冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者外泌體lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)分析

黃浪浪 徐驲 劉中勇

(1江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)是指冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化引起管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病〔1〕。CHD是動脈粥樣硬化導(dǎo)致器官病變的最常見類型，嚴(yán)重危害人體健康。據(jù)《中國心血管病報告2018》〔2〕指出，我國現(xiàn)有心血管病人數(shù)2.9億，其中CHD 1 100萬，大陸地區(qū)CHD介入治療總例數(shù)為753 142例，患病率和死亡率呈現(xiàn)快速上升趨勢，給國家醫(yī)療衛(wèi)生帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

外泌體是由細(xì)胞分泌的一種直徑在40～100 nm之間的囊泡，屬于細(xì)胞外囊泡的一種，含有脂質(zhì)、蛋白、受體、不同種類的RNA等成分，可以調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的行為〔3〕，并且可以作為疾病的循環(huán)生物標(biāo)志物，在血液、眼淚、唾液、尿液、腹水等多種體液中都廣泛存在〔4〕。研究表明〔5～8〕，外泌體不僅能在生理情況下通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、RNA、DNA等物質(zhì)在細(xì)胞間通訊發(fā)揮作用，還能影響缺血再灌注損傷、血管鈣化、動脈粥樣硬化等病理狀態(tài)。有證據(jù)表明〔9〕，非編碼(nc)RNAs，包括微小RNA(miRNA,miR)、長非編碼(ln)cRNA和環(huán)狀(circ)RNA在各種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。lncRNA/circRNA可以作為競爭內(nèi)源(ce)RNAs，通過其miRNA反應(yīng)元件與miRNA競爭性結(jié)合，然后間接調(diào)節(jié)miRNA靶向mRNA的表達(dá)〔10〕。近年來，隨著基因芯片高通量測序技術(shù)的發(fā)展和各大生物信息數(shù)據(jù)庫的建立，為CHD的研究提供了有利條件。本研究通過生物信息學(xué)方法，對CHD患者和正常人的血液外泌體數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，探究關(guān)鍵的lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA ceRNA軸并預(yù)測其可能的靶基因，為臨床上診斷和治療CHD提供新的方向。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)收集 從exoRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.exorbase.org/)下載正常人和CHD患者血液外泌體樣本中的mRNA、lncRNA和circRNA數(shù)據(jù)。其中正常樣本32個，含有16 932個mRNA、10 626個lncRNA和40 645個circRNA；CHD樣本6個，含有13 848個mRNA、1 628個lncRNA和3 914個circRNA。

1.2外泌體中差異mRNA、lncRNA和circRNA的篩選 在R3.6.2版本軟件環(huán)境下，應(yīng)用Bioconductor中l(wèi)imma軟件包對CHD樣本和正常樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行mRNA、lncRNA和circRNA差異分析。所有數(shù)據(jù)經(jīng)軟件進(jìn)行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化和log2轉(zhuǎn)換。

1.3預(yù)測差異mRNA、lncRNA和circRNA結(jié)合的miRNA 利用TargetScan網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRanda網(wǎng)站(http://www.microrna.org/microrna/home.do)、miRcode網(wǎng)站(http://www.mircode.org/)和ENCORI網(wǎng)站(http://www.starbase.sysu.edu.cn/)分別對mRNA、lncRNA和circRNA結(jié)合的miRNA進(jìn)行預(yù)測。將得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2(https://cytoscape.org/)軟件中，對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4網(wǎng)絡(luò)中mRNA功能通路注釋分析 為進(jìn)一步了解mRNA的功能和主要作用通路，將上述篩選得到的mRNA輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，選定物種為“homo sapiens”，設(shè)定閾值P<0.05進(jìn)行GO富集和 KEGG 通路注釋分析，并對富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1差異mRNA、lncRNA和circRNA的篩選 通過R軟件對CHD樣本和正常樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及差異分析，得到312個差異mRNA、43個差異lncRNA和85個差異circRNA。其中上調(diào)的mRNA 55個，下調(diào)的mRNA 257個；上調(diào)的lncRNA 24個，下調(diào)的lncRNA 19個；上調(diào)的circRNA 4個，下調(diào)的circRNA 81個。差異mRNA、lncRNA和circRNA中上調(diào)與下調(diào)最顯著的前5個見表1。前20個繪制雙向聚類熱圖，橫坐標(biāo)為樣本，縱坐標(biāo)為差異基因。如圖1～3所示。

圖1 差異表達(dá)mRNA熱圖

圖2 差異表達(dá)lncRNA熱圖

圖3 差異表達(dá)circRNA熱圖

2.2lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 將上述得到的差異mRNA、lncRNA、circRNA分別輸入TargetScan、miRanda、miRcode和ENCORI網(wǎng)站預(yù)測所結(jié)合的miRNA。運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建mRNA、lncRNA、circRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共有145個節(jié)點(diǎn)(其中含有48個mRNA，10個lncRNA、15個circRNA，72個miRNA)和361條邊。藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表circRNA，綠色節(jié)點(diǎn)代表lncRNA，紫紅色節(jié)點(diǎn)代表mRNA，黃色節(jié)點(diǎn)代表miRNA，每條邊表示mRNA、lncRNA、circRNA與miRNA的作用關(guān)系。在網(wǎng)絡(luò)中，一個節(jié)點(diǎn)的度表示網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點(diǎn)相連的路線的條數(shù)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)選出度值較高的節(jié)點(diǎn)，這些節(jié)點(diǎn)可能是整個網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵，并發(fā)揮著關(guān)鍵作用。見圖4。

圖4 lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.3靶點(diǎn)通路分析 將上述篩選出的48個差異mRNA通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析，共得到GO條目69個，其中生物過程(BP)條目39個，細(xì)胞組成(CC)條目7個，分子功能(MF)條目23個(P<0.05)。在BP中，基因主要富集于protein localization to nucleus、positive regulation of phosphoprotein phosphatase activity、positive regulation of phosphatase activity中。在CC中，主要富集在calcium channel complex、host、host cell等中。在MF中，主要富集在phosphatase regulator activity、protein phosphatase activator activity、phosphatase activator activity中。各類別排名前10的GO條目繪制氣泡圖，如圖5所示。KEGG通路富集篩選得到4條信號通路(P<0.05)，涉及Glucagon signaling pathway、Estrogen signaling pathway、Phototransduction、RNA transport。見圖6。

圖5 差異表達(dá)mRNA GO富集分析

圖6 差異表達(dá)mRNA KEGG富集分析

3 討 論

在臨床上，許多CHD患者早期往往沒有明顯的表現(xiàn)癥狀，而一旦發(fā)病，嚴(yán)重者則會導(dǎo)致心肌梗死甚至猝死。冠狀動脈造影作為有創(chuàng)性檢查手段，目前仍是診斷CHD的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但其在實(shí)際運(yùn)用中，具有一定的局限性。此外，CHD患者還存在藥物不良反應(yīng)、介入手術(shù)費(fèi)用昂貴、術(shù)后再狹窄等方面的問題。因此，進(jìn)一步對CHD生物標(biāo)志物及其作用機(jī)制的研究顯得尤為重要。

幾乎所有類型的細(xì)胞都可以分泌外泌體，目前研究發(fā)現(xiàn)的外泌體中所含的核酸包括mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA等。mRNA是一大類RNA分子，種類繁多，它是指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成的直接模板〔11〕。miRNA、lncRNA和circRNA是非編碼RNA，已被證實(shí)參與了CHD的發(fā)病和進(jìn)展〔12，13〕。miRNA是小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，19～22個核苷酸長度，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡和代謝的調(diào)控〔14〕。lncRNA存在于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，長度大于200個核苷酸長度，其功能沒有明顯的蛋白質(zhì)編碼功能，它們可以與DNA，RNA或蛋白質(zhì)相互作用〔15〕。circRNA來源于單個RNA分子，其末端由共價鍵連接而非5′和3′游離端組成。一些circRNA能與RNA結(jié)合蛋白相互作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，或者被翻譯成蛋白質(zhì)〔16〕。在心血管組織和器官中，circRNA參與了心肌修復(fù)調(diào)節(jié)、血管平滑肌細(xì)胞和心肌纖維化等生理和病理過程〔17〕。lncRNA和circRNA能競爭性結(jié)合miRNA，導(dǎo)致miRNA結(jié)合的mRNA減少，從而影響蛋白的表達(dá)。因此lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)調(diào)控冠心病發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵基因的RNA表達(dá)。由于外泌體的特殊結(jié)構(gòu)和功能，使得它具有潛在的應(yīng)用價值，一方面可以作為診斷多種疾病的生物指標(biāo)，另一方面也可以作為治療手段，未來有可能作為藥物的天然載體用于臨床治療〔18〕。本研究結(jié)果提示差異表達(dá)下調(diào)的hsa_circ_0000038和hsa_circ_0000160；miRNA 3個，分別為hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-363-3p可能是CHD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，可作為早期檢測生物標(biāo)志物在臨床工作中進(jìn)一步探索。對CHD網(wǎng)絡(luò)中差異表達(dá)的48個mRNA進(jìn)行GO和KEGG富集分析，GO生物過程富集分析涉及磷酸蛋白磷酸酶活性的正調(diào)節(jié)、磷酸酶活性的正調(diào)節(jié)等。磷酸酶包括酸性磷酸酶和堿性磷酸酶。血清堿性磷酸酶是一種催化血管鈣化抑制劑無機(jī)焦磷酸鹽水解的酶，它能通過破壞無機(jī)焦磷酸鹽的結(jié)構(gòu)和活性，降低焦磷酸水平，導(dǎo)致血管鈣化，而血管鈣化是冠狀動脈疾病形成的基石〔19〕。相關(guān)研究表明〔20，21〕，堿性磷酸酶水平不僅與CHD患者的冠狀動脈鈣化嚴(yán)重程度具有相關(guān)性，而且還與CHD患者不良預(yù)后和死亡率相關(guān)。唐恩燕等〔22〕對470例CHD患者進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶水平升高可能與冠狀動脈狹窄有關(guān)。通過KEGG富集分析顯示，差異表達(dá)mRNA主要通過參與胰高血糖素、雌激素和核糖核酸運(yùn)輸?shù)刃盘柾纷饔糜贑HD。胰高血糖素是一種由胰臟胰島α-細(xì)胞分泌的激素，能夠激活脂肪酶，促進(jìn)脂肪的分解和脂肪酸氧化。在腸黏膜的L細(xì)胞中，胰高血糖素原基因的主要表達(dá)產(chǎn)物是胰高血糖素樣肽(GLP)-1〔23〕。GLP-1可以通過以下機(jī)制影響CHD：①能直接作用于腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致eNOS和NO釋放，起到抗凝血、抗氧化的作用，從而改善血管內(nèi)皮功能；②抑制炎癥反應(yīng)和氧化損傷，從而改善機(jī)體動脈粥樣硬化情況；③促進(jìn)心肌缺血后左心室功能和心肌頓抑的恢復(fù)，減少心肌缺血/再灌注所引起的損傷〔24～26〕。雌激素的生理作用主要由雌激素受體(ESR)介導(dǎo)，ESR 分為ESRα和ESRβ兩種亞型，ESRα可以通過抑制CD4+T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移和降低腫瘤壞死因子以及白細(xì)胞介素-6 的表達(dá)來減輕炎癥反應(yīng)。雌激素既能通過增加血漿中內(nèi)皮源性松弛因子NO的濃度來促進(jìn)血管舒張，也能通過減少血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)錄來抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)；此外，還被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)特定的炎癥標(biāo)志物和細(xì)胞因子〔27，28〕。

CHD歸屬中醫(yī)“胸痹”“心痛”范疇。中醫(yī)有著數(shù)千年的歷史，在理論上獨(dú)樹一幟，在臨床上也很豐富。辨證論治和整體觀念是中醫(yī)的兩個基本特征。中醫(yī)藥在CHD的預(yù)防、治療和預(yù)后中起著重要作用。然而，中醫(yī)藥治療CHD的機(jī)制尚未闡明。結(jié)合生物信息學(xué)分析，認(rèn)為lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)可能是中醫(yī)有效治療CHD的一種新的調(diào)節(jié)機(jī)制。lncRNA和circRNA與miRNA彼此相互作用，以調(diào)節(jié)CHD發(fā)生和發(fā)展過程中某些關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)〔29〕。據(jù)相關(guān)研究表明〔30〕，中藥具有保護(hù)心肌細(xì)胞、抗動脈粥樣硬化、抑制細(xì)胞凋亡及通過調(diào)節(jié)miRNA保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用。因此，中醫(yī)藥可以通過影響lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以輔助CHD的診斷和臨床療效評估。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，篩選出CHD患者外泌體中差異表達(dá)的lncRNA、circRNA和mRNA，構(gòu)建了lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析了差異表達(dá)mRNA的生物學(xué)功能和調(diào)控通路，為后期實(shí)驗研究提供數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)，也為確定CHD早期診斷標(biāo)志與中醫(yī)藥治療開辟了新的思路。