人Carabin基因過表達(dá)的9型重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建及功能鑒定

周殿儒，程闊菊，吳 慶，馮勝紅，羅健華，黃 河，羅 云

(1.四川省達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，四川 達(dá)州 635000 2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，重慶 400037)

carabin是Pan等研究學(xué)者于2007年發(fā)現(xiàn)的一個新的鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin,CaN))結(jié)合蛋白，主要表達(dá)于免疫細(xì)胞T和B細(xì)胞中，因同時可與calcineurin和Ras相互結(jié)合及作用，將其命名為carabin[1]。Pan等學(xué)者[1]的研究表明，carabin與CaN結(jié)合后可負(fù)反饋抑制CaN-NFAT通路，與Ras結(jié)合可特異性抑制Ras-ERK1/2通路。在人體免疫細(xì)胞T和B細(xì)胞活化過程中通過負(fù)反饋抑制CaN-NFAT通路和抑制Ras-ERK1/2通路阻斷免疫細(xì)胞的持續(xù)活化，進(jìn)而阻斷免疫細(xì)胞持續(xù)活化而導(dǎo)致的過渡免疫，在機(jī)體免疫平衡中發(fā)揮著非常重要的作用[2～4]。進(jìn)一步通過蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，carabin在人心肌細(xì)胞中亦有表達(dá)，并在小鼠心肌細(xì)胞中得到驗(yàn)證。通過小鼠carabin基因敲除證實(shí)，carabin蛋白可抑制小鼠冠狀動脈左前降支部分結(jié)扎誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大[5]，并提出carabin有望成為臨床在心衰方面診治心肌肥厚的新靶點(diǎn)[6]。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，carabin在缺血/缺氧誘導(dǎo)的人心室肌細(xì)胞株AC16及小鼠梗死心臟中表達(dá)均顯著降低[7]，提示carabin可能會在心肌梗死方面起到一定作用，但目前尚無相關(guān)研究。鑒于此，本研究擬采用選擇性噬心臟9型重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus type 9,rAAV9)，構(gòu)建人carabin的9型重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV9-carabin-IRES- ZsGreen)，通過感染人心室肌細(xì)胞株AC16，驗(yàn)證carabin蛋白過表達(dá)效果。為carabin蛋白在心肌梗死中的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1細(xì)胞株及質(zhì)粒:293 AAV 細(xì)胞株及腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒(深圳百恩維生物科技有限公司)，pUC57- carabin質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室提供。人心室肌AC16細(xì)胞株來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫( American type culture collection，ATCC)。

1.1.2主要試劑及儀器:DNA引物合成及測序(美國，invitrogen公司)，限制性內(nèi)切酶EcoRI(NEB,#R0101M)、XhoI(NEB,#R0146M)，T4 DNA Ligase(NEB,M0202L)，胎牛血清FBS(invitrogen,C2027050)，高效轉(zhuǎn)染試劑盒HET kit(深圳百恩維生物科技有限公司，BW11002)，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad,SYSTEM GelDoc XR+ IM)。

1.2方 法

1.2.1pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen載體構(gòu)建:將質(zhì)粒pUC57-carabin和pAAV9-IRES-ZsGreen在37℃水浴中進(jìn)行EcoRI+XhoI雙酶切。pAAV9-IRES-ZsGreen所得酶切大片段和pUC57-carabin質(zhì)粒所得酶切目的基因在37℃T4DNA連接酶的作用下連接，所得連接產(chǎn)物在42℃水浴中化學(xué)轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中，取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂抹于含Amp+藥液的LB平板上37℃培養(yǎng)過夜，次日于陽性平板上挑選單克隆菌落，接種于含Amp+藥液的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，提取JM109質(zhì)粒、EcoRI和XhoI雙酶切、DNA凝膠電泳鑒定目的基因陽性后，送invitrogen公司測序驗(yàn)證。

1.2.2rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen腺相關(guān)病毒的包裝、擴(kuò)增及滴度測定:用高效轉(zhuǎn)染試劑盒(HET Kit)將攜帶目的carabin基因的重組質(zhì)粒pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen導(dǎo)入293AAV細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，導(dǎo)入4-6h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，48h后收集上清液，剩余細(xì)胞于-80℃和37℃環(huán)境下反復(fù)凍融三次，高速離心后收集上清液，與之前上清液合并即為病毒原液。利用病毒原液感染293AAV細(xì)胞行連續(xù)三代病毒擴(kuò)增，合并病毒液、純化、濃縮。取20μL濃縮病毒液，提取病毒DNA，行Q-PCR檢測病毒滴度。

1.2.3rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen功能鑒定:取AC16細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞融合至80-90%時加入1×105vg病毒液，孵育6-8h后更換培養(yǎng)液，48h后收集細(xì)胞提取蛋白，Western blot 檢測carabin蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen載體的構(gòu)建:DNAMAN分析pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen質(zhì)粒的中carabin基因序列與NCBI中提供的carabin序列一致(見圖1)，表明pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen載體構(gòu)建成功。

圖1 carabin基因的部分序列

2.2rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen包裝、收毒、擴(kuò)增及滴度測定:將制備的重組質(zhì)粒pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen轉(zhuǎn)染293AAV細(xì)胞后，換液48h后進(jìn)行收毒。取病毒濃縮液提取病毒DNA，行Q-PCR檢測病毒滴度，rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen滴度為：5.09E+12 vg/mL。(見圖2、3)。

圖2 pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen轉(zhuǎn)染293 AAV細(xì)胞后48h(換液后)綠色熒光(左)與白光(右)對照圖(×100)

圖3 rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen Q-PCR滴度檢測A：標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線；B：rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen擴(kuò)增曲線；C：標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen 功能鑒定:將構(gòu)建成功的rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen 感染人心室肌細(xì)胞株AC16，72h后提取總蛋白，western blot驗(yàn)證carabin過表達(dá)成功，結(jié)果見圖4、5。

圖4 rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen轉(zhuǎn)染AC16細(xì)胞后72h(換液后)綠色熒光(左)與白光(右)對照圖

圖5 rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen 在人心室肌細(xì)胞株AC16內(nèi)的過表達(dá)效應(yīng)(+s,n=9)注：與正常組相比較，*P<0.05

3 討 論

carabin是Pan等研究學(xué)者[1]于2007年新發(fā)現(xiàn)的一個鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin,CaN)結(jié)合蛋白，因同時可與calcineurin和Ras結(jié)合將其命名為carabin。經(jīng)結(jié)合結(jié)構(gòu)域鑒定，carabin蛋白CaN結(jié)合域位于羧基端，Ras結(jié)合域位于氨基端。CaN結(jié)合域的最小結(jié)合域?yàn)轸然┒?aa406-446)的41個氨基酸殘基；Ras結(jié)合域的最小結(jié)合域?yàn)榘被宋炊?aa89-294)的206個氨基酸殘疾[1]。離體和在體實(shí)驗(yàn)的結(jié)合域功能鑒定表明：①CaN 結(jié)合域 ：carabin的核酸轉(zhuǎn)錄依賴于CaN- NFAT信號通路的活化，而后生成的carabin蛋白又通過其自身的CaN結(jié)合域結(jié)合CaN，反過來抑制CaN-NFAT信號通路，因此carabin是CaN-NFAT信號通路的負(fù)反饋抑制蛋白；②Ras結(jié)合域：carabin的氨基端具有Ras GAP活性，能特異性抑制Ras-ERK1/2信號通路。研究顯示，在人體免疫細(xì)胞T和B細(xì)胞中，carabin 通過反負(fù)饋抑制CaN-NFAT信號通路和抑制Ras-ERK1/2信號通路阻斷T細(xì)胞及B細(xì)胞的持續(xù)活化，從而避免免疫持續(xù)活化后對機(jī)體的傷害，以維持機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)[1～4]。經(jīng)蛋白質(zhì)譜鑒定，carabin在人、小鼠及大鼠心肌細(xì)胞中也有表達(dá)。并有研究顯示，在小鼠心臟中，carabin可通過CaN-NFAT、Ras-ERK1/2及Ras- CaMKII信號通路抑制由冠狀動脈左前降支部分結(jié)扎誘導(dǎo)的心肌肥大[5]。因此，在此基礎(chǔ)上有學(xué)者提出carabin有望在心衰領(lǐng)域成為診治心肌肥厚的新靶點(diǎn)[6]。

我們的早期研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌梗死動物模型中，carabin的mRNA和蛋白表達(dá)水平在術(shù)后第7天及14天的心臟梗死區(qū)域均顯著下調(diào)(約7倍)；同時在缺血/缺氧誘導(dǎo)的人心室細(xì)胞株AC16中發(fā)現(xiàn)，carabin的mRNA和蛋白表達(dá)水平亦顯著下調(diào)[7]。因此我們設(shè)想carabin可能會在心肌梗死中起到一定的作用，但目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。 如前所述，carabin是一個新發(fā)現(xiàn)的蛋白，目前尚無特異性激動劑。鑒于此，本研究利用了對心肌細(xì)胞具有特異性選擇的腺相關(guān)病毒rAAV9載體，插入人carabin基因，以此達(dá)到能選擇性在心肌細(xì)胞中過表達(dá)carabin蛋白的作用，為進(jìn)一步研究carabin在心臟中的作用奠定研究基礎(chǔ)。

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展推動著分子醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，各種基因過表達(dá)及干擾手段不斷成熟及簡化。當(dāng)前，用于基因干預(yù)的方法主要有質(zhì)粒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及腺相關(guān)病毒導(dǎo)入。腺相關(guān)病毒是近幾年發(fā)展起來的新型基因?qū)胼d體，具有對所有哺乳類細(xì)胞感染的能力，并能在體內(nèi)長期存在具有表達(dá)能力，且沒有致病性，同時根據(jù)不同分型對不同細(xì)胞具有選擇性[8]。根據(jù)其病毒衣殼的不同共有10余種血清型，每種血清型對不同的組織及細(xì)胞具有不同的親和性，其中rAAV9對心臟具有高度親和性，因此具有選擇性感染心臟組織的能力[9,10]。因此，將目的基因構(gòu)建進(jìn)rAAV9病毒中，則可實(shí)現(xiàn)對心臟組織特異性過表達(dá)的目的，為后期在體實(shí)驗(yàn)研究carabin信號通路在心肌細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)。

在rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen構(gòu)建過程中，我們首先將人carabin基因定向克隆至pAAV9-IRES-ZsGreen載體形成pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen重組質(zhì)粒 ，經(jīng)測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)染293 AAV 細(xì)胞，所合成病毒原液經(jīng)反復(fù)擴(kuò)增收毒、純化及濃縮后測定病毒滴度，感染人心室肌細(xì)胞株AC16行rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen功能鑒定，western blot驗(yàn)證carabin過表達(dá)成功，說明rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen構(gòu)建成功。rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen的成功構(gòu)建為后期carabin在心肌梗死及缺血中的作用機(jī)制研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。