類Mtx1素類、Cry6類、二元毒素類、Cry22類和伴胞素類[52]。Cyt毒素分為Cyt1和Cyt2兩類，在體外具有溶血活性，也被稱為溶細(xì)胞素。Cry毒素分子量在70～140 kD之間，Cyt毒素分子量較小，僅27 kD左右，與Cry毒素沒有很高的同源性[53]。在蘇云金芽胞桿菌殺蟲毒素中，Cry毒素是最大的群體[54]，并且與Cyt毒素相比，Cry毒素對幼蟲的毒性更大[55]。蘇云金芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌唯一的區(qū)別在于蘇云金芽胞桿菌質(zhì)粒中存在抗昆蟲毒素的編碼基因。Cry毒素和Cyt毒素分別由位于大質(zhì)粒上的殺蟲基因cry和cyt編碼[48]，攜帶殺蟲基因的質(zhì)粒可以在炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌之間轉(zhuǎn)移[56-57]。

3.2.2 晶體毒素的作用原理及致病性 與炭疽芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌不同，蘇云金芽胞桿菌雖然對幾種哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系有毒性[58]，但真正的宿主是節(jié)肢動(dòng)物，其對人類或者其他生物沒有毒性[59]。據(jù)報(bào)道，伴胞素類還能對不同來源的人類癌細(xì)胞具有特異的殺滅活性[58]。Cry毒素在雙翅目昆蟲體內(nèi)有特異性活性，被幼蟲攝入后在其中腸中被蛋白酶溶解，激活為Cry毒素[60]。Cry毒素穿過周轉(zhuǎn)基質(zhì)與中腸上皮細(xì)胞的鈣黏蛋白等受體結(jié)合[61]，從而激活細(xì)胞死亡途徑，再與堿性磷酸酶(ALP)或者氨基肽酶(APN)順序結(jié)合，形成低聚物，然后插入膜中，形成孔洞，改變細(xì)胞滲透壓使其死亡[62]。細(xì)菌在破壞昆蟲中腸上皮后進(jìn)入血腔，使其出現(xiàn)敗血癥而死亡[63](圖4)。Cyt毒素體外和體內(nèi)作用機(jī)理不同，在體外具有溶細(xì)胞作用。Cyt晶體被腸道蛋白酶水解激活，Cyt毒素與受體不飽和磷脂結(jié)合形成低聚物，然而低聚物是否在細(xì)胞膜上形成孔洞還不明確。Cyt毒素在體內(nèi)主要對雙翅目昆蟲具有毒力，部分Cyt蛋白的表達(dá)需要蛋白P20的輔助，與Cry毒素具有協(xié)同作用。Cyt毒素的殺蟲譜較窄，本身殺蟲活性不高，但能增強(qiáng)Cry蛋白的殺蟲活性，并且能降低雙翅目害蟲對Cry蛋白的抗性，提高Cry毒素的殺蟲效率[53]。

圖4 Cry毒素殺蟲的作用機(jī)理[64]

4 展 望

外毒素是蠟樣芽胞桿菌族主要的毒力因子，在各方面存在著區(qū)別與聯(lián)系。在結(jié)構(gòu)特性上，炭疽毒素、蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素和蘇云金芽胞桿菌的Cry毒素均由質(zhì)粒編碼，其中嘔吐毒素為肽類毒素，其他為蛋白質(zhì)毒素。在作用機(jī)制上，蠟樣芽胞桿菌腸毒素、蘇云金芽胞桿菌毒素同屬于穿孔類毒素，使細(xì)胞膜形成孔道導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在致病性上，炭疽毒素的受體廣泛分布于各組織器官中，對多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞均具有殺傷作用，危害性大；蠟樣芽胞桿菌毒素主要作用于胃腸道，引發(fā)食物中毒；而蘇云金芽胞桿菌毒素主要?dú)ハx，特異性強(qiáng)，對環(huán)境友好，是目前廣泛應(yīng)用的微生物殺蟲劑。

蠟樣芽胞桿菌族種類繁多，關(guān)系復(fù)雜?；蚪M的高同源性和質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移，可能給蠟樣芽胞桿菌和炭疽芽胞桿菌抗生素治療帶來很大問題。炭疽桿菌水腫毒素在感染中的作用和蠟樣桿菌嘔吐毒素致病機(jī)理目前尚不十分明確，迫切需要探索和開發(fā)阻止炭疽毒素和蠟樣毒素從頭生物合成的方法。蘇云金芽胞桿菌應(yīng)探究如何在不發(fā)生芽胞形成的情況下提高Cry蛋白表達(dá)效率，方便Cry蛋白收集，提高殺蟲劑產(chǎn)量。