雞弱精癥相關(guān)精漿蛋白組分析

魏 岳，李云雷，孫研研，武艷平，唐維國(guó)，陳繼蘭*，謝金防*

(1. 江西農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，南昌 330200； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖(家禽)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

精子活力是衡量精液質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，精子活力低下引起的弱精癥主要表現(xiàn)為精子前向運(yùn)動(dòng)數(shù)量(A類和B類)的比例小于50%或快速直線前向運(yùn)動(dòng)數(shù)量的比例小于25%，其嚴(yán)重影響人和動(dòng)物的生殖能力[1-3]，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年有5%～12%的種公雞因產(chǎn)精能力低下而被淘汰[4]。中國(guó)地方雞中，由于各種因素普遍存在著精子活力偏低的問(wèn)題，精子活力低下成為制約地方雞種產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的限制因素之一。雞精子主要貯藏于輸精管中，精漿來(lái)自睪丸、附睪和輸精管，與哺乳動(dòng)物相比，由于缺少副性腺，雞精液具有體積小、濃稠且精子密度大的特點(diǎn)。精漿是精子重要的環(huán)境載體，為精子提供營(yíng)養(yǎng)和能量，其中的重要成分精漿蛋白影響精子在雌性生殖道中的貯存，參與精子獲能、頂體反應(yīng)和免疫應(yīng)答等諸多生殖過(guò)程[5-7]。目前，人和動(dòng)物中對(duì)弱精癥的研究主要集中于精子、染色體異?；蛳嚓P(guān)生殖器官病變的研究[8-10]，而對(duì)精漿的研究較少。富麗等[4]采用 RT-qPCR技術(shù)在公雞睪丸組織中進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，COX7B、hPTGDS和WNT2等候選基因在弱精組個(gè)體睪丸中的表達(dá)量與正常個(gè)體相比有顯著差異。許紅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，SOX5基因在弱精癥公雞睪丸中的表達(dá)顯著低于正常公雞，而且SOX5基因和蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與公雞性成熟和繁殖機(jī)能衰退的趨勢(shì)一致，推測(cè)SOX5基因?qū)u睪丸發(fā)育水平和精子活力具有重要調(diào)控作用。劉一帆[12]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)構(gòu)建雞精子活力相關(guān)mRNA-miRNA-lncRNA 互作網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)到一個(gè)包括35個(gè)lncRNAs、119個(gè)mRNAs和18個(gè)miRNAs的調(diào)控因子集合。

本試驗(yàn)以寧都黃雞作為研究對(duì)象，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)開展雞精漿蛋白組學(xué)的研究，篩選與弱精癥相關(guān)的差異蛋白，分析差異蛋白可能參與的調(diào)控通路以及在精子運(yùn)動(dòng)中的作用，為進(jìn)一步闡明弱精癥的病理學(xué)基礎(chǔ)，尋找弱精癥診斷的新靶點(diǎn)并以提高繁殖性能為目標(biāo)的分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)動(dòng)物為來(lái)自江西惠大實(shí)業(yè)有限公司寧都黃雞原種場(chǎng)同批次孵化的寧都黃雞公雞。篩選方法參考文獻(xiàn)[4]，從42周開始每隔3 d進(jìn)行1次鏡檢，共進(jìn)行3次，選擇前向精子比例<20%，且直線前向精子比例<10%的個(gè)體作為弱精組樣本，前向精子比例>80%，且直線前向精子比例>40% 的個(gè)體作為對(duì)照組樣本，每組各4只。

1.1.2 主要試劑 考馬斯亮藍(lán)G250、蛋白酶抑制劑混合物和BCA試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；10% SDS-PAGE預(yù)制膠購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；肽N-糖苷酶F(PNGase F)購(gòu)自NEB(北京)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 采集寧都黃雞公雞精液，按精液體積加入蛋白酶抑制劑混合物(終濃度為1%)，4 500×g 4 ℃離心10 min；吸上清，重復(fù)2～3次。采用BCA法測(cè)定上清液總蛋白濃度，-80 ℃保存。

1.2.2 蛋白質(zhì)去糖基 取30 μg總蛋白，加入0.8 μL PNGase F，100 ℃消化10 min。

1.2.3 SDS-PAGE 取25 μg去糖基總蛋白，加入4×DTT buffer，變性，10% SDS-PAGE電泳(200 V·h-1)，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色。

1.2.4 膠內(nèi)酶解 切下電泳膠上目標(biāo)條帶，置于EP管中，同時(shí)切下空白膠塊作對(duì)照；加入200～400 μL 100 mmol·L-1NH4HCO3/30% ACN脫色，清洗至透明，棄上清，凍干；每管加入90 μL 100 mmol·L-1NH4HCO3，10 μL 100 mmol·L-1DTT，56 ℃孵化30 min；棄上清，每管加100 μL 100% ACN，5 min后吸除；每管加入70 μL 100 mmol·L-1NH4HCO3，30 μL 200 mmol·L-1IAA(現(xiàn)配，避光保存)，暗處放置20 min；棄上清，加入100 μL 100% ACN，5 min后吸去，凍干；凍干后加入5 μL 2.5～10 ng·μL-1Trypsin溶液，置于4 ℃ 冰箱30～60 min，使膠塊充分吸脹(棄除剩余液)；再加入20～30 μL 50 mmol·L-1NH4HCO3緩沖液(無(wú)Trypsin)，pH 7.8～8.0，37 ℃反應(yīng)過(guò)夜20 h左右；吸出蛋白酶解液，轉(zhuǎn)移至新EP管中，原管中加入100 μL 60% ACN/0.1% TFA超聲15 min， 吸出溶液并入前次溶液，反復(fù)抽提3次，合并，凍干；樣品制備完成。

1.2.5 質(zhì)譜分析 質(zhì)譜上機(jī)分析由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖(家禽)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

使用Thermo Proteome Discoverer 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)檢索和鑒定，比對(duì)紅原雞參考蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)(Gallusgallus(Red jungle fowl)Reference proteome)；數(shù)據(jù)差異分析使用SPSS 23.0軟件T檢驗(yàn)完成；選擇表達(dá)差異倍數(shù)≥2(上調(diào))或≤0.5(下調(diào))且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率q< 0.05的蛋白為差異表達(dá)蛋白；對(duì)每個(gè)樣品中蛋白相對(duì)含量進(jìn)行聚類分析并進(jìn)行Z值校正，利用聚類熱圖觀察不同蛋白在不同樣品間比較時(shí)的上調(diào)、下調(diào)情況；針對(duì)篩選出來(lái)的差異蛋白進(jìn)行GO注釋、KEGG功能富集分析和互作網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié) 果

2.1 弱精和正常雞只篩選

42周齡開始篩查寧都黃雞公雞的精子質(zhì)量，包括精子密度、精子活力和精液量，從中篩選出對(duì)照組和弱精組個(gè)體各4只，T檢驗(yàn)顯示，弱精組個(gè)體的精子密度和精子活力極顯著低于對(duì)照組(P<0.01，表1)。

表1 對(duì)照組與弱精組精液質(zhì)量比較

2.2 SDS-PAGE電泳

總蛋白去糖基化后，SDS-PAGE結(jié)果顯示，同組內(nèi)平行樣本間一致性較好，弱精組和對(duì)照組間的差異條帶明顯(圖1)。

2.3 弱精組與對(duì)照組差異表達(dá)精漿蛋白分析

本研究在弱精組與對(duì)照組中共發(fā)現(xiàn)584個(gè)蛋

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 弱精組混合樣；2～5. 弱精組L1-L4；6～9. 對(duì)照組N1-N4；10. 對(duì)照組混合樣 M.Protein marker; 1. Mixed samples in asthenospermia group; 2-5. L1-L4 in asthenospermia group; 6-9. N1-N4 in control group; 10. Mixed samples in control group圖1 SDS-PAGE電泳結(jié)果(左)和蛋白marker分子量(右)Fig.1 SDS-PAGE result(left) and protein marker molecular mass (right)

白，兩組間差異表達(dá)蛋白有78個(gè)。差異蛋白聚類分析顯示，蛋白被分為兩個(gè)主要的簇(縱向)，每一組中又被分為上調(diào)(紅色)和下調(diào)(藍(lán)色)表達(dá)蛋白，樣品聚類分析結(jié)果(橫向)與樣品實(shí)際組別相符(圖2)。與對(duì)照組相比，弱精組中有5個(gè)精漿蛋白表達(dá)上調(diào)，包括KRT9、SEPP2、VTG2、ABHD14B和一個(gè)未知蛋白，其余73個(gè)蛋白均表達(dá)下調(diào)，其中，VNN1、PLCZ1、GK和SLC2A3等蛋白表達(dá)下調(diào)倍數(shù)較大(q<0.05)，值得注意的是，HOGA1、PAH和LCAT僅在對(duì)照組的全部樣品中檢測(cè)到表達(dá)，KRT9和SEPP2僅在弱精組全部樣品中檢測(cè)到表達(dá)(表2)。

2.4 差異蛋白的GO注釋和KEGG富集分析

利用DAVID在線進(jìn)行弱精組和對(duì)照組精漿差異蛋白的基因功能注釋和信號(hào)通路富集分析，結(jié)果顯示，差異蛋白分子功能涉及蛋白酶活性和蛋白域特異結(jié)合；涵蓋的生物學(xué)過(guò)程包括糖代謝、蛋白質(zhì)水解和高爾基體建立等；涉及的細(xì)胞功能包括細(xì)胞器、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和髓鞘等(圖3)。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白富集于新陳代謝、糖酵解、碳代謝、抗體合成和氨基酸合成等信號(hào)通路(圖4)。

2.5 蛋白互作分析

利用SRTING在線軟件分析差異蛋白間的互作情況，將互作程度為高置信度(Score≥0.7)的蛋白列出(圖5)，其功能主要涵蓋了糖代謝、脂代謝、ATP合成和小分子代謝等生物學(xué)功能(表2)。

3 討 論

本研究?jī)H在正常組或弱精組中檢測(cè)到的蛋白在人或其他動(dòng)物中均與能量代謝和精子功能有關(guān)。相關(guān)研究表明，HOGA1參與谷氨酸和天冬氨酸的代謝過(guò)程，將4-羥基-2-氧代戊二酸的物質(zhì)分解為丙酮酸和乙醛酸鹽，其分解產(chǎn)物參與多種能量代謝和新陳代謝，HOGA1突變與原發(fā)性高草酸尿3型(pH3)有高度的相關(guān)性[21]。PAH是苯丙氨酸羥化為酪氨酸的限速酶，PAH活性下降或顯著缺乏會(huì)導(dǎo)致苯丙氨酸及其旁路代謝產(chǎn)物堆積和酪氨酸的生物合成減少[22]，而酪氨酸磷酸化程度與精子超激活運(yùn)動(dòng)有著一定的相關(guān)性[23]。PAH基因突變還是引起人先天性、常染色體隱性遺傳的氨基酸代謝病—高苯丙氨酸血癥的主要原因[24]。LCAT是脂蛋白代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用的一種酶，對(duì)維持膽固醇穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)膽固醇在血液循環(huán)中的轉(zhuǎn)運(yùn)及膽固醇在外周組織中的清除有十分重要的作用[25-27]。膜脂質(zhì)主要由膽固醇、磷脂和糖脂組成，它們分別在精子生成的不同階段發(fā)揮細(xì)胞黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用[28]。有研究表明，人精漿中總膽固醇含量與精子的密度、數(shù)量、活力以及形態(tài)均呈正相關(guān)，包括LCAT在內(nèi)的多個(gè)參與膽固醇代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的標(biāo)志物在所研究的組織標(biāo)本中均有不同程度的表達(dá)，而精漿中膽固醇濃度與血清膽固醇、血脂水平、血清中生殖激素(FSH、LH、睪酮、雌二醇、性激素結(jié)合球蛋白、抑制素B)水平均無(wú)相關(guān)性，表明精漿中的膽固醇可能對(duì)精子發(fā)生具有重要作用[29]。KRT9基因?qū)儆诩?xì)胞骨架中間絲結(jié)構(gòu)蛋白家族，能與均質(zhì)狀基質(zhì)共同構(gòu)成的一種硬蛋白質(zhì)，保護(hù)上皮細(xì)胞免受損壞或機(jī)械壓力，KRT9致病突變是導(dǎo)致表皮松解性掌跖角化病的主要原因[30]。目前為止，SEPP2基因被發(fā)現(xiàn)僅存在于非哺乳動(dòng)物基因組內(nèi)[31]，在雞體內(nèi)主要負(fù)責(zé)硒轉(zhuǎn)運(yùn)，在雞肝和腎中，該基因的表達(dá)隨飼喂硒濃度升高而增加[32-33]。有研究顯示，在不同濃度硒作用下，雞不同腦區(qū)部位中SEPP2的表達(dá)呈現(xiàn)不同趨勢(shì)。在高硒組，雞脊髓中SEPP2基因與對(duì)照組相比，表達(dá)呈極顯著增加，而在小腦中表達(dá)呈極顯著下降；而在低硒組，脊髓中SEPP2基因表達(dá)與對(duì)照組相比，表達(dá)仍呈顯著的增加，而在小腦中表達(dá)與對(duì)照組相比，差異不顯著；在雞嗅球中無(wú)論是高硒還是低硒組SEPP2基因表達(dá)差異均不顯著[34]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，硒有利于人和動(dòng)物精子活力的水平提升[35-36]，而本研究中，僅在弱精組公雞中檢測(cè)到與硒轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的SEPP2蛋白表達(dá)，SEPP2蛋白表達(dá)量高低與公雞體內(nèi)硒含量的高低以及精子活力的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。除此之外，本研究結(jié)合差異表達(dá)倍數(shù)和蛋白互作等信息，篩選出若干與精子獲能和代謝等作用相關(guān)，可作為研究弱精癥發(fā)病機(jī)理的候選蛋白。其中，VNN1基因編碼泛酰巰基乙胺酶，在其催化作用下生成的半胱胺是防止脂類過(guò)氧化的強(qiáng)抗氧化劑[37]，VNN1基因還受到類固醇生長(zhǎng)因子SF-1和SOX9調(diào)控，有助于調(diào)節(jié)睪丸的應(yīng)激反應(yīng)以及維持CoA水平[38]。PLCZ1基因是睪丸特異表達(dá)基因，它與CAPZA3、IGPB1b和TUBA3b基因具有維持精子頭部形狀的功能[39]。SLC2A3基因編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3，負(fù)責(zé)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。研究顯示，熱應(yīng)激通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路增加HSP70表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)上調(diào)SLC2A3和LDHA的表達(dá)促進(jìn)乳酸合成[40]，SLC2A3在人類精子獲能過(guò)程中磷酸化水平升高[41]。

圖2 弱精組(L1-L4)和對(duì)照組(N1-N4)樣本差異表達(dá)蛋白聚類熱圖Fig.2 Results of differentially expressed proteins cluster analysis in asthenospermia (L1-L4) and control (N1-N4) groups

生物學(xué)過(guò)程：1.糖酵解過(guò)程；2.糖異生；3.中間絲形態(tài)；4.細(xì)胞骨架形態(tài)；5.甘油醛-3-磷酸生物合成；6.蛋白質(zhì)水解；7.基于微管進(jìn)程；8.上皮細(xì)胞分化；9.his細(xì)胞束浦肯野肌細(xì)胞黏附參與細(xì)胞通訊；10.高爾基體的建立；11.氧化還原法；12.心室心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的調(diào)節(jié)。細(xì)胞組分：13.胞外外切體；14.細(xì)胞外間隙；15.髓鞘；16.胞質(zhì)溶膠；17.角蛋白絲；18.血液微粒；19.中間絲；20.細(xì)胞；21.焦點(diǎn)黏附；22.細(xì)胞黏附連接；23.質(zhì)膜外側(cè)；24.細(xì)胞外基質(zhì)。分子功能：25.結(jié)構(gòu)分子活性；26.蛋 白域特異性結(jié)合；27.絲氨酸型內(nèi)肽酶活性；28.β-半乳糖苷酶活性 Biological process: 1.Glycolysis process;2.Gluconeogenesis;3.Intermediate filament morphology;4.Cytoskeleton morphology;5.Glyceraldehyde-3-phosphate biosynthesis;6.Proteolysis;7.Microtubule based process;8.Epithelial cell differentiation;9.His cell bundle Purkinje myocyte adhesion and participation in cell communication; 10.Establishment of Golgi body;11.Redox method;12.Regulation of action potential of ventricular cardiomyocytes. Cell component:13.Extracellular body; 14. Extracellular space;15.Myelin sheath;16.Cytoplasmic sol;17.Keratin filament;18.Blood particles;19.Intermediate filament;20.Cell;21.Focal adhesion;22.Cell adhesion;23.Outer plasma membrane;24.Extracellular matrix. Molecular function: 25.Structural molecular activity;26.Protein domain specific binding;27.Serine endopeptidase activity;28.β-galactose glucosidase activity圖3 GO功能注釋結(jié)果Fig.3 Functional annotation result of gene ontology

圖4 KEGG功能富集分析Fig.4 Functional enrichment analysis of KEGG

圖5 差異蛋白互作分析圖Fig.5 Differential protein interaction analysis graph

表2 部分差異表達(dá)蛋白結(jié)果

本研究所得到的弱精組和對(duì)照組差異表達(dá)蛋白后續(xù)經(jīng)過(guò)進(jìn)一步驗(yàn)證并結(jié)合多組學(xué)研究，為今后發(fā)現(xiàn)更多與弱精癥發(fā)生相關(guān)的未知蛋白或基因提供可能，也為進(jìn)一步闡明弱精癥的發(fā)病機(jī)理提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

在寧都黃雞弱精癥和正常公雞的精漿蛋白中篩選到78個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中，5個(gè)蛋白在弱精組中表現(xiàn)為上調(diào)，其余均表現(xiàn)為下調(diào)。生物信息學(xué)分析顯示，差異表達(dá)蛋白功能涵蓋糖代謝、脂代謝、ATP合成和小分子代謝等生物學(xué)功能。