核酸適配體技術在食品危害因子檢測中的應用研究進展

◎ 徐婧婧，紀晗旭，李雨楓

（南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 210093）

隨著生活水平的提高，人們對食品安全有了更高的要求。但目前我國食品安全形勢依然嚴峻，食品安全事件層出不窮，食品中的重金屬、生物毒素、致病微生物、農(nóng)獸藥殘留等危害因子超標是構(gòu)成食品安全威脅的主要誘因。加強對食品中危害因子的檢測，把好從農(nóng)田到餐桌的每一道防線，滿足人們對食品安全的越來越高的要求，是食品檢測行業(yè)義不容辭的責任。隨著食品行業(yè)的快速發(fā)展，食品檢測技術也面臨更新?lián)Q代，探索應用核酸適配體等新型技術實現(xiàn)食品中危害因子精準檢測已得到越來越多的關注。

1 核酸適配體概述

近年來，核酸適配體作為一種新的生物識別技術逐漸走進人們的視野。核酸適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）技術從體外篩選得到的能以較高親和力與各類目標物特異性結(jié)合的一類單鏈寡核苷酸序列，一般由幾十個核苷酸組成，可以是RNA，也可以是單鏈DNA（ssDNA）。核酸適配體可通過鏈內(nèi)某些互補堿基間的配對以及靜電作用、氫鍵作用等自身發(fā)生適應性折疊，形成一些穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡（hairpin）、假結(jié)（pseudoknot）、凸環(huán)（stem loop）、G-四分體（G-quartet）等，因此它可與各類目標靶分子結(jié)合[1]。與同樣作為生物識別元件的抗體相比，核酸適配體具有很多優(yōu)勢：①可通過調(diào)節(jié)適配體DNA序列的長度和組成獲得更好的結(jié)合力或特異性，與靶分子結(jié)合的解離常數(shù)可達到10-9～10-12。②適配體是在體外合成制備的，價格低廉，生產(chǎn)周期短，且可保證批次間的穩(wěn)定性，而抗體依賴于生物體，制備時間長，價格昂貴，批間差異大。③適配體穩(wěn)定性高，保存時間長，可在常溫下運輸。④適配體易于修飾基團，如氨基、生物素、熒光基團等，便于表面固定或檢測。由于適配體優(yōu)異的特性，現(xiàn)已在很多領域得到廣泛應用，如臨床診斷、藥物輸送、環(huán)境監(jiān)測等。

2 核酸適配體在食品檢測中的應用

2.1 真菌毒素

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的毒性次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于糧食及谷物制品、啤酒、咖啡、葡萄、葡萄酒以及調(diào)味料等食品中。常見的真菌毒素有黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）、赭曲霉毒素A（Ochratoxins A，OTA）、伏馬毒素（Fumonisins，F(xiàn)Bs）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）及T-2毒素（T-2）等[2]。2008年，CRUZ-AGUADO等[3]篩選出與赭曲霉毒素A具有高親和力的適配體，并成功進行應用，展示了適配體強大的應用前景。WU等[4]將赭曲霉毒素A適配體固定在磁性微球上，從復雜樣品中捕獲OTA，洗脫后用高效液相進行檢測，對幾種不同種類的食品樣本進行富集，回收率在67%～90%。與傳統(tǒng)的免疫親和柱相比，這種方法更加廉價有效，且更容易制備。

2.2 食源性致病菌

食源性致病菌是指隨食物侵入機體可引發(fā)人畜共患病的一類病原微生物。常見的食源性致病菌包括致病性大腸桿菌、沙門氏菌、單核細胞增多性李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、致病性弧菌和彎曲桿菌等。食源性致病菌引起的疾病已成為世界最為關注的公共衛(wèi)生安全問題之一。目前微生物的檢測方法包括培養(yǎng)法、免疫檢測法、PCR法等，然而這些方法操作繁瑣，檢測時間長、準確度不高。利用SELEX技術可篩選出與致病菌具有高親和力、高特異性的適配體，從而可開發(fā)出高靈敏度、快速的致病菌檢測技術。

WU等[5]利用了兩種針對大腸桿菌0157：H7外膜的不同適配體，其中一個適配體用于磁珠富集，另一個作為該病原體的信號報告體，通過等溫鏈位移擴增（SDA）進行擴增，并通過側(cè)向流層析試紙條進一步檢測。僅對捕獲的細胞膜適配體進行擴增，大大降低了傳統(tǒng)DNA擴增方法的假陽性等局限性，產(chǎn)生的信號可以通過肉眼清楚地讀出。

2.3 重金屬

重金屬指密度大于5 g·cm-3的的金屬，常見有鉛、銅、汞、鉻等。隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，空氣、水、土壤中的重金屬污染問題越來越嚴重，而重金屬可通過食物鏈進入人體中，引起慢性中毒，危害人體健康。例如，過量的鉛會對人的神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟和大腦造成損害，對兒童的損傷影響更大。OUYANG等[6]基于適配體-金納米粒子-等離子共振效應建立了一種簡便、靈敏、特異性的檢測Pb2+的方法。在維多利亞藍B（VBB）分子探針存在下，在1 614 cm-1處的納米等離子體表面增強拉曼散射（SERS）下，金納米顆粒（AuNP）強烈地催化H2O2和HAuCl4形成金納米顆粒（GNP）。添加pb2+適配體后，由于GNP納米等離子體效應的氧化還原產(chǎn)物減少，導致其SERS、表面等離子體共振（SPR）吸收和共振瑞利散射（RRS）降低。當Pb2+加入時，適配體與Pb2+結(jié)合形成非常穩(wěn)定的G-四聯(lián)體和游離AuNPs，導致催化恢復，RRS和SERS強度呈線性增強。

2.4 農(nóng)獸藥殘留

農(nóng)獸藥在當代農(nóng)畜業(yè)中發(fā)揮著重要的作用，它的使用可以減少植物病蟲害或治療和預防動物疾病，減少經(jīng)濟損失。然而農(nóng)獸藥的過度使用或濫用極易引起食品中農(nóng)獸藥殘留超標，經(jīng)食物鏈進入人體后，易導致產(chǎn)生蓄積毒性和耐藥性。加強對食品中的農(nóng)獸藥殘留的檢測，是保證食品安全的重要措施?；谶m配體特異性強，穩(wěn)定性高的優(yōu)點開發(fā)農(nóng)獸藥殘留檢測方法成為研究熱點。DU等[7]采用SELEX方法篩選制備得到高親和力、高特異性紅霉素適配體。將適配體與重組酶聚合酶擴增（RPA）和橫向流動條帶（LFS）結(jié)合，構(gòu)建了一種新型的橫向流動適配體傳感器。將適配體與互補鏈雜交后固定在固相表面，當適配體與目標物結(jié)合時，適配體被洗脫下來。洗脫的適配體作為RPA擴增的模板，對檢測信號進行放大和轉(zhuǎn)換。橫向流動檢測過程在15 min內(nèi)完成，檢測限為3 pmol·L-1

2.5 其他危害因子

除上述的4類食品危害因子外，適配體還可應用于食品中過敏源、非法添加物、食品包裝材料遷入等的檢測。β-乳球蛋白（β-Lg）是牛奶和乳制品中的主要過敏源，可引起某些人群（尤其是嬰幼兒）的食物過敏。QI等[8]篩選出β-乳球蛋白適配體后，利用表面增強拉曼散射技術和熒光檢測高效、靈敏地檢測乳制品中的過敏源β-乳球蛋白，檢測范圍為10～5 000 ng·mL-1，檢測限為0.05 ng·mL-1。WU等[9]利用適配體技術和黑磷指間電極建立了一套用于檢測孔雀石綠的方法，對孔雀石綠的最低檢測限為0.3 ng·L-1，該方法為今后制備現(xiàn)場大規(guī)模篩查檢測食品中孔雀石綠等非法添加物提供了一種新的研究途徑。

3 結(jié)語

核酸適配體作為一種新的生物傳感技術，具有穩(wěn)定性高、運輸方便、便于合成等優(yōu)點。其易于修飾，可與納米金、電化學、SERS等其他生物納米技術相結(jié)合，獲得更高的靈敏度，更大的應用范圍，顯示出巨大的應用前景。今后適配體的研究方向除篩選出更多的目標適配體外，還可兼顧小型化、集成化儀器的開發(fā)，順應市場需求，更好服務市場食品安全監(jiān)管。