紅曲橙色素的發(fā)酵制備及其在紅曲紅色素化學(xué)半合成中的應(yīng)用

劉彩，陳莎，高夢(mèng)祥，李利

（長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

紅曲色素是紅曲菌（霉）發(fā)酵產(chǎn)生的一類聚酮化合物，作為一種天然食用色素可添加于肉制品、乳制品、糖果、糕點(diǎn)等多種食品中（GB2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》）。根據(jù)顏色和吸收光譜特征，紅曲色素可分為3大類：紅曲橙色素、黃色素和紅色素[1]。其中，紅曲橙色素中的紅斑紅曲素（rubropunctatin）和紅曲玉紅素（monascorubrin）的化學(xué)性質(zhì)比較活潑，在pH≥6的條件下，能與氨基酸等一級(jí)胺發(fā)生親氨基反應(yīng)（aminophilic reaction），通過(guò)形成希夫氏堿和脫水步驟，最終導(dǎo)致其吡喃環(huán)中的氧被氮替換，所生成的紅色衍生物屬于紅曲紅色素[2-5]。在目前報(bào)道的49種紅曲紅色素中，至少有27種被認(rèn)為是紅斑紅曲素和紅曲玉紅素發(fā)生親氨基反應(yīng)所產(chǎn)生的衍生物[6]。

研究表明，在紅曲色素發(fā)酵培養(yǎng)基中添加各種氨基酸[4，7-9]，或者分離純化得到紅斑紅曲素和紅曲玉紅素，再與氨基酸在體外進(jìn)行親氨基反應(yīng)[2，9-11]，均可產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的氨基酸衍生紅曲紅色素。與2種經(jīng)典紅曲紅色素——紅斑紅曲胺和紅曲玉紅胺相比，這些氨基酸衍生紅曲紅色素不僅具有水溶性好、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)[4，7-8]，還具有抗炎[11]、預(yù)防肥胖[12-14]、抑菌[15]、抗病毒[16]等多種生物活性，其應(yīng)用前景十分廣闊。

然而，在發(fā)酵過(guò)程中，所加入的氨基酸在作為紅曲色素衍生物的前體物的同時(shí)，也是重要的氮源物質(zhì)，對(duì)紅曲菌的生長(zhǎng)、以及紅曲色素和真菌毒素桔霉素等次生代謝產(chǎn)物的生物合成都有重要影響[17-18]。例如，添加色氨酸不利于紅曲菌的生長(zhǎng)，紅曲紅色素產(chǎn)量也很低；添加谷氨酸利于紅曲菌的生長(zhǎng)和紅曲紅色素的產(chǎn)生，但會(huì)引起毒素桔霉素的大量積累[17]。相比之下，氨基酸衍生紅曲紅色素的體外化學(xué)半合成，是一種更安全的生產(chǎn)方法，但是，由于化學(xué)半合成的前體物紅斑紅曲素和紅曲玉紅素的分離純化及制備，目前主要依靠制備型液相色譜[2]、硅膠柱層析[19]和薄層層析[14]等方法，載樣量小，效率低，嚴(yán)重制約了其規(guī)模化生產(chǎn)。在本課題組前期研究中，發(fā)現(xiàn)酸性條件可以誘導(dǎo)紅斑紅曲素和紅曲玉紅素的大量積累[20]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)低pH值條件下的兩步發(fā)酵過(guò)程，結(jié)合簡(jiǎn)單、高效的結(jié)晶分離步驟，獲得了高純度的紅斑紅曲素和紅曲玉紅素，并將其與氨基酸進(jìn)行了體外親氨基反應(yīng)，成功合成了氨基酸衍生紅曲紅色素。本研究結(jié)果可為優(yōu)質(zhì)、高活性的氨基酸衍生紅曲紅色素的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅色紅曲菌M7（Monascus ruberM7，CCAM070120）：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；葡萄糖、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、硝酸鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、蔗糖、甲酸、甲醇、無(wú)水乙醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）：美國(guó)天地有限公司；瓊脂、酵母膏（生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1900）：北京普析公司；離心機(jī)（Beckman Allegra X-30R）：德國(guó)貝克曼公司；高效液相色譜儀（LC1200）：美國(guó)安捷倫公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（TripleTOF 5600+）：美國(guó) AB Sciex公司；可調(diào)高速勻漿機(jī)（FSH-II）：江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；pH計(jì)（PB-10）：德國(guó)賽多利斯公司；恒溫?fù)u床（IS-RDS3）：美國(guó)精騏公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-250BZ）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；生物安全柜（HFsafe-1200）：上海力申科學(xué)儀器有限公司；高壓滅菌鍋（HVE-50）：日本株式會(huì)社平山制作所；光學(xué)顯微鏡（BM1000）：南京江南永新光學(xué)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHC-9073BS）：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲橙色素的發(fā)酵

紅曲橙色素的兩步發(fā)酵過(guò)程參照文獻(xiàn)[20]，具體如下：紅色紅曲菌M7接種于查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基（NaNO33.0 g/L、K2HPO41.0 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、蔗糖 30.0 g/L、酵母膏5.0 g/L，pH值自然），28℃培養(yǎng)10 d，加入無(wú)菌水，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，雙層擦鏡紙過(guò)濾除去菌絲，得到孢子液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整孢子濃度至105個(gè)/mL。在發(fā)酵的第一步，按1%的接種量將紅曲菌孢子液（105個(gè)/mL）接種于100 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL，pH值自然），28℃，200r/min恒溫振蕩條件培養(yǎng)40 h，讓菌絲體充分生長(zhǎng)但不合成色素；在發(fā)酵的第二步，向培養(yǎng)40 h的發(fā)酵液中加入100 mL無(wú)菌的0.2 mol/L，pH 3.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，使培養(yǎng)基維持較低的pH值，28℃，200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)5 d，以誘導(dǎo)紅曲橙色素的大量合成。

1.3.2 紅曲橙色素的制備

發(fā)酵完畢后，10 000 r/min離心10 min，棄上清，加入與發(fā)酵液體積相等的70%的乙醇溶液（用無(wú)水乙醇和pH 2的酸水配制），10 000 r/min高速勻漿1 min，置4℃浸提12 h，10 000 r/min再次離心10 min，取上清即為紅曲色素提取液。用70%的酸性乙醇溶液調(diào)整提取液的色價(jià)至（45.0±1.0）U/mL，加入0.5或1.0倍體積的酸水（用甲酸調(diào)至pH 2）降低乙醇濃度使紅曲橙色素達(dá)到過(guò)飽和，置-20℃靜置2 h使紅曲橙色素結(jié)晶析出，10 000 r/min離心10 min，收集紅曲橙色素晶體。轉(zhuǎn)移橙色素晶體到培養(yǎng)皿中，40℃烘干至恒重。

1.3.3 紅曲橙色素與氨基酸的體外親氨基反應(yīng)

用甲醇（含0.1%甲酸）配制1 mg/mL紅曲橙色素溶液，用200 mmol/L，pH 7.0的磷酸緩沖液配制16 mmol/L的氨基酸溶液。由于紅曲橙色素水溶性差，親氨基反應(yīng)在50%甲醇的溶液中進(jìn)行，即每10 mL反應(yīng)體系含上述氨基酸溶液5mL，紅曲橙色素溶液1 mL，甲醇4 mL。在30℃，250 r/min搖床中孵育2 h后，用C18固相萃取柱進(jìn)行凈化，90%甲醇洗脫即得到氨基酸衍生紅曲紅色素。

1.3.4 紫外-可見(jiàn)光譜分析

將色素溶液稀釋一定倍數(shù)后，使其在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值為（1.0±0.1）左右，于300 nm～600 nm范圍內(nèi)以1 nm間隔進(jìn)行掃描，繪制光譜圖。紅曲橙色素和紅色素的色價(jià)分別以470 nm和500 nm的吸光值計(jì)算。色價(jià)/（U/mL）=吸光值A(chǔ)×稀釋倍數(shù)；橙色素產(chǎn)量/（U/L）=［色價(jià)（U/mL）×色素提取液體積（mL）］/發(fā)酵培養(yǎng)基體積（mL）×1 000。

1.3.5 高效液相色譜分析

紅曲色素的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析條件如下。

色譜柱：Inertsil ODS-3（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 °C；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm～600nm，其中紅曲黃色素、橙色素和紅色素組分的監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)分別為380、470、520 nm，桔霉素的監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為330 nm。分析紅曲橙色素時(shí)，流動(dòng)相A相為乙腈，B相為酸水（pH 3，甲酸調(diào)節(jié)），C 相為純水，流速：0.8 mL/min；分析紅色素時(shí)，流動(dòng)相A相為乙腈（含0.1%甲酸），B相為酸水（含0.1%甲酸），梯度洗脫條件：0～18 min，15%A～80%A；18 min～30 min，80%A；30min～31min，80%A～15%A；31min～35min，15%A，流速：1.0 mL/min；分析桔霉素時(shí)，流動(dòng)相A相為乙腈，B相為酸水（pH 3，甲酸調(diào)節(jié)），等度洗脫，A∶B=65∶35（體積比），流速：1.0 mL/min。紅曲橙色素的HPLC梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 紅曲橙色素的HPLC梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of HPLC for orange Monascus pigments

1.3.6 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析

紅曲色素的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）分析條件如下。

色譜柱：Kinetex 2.6 μm F5（100 mm × 2.1 mm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A相為酸水（含0.1%甲酸），B相為乙腈；梯度洗脫條件：0～1 min，95%A；1 min～8 min，95%A～15%A；8 min～9 min，15%A；9 min～9.1 min，15%A～95%A；9.1min～11min，95%A；流速：0.2mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；DAD 檢測(cè)波長(zhǎng)：190 nm～700 nm；離子源：電噴霧電離，正離子模式；掃描范圍：m/z 100～1 000；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550℃；霧化氣壓力379 kPa；輔助氣壓力379 kPa；氣簾氣壓力172 kPa。根據(jù)質(zhì)譜檢測(cè)到的準(zhǔn)分子離子[M+H]+峰確定各紅曲色素組分的分子量，并與目前報(bào)道的100多種紅曲色素[7]的分子量進(jìn)行比對(duì)，以進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲橙色素的液態(tài)發(fā)酵

紅曲色素乙醇提取液的紫外-可見(jiàn)光譜圖見(jiàn)圖1。

采用pH 3條件下的兩步發(fā)酵法，所獲得的紅曲色素提取液在300 nm～600 nm范圍內(nèi)僅有1個(gè)吸收峰，為472 nm。由于紅曲黃色素、橙色素和紅色素的最大吸收波長(zhǎng)通常分別分布于330 nm～450 nm、460 nm～480 nm和490 nm～530 nm[1]，圖1所示的光譜特征表明酸性條件下生成的紅曲色素以橙色素為主，而紅色素和黃色素均較少，與Li等[20]的報(bào)道一致。同時(shí)，該發(fā)酵條件不僅適合紅曲菌的生長(zhǎng)，而且利于紅曲橙色素的合成，生物量（干重）達(dá)（5.7±0.5）g/L，橙色素產(chǎn)量達(dá)（7.9±0.2）×104U/L。

圖1 紅曲色素乙醇提取液的紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig.1 The ultraviolet-visible spectrum of the ethanolic extract of Monascus pigments

2.2 紅曲橙色素的結(jié)晶分離

由于紅曲橙色素的水溶性較差，向橙色素提取液（含70%乙醇）中加入水，降低乙醇濃度，可以使橙色素達(dá)到過(guò)飽和而結(jié)晶析出。紅曲橙色素晶體的HPLC分析見(jiàn)圖2。

圖2 紅曲橙色素晶體的HPLC分析Fig.2 The HPLC analysis of the crystallized orange Monascus pigments

由圖2A和2B可知，當(dāng)加入1.0倍和0.5倍體積的水時(shí)，所獲得的色素晶體均檢出2個(gè)主要組分O1和O2。根據(jù)二極管陣列檢測(cè)器監(jiān)測(cè)到的光譜圖（圖2C），O1和O2均在470 nm處有最大吸收峰，符合典型的紅曲橙色素組分的光譜特征。其中，當(dāng)加入1.0倍體積的水進(jìn)行結(jié)晶分離時(shí)，每升發(fā)酵培養(yǎng)基可獲得（0.89±0.05）g色素晶體，HPLC檢測(cè)顯示該色素晶體除了2個(gè)主要成分O1和O2外，還有少量雜質(zhì)（圖2A，峰1～峰4）；當(dāng)加入0.5倍體積的水進(jìn)行結(jié)晶分離時(shí)，每升發(fā)酵培養(yǎng)基獲得的色素晶體約減少了29%，為（0.63±0.04）g，但橙色素晶體純度明顯提高，未檢出明顯雜質(zhì)（圖2B）。因此，為了獲得高純度的橙色素，減少結(jié)晶分離時(shí)加入水的比例是一個(gè)有效手段。此外，2種橙色素晶體中均未檢出真菌毒素桔霉素，可避免發(fā)酵時(shí)添加某些氨基酸導(dǎo)致的桔霉素積累而引起的安全隱患。紅曲橙色素組分O1和O2的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 紅曲橙色素組分O1和O2的質(zhì)譜圖Fig.3 The mass spectra of orange Monascus pigment compound O1 and O2

進(jìn)一步通過(guò)LC-MS對(duì)主要組分O1和O2進(jìn)行了定性分析，結(jié)果顯示其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+分別為m/z 355.154 1和m/z 388.184 8，分別與橙色素中的紅斑紅曲素和紅曲玉紅素的分子量相符。

2.3 紅曲橙色素與氨基酸的體外親氨基反應(yīng)

親氨基反應(yīng)溶液的紫外-可見(jiàn)光譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 親氨基反應(yīng)溶液的紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig.4 The ultraviolet-visible spectrum of the aminophilic reaction solution

以不利于紅曲菌生長(zhǎng)和紅色素產(chǎn)生的色氨酸[18]，以及利于紅曲菌生長(zhǎng)和紅色素產(chǎn)生、但導(dǎo)致真菌毒素桔霉素大量積累的谷氨酸[18]為前體物，與2.2制備的橙色素進(jìn)行了體外親氨基反應(yīng)，反應(yīng)后的色素為鮮亮的紅色，在300 nm～600 nm范圍有兩個(gè)吸收峰，分別在410 nm和500 nm附近。HPLC分析表明，色氨酸和谷氨酸與橙色素發(fā)生反應(yīng)后的紅色素均含有2個(gè)主要組分，分別為 Trp-R1、Trp-R2 和 Glu-R1、Glu-R2，且該4種組分在520 nm附近有吸收峰，符合典型的紅曲紅色素組分的光譜特征（見(jiàn)圖5）。

圖5 氨基酸衍生紅曲紅色素的HPLC分析Fig.5 The HPLC analysis of amino acid-derived red Monascus pigments

根據(jù)紅斑紅曲素和紅曲玉紅素與一級(jí)胺的親氨基反應(yīng)原理，推測(cè)了其與色氨酸和谷氨酸反應(yīng)后產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 色氨酸和谷氨酸衍生紅曲紅色素的結(jié)構(gòu)Fig.6 The chemical structures of Trp-and Glu-derived red Monascus pigments

LC-MS顯示，Trp-R1和Glu-R1分子量分別同紅斑紅曲素與色氨酸和谷氨酸的反應(yīng)產(chǎn)物相符，Trp-R2和Glu-R2分子量分別同紅曲玉紅素與色氨酸和谷氨酸的反應(yīng)產(chǎn)物相符，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 紅曲色素組分Glu-R1，Glu-R2，Trp-R1和Trp-R2的質(zhì)譜圖Fig.7 The mass spectra of pigment component Glu-R1，Glu-R2，Trp-R1 and Trp-R2

結(jié)果表明該體外反應(yīng)成功地合成了特定結(jié)構(gòu)的紅曲紅色素。在相同的條件下，1.0 mg紅曲橙色素在10 mL反應(yīng)體系中，與色氨酸和谷氨酸反應(yīng)后生成的紅色素色價(jià)無(wú)顯著差異，分別為（4.0±0.1）U/mL和（3.8±0.1）U/mL，表明體外半合成反應(yīng)可克服發(fā)酵時(shí)某些氨基酸作為不良氮源引起的發(fā)酵效率低下問(wèn)題。

3 結(jié)論

低pH值條件下的兩步發(fā)酵法，不僅利于紅曲菌的生長(zhǎng)，而且能高效率地積累以紅斑紅曲素和紅曲玉紅素為主要成分的紅曲橙色素，產(chǎn)量達(dá)（7.9±0.2）×104U/L。利用橙色素水溶性差的特點(diǎn)，向提取液中加入水，降低乙醇濃度，可使橙色素結(jié)晶析出，且調(diào)節(jié)水加入的比例，可在保證較高得率的同時(shí)，提高橙色素純度。本研究通過(guò)向70%的乙醇提取液中加入0.5倍體積的水進(jìn)行橙色素結(jié)晶分離，每升發(fā)酵培養(yǎng)基可獲得（0.63±0.04）g高純度橙色素晶體，未檢出桔霉素，安全性高。利用所制備的高純度橙色素，與色氨酸和谷氨酸在體外進(jìn)行了親氨基反應(yīng)，成功獲得了色氨酸和谷氨酸衍生紅曲紅色素，且橙色素向2種衍生紅曲紅色素的轉(zhuǎn)化率無(wú)顯著差異，1.0 mg紅曲橙色素在10 mL反應(yīng)體系中，生成的紅色素色價(jià)分別為（4.0±0.1）U/mL和（3.8±0.1）U/mL。該紅曲橙色素的發(fā)酵制備及體外半合成紅曲紅色素的方法，既可克服發(fā)酵時(shí)某些氨基酸引起的桔霉素積累問(wèn)題，也可解決某些氨基酸作為不良氮源導(dǎo)致的發(fā)酵效率低下問(wèn)題，具有很好的工業(yè)推廣價(jià)值。