芒柄花素對腦缺血再灌注后血腦屏障完整性影響

孫 瑜 ，劉 淼*，王 健，陳 磊，喬 夕，陳莉莉，韓真真，孫精通

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津市兒童醫(yī)院，天津 300074）

血腦屏障（BBB）是血-腦、血-腦脊液和腦脊液-腦三種屏障的總稱，是腦毛細血管阻止某些物質(zhì)由血液進入腦組織的結(jié)構(gòu)。腦缺血再灌注后，BBB 的一些微細結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其開放性具有一定規(guī)律［1-5］。近年來，大量研究表明［8-10］芒柄花素（FMN）在抗腫瘤、降血脂、改善雌激素水平等方面有顯著效果，在腦缺血再灌注（I/R）損傷中具有抑制神經(jīng)炎癥、保護BBB 的作用。芒柄花素引入磺酸基，制成芒柄花素磺酸鈉（Sul-F），具有很好的水溶性。本研究擬進一步考查Sul-F 注射液對大鼠腦缺血再灌注后BBB 完整性的影響，以期進一步為其臨床用藥提供一定實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 SPF 級SD 大鼠，雄性，初始體重（250±20）g，生產(chǎn)許可證號:SCXK-（軍）2014-0001，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，飼養(yǎng)室溫度20～25 ℃、相對濕度50%～65%。Sul-F 對照品（河北國金藥業(yè)有限責任公司，批號09092602，純度95%以上）；Sul-F（山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司，規(guī)格：5 ml∶100 mg，批號09092602）。Evans Blue（Solarbio，規(guī)格:1 g，批號619C049）；甲酰胺（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號20150819）；氯化鈉注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號A15012304-2）；水合氯醛（分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，批號20020323）。

1.2 儀器 激光多普勒及經(jīng)皮氧分壓測量儀PeriFlux System 5000 (Datavagen 9A，175 43 Jarfalla，Sweden)；STRONG 90 牙科鉆（SAESHIN PRECISION IND.CO.）；INFINITE 200 PRO 酶標儀（Tecan Austria GmbH）；SIGMA 3K15 低溫高速離心機（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；T 18D S25 組織勻漿機（IKA，Germany）；FA1004 上皿電子天平（中華人民共和國上海精科天平）。

2 方法與結(jié)果

2.1 BBB 通透性檢測 大鼠稱重后于手套內(nèi)，處于清醒狀態(tài)，于相應(yīng)時間點前0.5 h 尾靜脈注射2%EB（注射量：4.0 ml/kg，Sul-F 給藥量為20 mg/kg。2%EB 由注射用水稀釋4 倍的Sul-F 注射液配制）。0.5 h 后，10%水合氯醛麻醉大鼠，開胸用生理鹽水左心室灌注，直至右心耳流出液為清亮。取腦，生理鹽水沖洗干凈，紗布擦干，稱其濕重后放入試管中，加入甲酰胺至6 ml（約為腦重量的3 倍），蓋上蓋子45 ℃水浴24 h，冰浴中勻漿。取出后4 ℃、15 000 r/min 離心20 min，取上清液，于酶標儀620 nm 測吸光度，根據(jù)所測得的吸光度在繪制的標準曲線上查得EB 濃度。

2.2 腦缺血再灌注動物模型（MCAO）的制備及評價 采用線栓法制備大鼠MCAO 模型。用栓線阻斷大鼠大腦中動脈，并于缺血60 min 后行再灌注。假手術(shù)組只分離、暴露血管，不結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈，不插入栓線。采用多普勒激光血流儀（laserdoppler flowmetry，LDF）監(jiān)測大鼠大腦中動脈栓塞及再灌注后的腦血流(cerebral blood flow，CBF）動態(tài)變化［6，7］。

2.3 實驗動物分組 取SD 大鼠禁食不禁水12 h，復(fù)制大鼠腦缺血再灌注模型，隨機分為假手術(shù)組（n=5）、溶劑對照組（n=5）、給藥組（n=5）。分別于腦缺血1 h 及再灌注0、1、4、24 和48 h 實施心臟灌流后取腦組織進行勻漿（每組分別于取樣前0.5 h 按20 mg/kg 劑量尾靜脈注射Sul-F 注射液），按腦組織樣品預(yù)處理方法處理，使用酶標儀于620 nm 下測定EB 吸光度。

2.4 標準曲線 稱取適量伊文思蘭加入空白腦勻漿液使其濃度依次為0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 和80 μg/ml。置于45 ℃水浴箱24 h，以甲酰胺作為空白對照管，用熒光酶標儀在EB 最大吸收光譜620 nm 處測定各濃度（C 值）EB 溶液的吸光度（Y 值），根據(jù)所測數(shù)值計算出回歸方程。結(jié)果EB 在0.625～80 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為Y=0.020 9C-0.001 2（n=8，r=0.999 8）。

2.5 Sul-F 對BBB 完整性影響 復(fù)制大鼠腦缺血再灌注模型，按實驗動物組別分別尾靜脈注射2%EB、Sul-F 注射液（以2%EB 配制）。分別測得腦缺血1 h 及再灌注0、1、4、24 和48 h 伊文思蘭濃度-時間數(shù)據(jù)見表1，濃度－時間曲線見圖1，BBB 透過率的比較見圖2。

表1 模型大鼠溶劑組/給藥組伊文思蘭濃度-時間數(shù)據(jù)（，n=5）

與溶劑組比較，*P＜0.05

圖2 血腦屏障透過率比較圖

3 討論

3.1 腦組織中EB 的提取 考查了甲酰胺、三氯乙酸提取腦組織中的EB。以甲酰胺為提取劑提取腦組織中的EB，可以對整個腦組織進行提取，而不必勻漿，大大避免了樣品損失，實驗結(jié)果顯示線性關(guān)系良好。

3.2 Sul-F 對BBB 完整性的影響 伊文思蘭實驗表明Sul-F 具有降低腦缺血再灌注損傷中BBB 完整性的作用。根據(jù)相關(guān)研究表明［8］，芒柄花素能顯著減少炎癥因子iNOS、TNF-α 和IL-1β 的表達，降低BBB 通透性和MMPs 活性，改善神經(jīng)功能損傷。本實驗研究結(jié)果顯示，Sul-F 能一定程度上降低腦缺血再灌注模型大鼠BBB 伊文思蘭透過率。

腦缺血再灌注損傷后BBB 完整性受到一定破壞，并且呈開放、關(guān)閉波動式變化：腦缺血1 h 及再灌注0、4 和48 h 時，BBB 透過率相對較高，腦缺血1 h 及再灌注1 和24 h 時，BBB 透過率相對較低；且腦缺血1 h 及再灌注4 h 時，BBB 透過率最高。

相應(yīng)時間點，給藥組比溶劑組EB 的透過率低7.0～9.0 μg/ml，提示在不同時間點給予Sul-F 后，均呈現(xiàn)明顯的降低BBB 通透性的作用，表明Sul-F 能一定程度上降低腦缺血再灌注模型大鼠BBB 伊文思蘭透過率。