蒔蘿蒿精油成分分析及抑菌活性機理探究

霍歸國，梁婷玉，黃志蕓，白增福，陳學(xué)林*，張 繼,3

(1 西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070;2 甘肅省特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070;3 西北師范大學(xué)，新農(nóng)村發(fā)展研究院，蘭州 730070)

蒔蘿蒿(ArtemisiaanethoidesMattf.)為菊科蒿屬植物，又名小堿蒿，一或二年生草本，植株具有濃烈香氣，花果期為6～10月，產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西、寧夏、甘肅、青海、新疆、山東(北部)、河南(北部)和四川(北部)等地。其通常生長在干山坡、河湖邊沙地、荒地、路旁等，鹽堿地附近尤多，在草原、半荒漠草原與森林草原附近也有所分布，在低濕、鹽漬化的局部地區(qū)可成為區(qū)域性植物群落的優(yōu)勢種或次優(yōu)勢種，常侵入到旱田里，成為田間有害雜草之一[1]。有研究表明，蒔蘿蒿與茵陳蒿均具有較強的利膽作用，且蒔蘿蒿毒性小，藥效持久，民間常采其基生葉作為中藥“茵陳”的代用品，有一定的藥用價值[2]。

隨著人們對食品安全的關(guān)注和環(huán)保意識的增強，許多天然植物的活性成分被提取出來并應(yīng)用于抑菌和保鮮等諸多方面，植物精油就是一種十分良好的天然活性物質(zhì)。近年來，有研究表明，多種蒿屬植物精油均具有良好的抑菌作用[3-7]。時至今日，關(guān)于蒔蘿蒿精油的報道并不是很多，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，蒔蘿蒿精油對倉儲害蟲顯示出良好的驅(qū)蟲活性[8]，但目前還沒有對于其抑菌活性等方面的研究。因此，本研究對蒔蘿蒿精油的成分進行分析，并對其抑菌活性和抑菌機理進行初步探究，旨在為蒔蘿蒿精油的進一步開發(fā)利用提供參考和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀 器

DRT-TW型調(diào)熱電熱套、JY2002型電子天平，(力辰科技公司)；Thermo PolarisQ GC-MS(美國)；YXQ-SG46-280S高壓滅菌鍋，(北京中西公司)；恒溫?fù)u床，(上海天呈公司)；干燥箱，(廈門海達精密儀器有限公司)；紫外可見光分度計，(北京萊伯泰科儀器有限公司)；酶標(biāo)儀，(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；電導(dǎo)率儀，(上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料試劑

蒔蘿蒿采自甘肅省隴南市禮縣，經(jīng)西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳學(xué)林教授鑒定為菊科蒿屬植物蒔蘿蒿。酵母提取物、蛋白胨、瓊脂(北京索萊寶科技有限公司)；無水硫酸鈉、無水乙醇、氯化鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等購自中華試劑網(wǎng)。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,CMCC 26003)和大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC 25922)由西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供，在液體培養(yǎng)基37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，接種在LB瓊脂培養(yǎng)基中4 ℃保存。

1.3 方 法

1.3.1 精油提取取蒔蘿蒿地上部分去除灰土并粉碎過篩，稱取50 g放入圓底燒瓶中，加入1 000 mL蒸餾水，浸泡5 h，水蒸氣蒸餾6 h，獲得揮發(fā)油后加入適量無水硫酸鈉除去其中水分，冷藏備用。

1.3.2 GC-MS分析條件采用石英毛細(xì)管柱HP-5MS，30 m × 0.25 mm，膜厚0.25 μm；載氣：He；柱流量：1 mL/min；EI 源；電離電壓：70 eV；離子源溫度：250 ℃；掃描范圍：50～650 amu；進樣量：1 μL；分流比為10∶1。以40 ℃為初始溫度，保留1 min，然后以3 ℃/min升溫至200 ℃，保留5 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保留1 min。

1.3.3 抑菌圈直徑采用濾紙擴散法測定蒔蘿蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑。蒔蘿蒿精油用0.22 μm的有機相微孔濾膜過濾，將100 μL培養(yǎng)過夜的菌懸液(1×107CFU/mL)涂布在瓊脂平板上，取3個直徑為6 mm無菌濾紙片放置在涂布完畢的瓊脂平板上，其中2張濾紙片上滴加10 μL蒔蘿蒿精油，另1張濾紙片滴加等量的無菌水作為空白對照，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測定其抑菌圈直徑[9-10]，每組試驗進行3次重復(fù)。

1.3.4 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC) 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定采用二倍稀釋法，參照SAYED和CHIKEZIE等[11-12]方法。取搖菌管6個，分別標(biāo)號為1～6號，1號加入600 μL蒔蘿蒿精油和120 μL吐溫80，最后加入280 μL培養(yǎng)液，2～6號均加入500 μL培養(yǎng)液。從1號管中吸取500 μL加入2號管，再從2號管中吸取500 μL加入3號管，依次逐級稀釋，每次吸取前用振蕩器混勻。分別吸取20 μL稀釋好的蒔蘿蒿精油加入微孔板中，并在每個微孔板中加入170 μL培養(yǎng)液和10 μL菌懸液，最終使微孔板中的精油分別達到60、30、15、7.5、3.75和1.625 μL/mL等一系列濃度梯度。將僅加入10 μL菌懸液和190 μL培養(yǎng)液的微孔作為陽性對照，僅加入12 μL吐溫80和188 μL培養(yǎng)液的微孔作為陰性對照。將96孔板放入培養(yǎng)箱中在37 ℃下培養(yǎng)24 h，無明顯可見細(xì)菌生長的最小精油濃度為最小抑菌濃度，涂布后完全不長菌的最小精油濃度為最小殺菌濃度[13]，每組試驗進行3次重復(fù)。

1.3.5 抑菌時間曲線生長曲線的測定依據(jù)Zeng等[14]方法。首先將精油與吐溫80混勻并加入一定量的培養(yǎng)液，使最終濃度分別為0.5 MIC(最小抑菌濃度)、1 MIC和2 MIC，并將對數(shù)生長期的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌稀釋至1×107CFU/mL，之后取20 μL不同濃度的精油和10 μL菌懸液分別加入96孔板中，最后在每個微孔中加入170 μL培養(yǎng)液，只加菌懸液和培養(yǎng)液的一組作為對照。在37 ℃和120 r/min條件下培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8、10和12 h時測定其在600 nm處的吸光度，每組試驗進行3次重復(fù)。

1.3.6 電導(dǎo)率經(jīng)不同濃度精油處理后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的測定依據(jù)Kong等[15]方法。在37 ℃下，將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，之后以4 000 r/min離心10 min。將5%的葡萄糖溶液在沸水中加熱5 min后的電導(dǎo)率記為L0，不同濃度精油 [0、MIC(最小抑菌濃度)、MBC(最小殺菌濃度)] 加入到5%的葡萄糖溶液中電導(dǎo)率記為L1，將細(xì)胞用5%的葡萄糖溶液洗3次，使其電導(dǎo)率與5%的葡萄糖溶液相近，再加入不同濃度的精油(0、MIC、MBC)完全混勻后在37 ℃下培養(yǎng)24 h，電導(dǎo)率記為L2。相對電導(dǎo)率的計算公式為：相對電導(dǎo)率(%)=(L2-L1)/L0×100，每組試驗進行3次重復(fù)。

1.3.7 掃描電鏡制備金黃色葡萄球菌的菌懸液，濃度約為1×107CFU/mL，分別用0、MIC、MBC濃度的精油37 ℃下處理4 h，之后在4 ℃下以4 000 r/min離心10 min，所得細(xì)胞用PBS洗滌3次，4 ℃下用2.5%戊二醛固定6 h。再次用PBS洗滌3次后用乙醇(30%、50%、70%、80%、90%和100%)梯度脫水15 min，進行噴金處理，在掃描電鏡下觀察[16]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計和繪圖采用Excel 2019和Origin 2019，通過SPSS 13.0進行顯著性分析。多重比較采用Duncan法，以P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒔蘿蒿精油得率及成分

經(jīng)水蒸氣蒸餾所提取的蒔蘿蒿精油顏色為淡黃色，具有濃烈香氣，得率為0.011 2 g/100 g。經(jīng)GC-MS測定后，蒔蘿蒿精油的總離子流圖和化學(xué)成分分別如圖1和表1所示。其中，含量在0.5%以上的化合物共有34種，占總含量的81.09%，主要包括醇類(47.12%)和萜烯類(19.90%)，以及少量酮類(5.04%)和酯類(1.12%)等。在所有成分中，桉油精(12.39%)含量最高，其次為松油醇(8.70%)和匙葉桉油烯醇(7.76%)等。Liang等[8]和張世堯等[17]均有研究表明，蒔蘿蒿精油的主要化學(xué)成分為桉油精，與本研究結(jié)果相一致。此外，兩項研究發(fā)現(xiàn)，蒔蘿蒿精油中含量較高的成分還有松油醇、松香芹酮、松香芹醇以及石竹烯等，這也與本試驗結(jié)果相類似。然而，各成分的含量有所差異，這可能與不同采樣地的氣候以及海拔等地理環(huán)境因素有關(guān)。該研究中的樣品采于甘肅隴南地區(qū)，而其余兩項研究中的樣品分別采自甘肅甘南和山東菏澤地區(qū)。

表1 蒔蘿蒿精油的化學(xué)成分

圖1 蒔蘿蒿精油總離子圖Fig.1 Total ion figure of Artemisia anethoides Mattf. essential oil

2.2 抑菌活性

2.2.1 抑菌圈精油的抑菌圈直徑可反映細(xì)菌對精油的敏感程度，通常按照如下劃分：抑菌圈直徑小于8 mm，為不敏感；抑菌圈直徑8～14 mm，為中度敏感；抑菌圈直徑14～20 mm，為敏感；抑菌圈直徑大于20 mm，為高度敏感[18]。蒔蘿蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果見圖2和表2。在圖2中，A和B分別為蒔蘿蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈。結(jié)果表明，蒔蘿蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為(15.36±0.71) mm和(22.57±1.68) mm，大腸桿菌對蒔蘿蒿精油敏感，金黃色葡萄球菌對蒔蘿蒿精油高度敏感。

A． 精油對大腸桿菌的抑菌圈；B.精油對金黃色葡萄球菌的抑菌圈

表2 蒔蘿蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

2.2.2 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC) 蒔蘿蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)如表3所示。蒔蘿蒿精油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC分別為3.25和7.5 μL/mL，MBC分別為7.5和15 μL/mL，對兩種菌均顯示出了良好的抑菌活性，而對照組沒有表現(xiàn)出任何的抑菌效果。

表3 蒔蘿蒿精油的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

2.2.3 生長時間曲線為了更進一步研究蒔蘿蒿精油的抑菌活性，在該項研究中繪制了蒔蘿蒿精油的抑菌時間曲線。在圖3中，A和B分別為蒔蘿蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌曲線。結(jié)果顯示，隨著時間的延長，經(jīng)蒔蘿蒿精油處理后的兩種菌的吸光度值均小于對照組。對于大腸桿菌，當(dāng)蒔蘿蒿精油濃度為0.5 MIC(3.25 μL/mL)時，其對大腸桿菌的抑制作用不明顯，只是能夠延緩大腸桿菌的生長，當(dāng)蒔蘿蒿精油濃度為1 MIC(7.5 μL/mL)和2 MIC(15 μL/mL)時，其能夠完全抑制大腸桿菌的生長。對于金黃色葡萄球菌，當(dāng)蒔蘿蒿精油濃度為0.5 MIC(1.625 μL/mL)時，其對金黃色葡萄球菌的生長具有較強的抑制作用，能夠延緩金黃色葡萄球菌的生長，當(dāng)蒔蘿蒿精油濃度為1 MIC(3.25 μL/mL)和2 MIC(7.5 μL/mL)時，其可以完全抑制金黃色葡萄球菌的生長。該研究結(jié)果表明蒔蘿蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑制作用，且抑制效果隨著劑量的增加而加強。

A．精油對大腸桿菌的抑菌曲線；B.精油對金黃色葡萄球菌的抑菌曲線

2.3 抑菌機制

2.3.1 電導(dǎo)率細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜是細(xì)菌的通透性屏障，對調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鈉、鉀、鈣等離子的濃度，調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝、物質(zhì)運輸以及維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定均起著至關(guān)重要的作用[16]。本研究用不同濃度的蒔蘿蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行處理后，測定了其相對電導(dǎo)率，結(jié)果如圖4所示。經(jīng)不同濃度蒔蘿蒿精油處理后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的相對電導(dǎo)率均顯著高于對照組，且相對電導(dǎo)率隨著精油濃度的增加而增大。有研究表明，肉桂精油能夠使大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量的電解質(zhì)外泄，致使細(xì)胞死亡[19]。此外，茴香籽油也能夠使痢疾桿菌的電解質(zhì)發(fā)生泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。因此，在該研究中，蒔蘿蒿精油也很有可能改變了兩種菌細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致大量電解質(zhì)外泄，從而表現(xiàn)出抑菌的效果。

不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著(n=3)

2.3.2 掃描電鏡為了更直觀地展示蒔蘿蒿精油對細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷，以金黃色葡萄球菌為研究對象，經(jīng)不同濃度蒔蘿蒿精油處理之后進行掃描電鏡觀察，結(jié)果如圖5所示。圖5，A顯示，空白組金黃色葡萄球菌呈球形，其表面光滑，形態(tài)較為規(guī)整，無明顯凹陷和破碎；圖5，B為經(jīng)MIC濃度的精油處理之后的金黃色葡萄球菌，可以觀察到部分細(xì)胞發(fā)生了萎縮凹陷；圖5，C為經(jīng)MBC濃度的精油處理之后的金黃色葡萄球菌，部分細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了較為嚴(yán)重的畸變，表面變得崎嶇且不規(guī)則，并有內(nèi)溶物的泄漏。該研究結(jié)果表明，蒔蘿蒿精油作用于金黃色葡萄球菌，會導(dǎo)致其細(xì)胞膜發(fā)生畸變和損傷破裂，并伴有內(nèi)溶物的泄漏。因此，蒔蘿蒿精油的抑菌作用模式可能與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變直接相關(guān)，最終導(dǎo)致了細(xì)胞活力的喪失。

A.處理4 h后的空白組；B.處理4 h后的MIC組；C.處理4 h后的MBC組

3 討 論

近年來，有關(guān)蒿屬植物精油抑菌活性和抗氧化等方面的研究逐漸火熱起來[20-22]。蒔蘿蒿作為一種天然的野生植物，精油中富含醇類、萜烯類和酮類等多種活性物質(zhì)，其中桉油精、松油醇和匙葉桉油烯醇等物質(zhì)含量較高。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，桉油精具有催眠鎮(zhèn)靜和治療精神紊亂的作用[23]，此外，其在驅(qū)蟲方面也表現(xiàn)出了良好的效果[8,24-25]，松油醇在抑郁癥治療等方面具有顯著的效果[26]，而匙葉桉油烯醇有一定的鎮(zhèn)痛作用[27]。由此可以看出，蒔蘿蒿精油中的桉油精和松油醇等多種成分均顯示出了十分良好的生物活性。

截止目前，還沒有對蒔蘿蒿精油抑菌活性的報道，因此無法與其他研究進行直接比較。陳玉梅等[28]研究發(fā)現(xiàn)，艾葉精油中也含有較高含量的桉油精和松油醇等物質(zhì)，桉油精含量高于松油醇，且抑菌結(jié)果顯示艾葉精油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出了良好的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌的抑菌作用更強，這與本研究結(jié)果相類似。艾飛翔等[6]對延安產(chǎn)白蒿精油進行了成分分析并進行了抑菌活性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白蒿精油中桉油精和松油醇含量很低，其對金黃色葡萄球菌沒有抑菌活性，對大腸桿菌的抑制作用也十分微弱[6]。因此可以推測，蒔蘿蒿精油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌表現(xiàn)出良好的抑菌活性在很大程度上可能與其所含桉油精和松油醇等主要成分密切相關(guān)。另外，在該研究中，相比大腸桿菌，蒔蘿蒿精油對金黃色葡萄球菌的抑制作用更明顯，這可能是由于兩種菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)上的差異所造成的。有研究表明，金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁只是單層的肽聚糖結(jié)構(gòu)，對外來入侵分子的抵制能力較弱，而大腸桿菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，包括外膜蛋白、外膜和肽聚糖層等一系列物質(zhì)結(jié)構(gòu)，使得精油不容易進入到細(xì)胞內(nèi)[9]。

綜上，蒔蘿蒿精油在驅(qū)蟲和抑菌等方面均具有良好的活性，其有望被開發(fā)成為一種無毒無公害的天然藥劑并被應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和果蔬保鮮等許多方面。該項研究填補了蒔蘿蒿精油抑菌作用及其機制等研究方面的空白，對于蒔蘿蒿精油的進一步研究和開發(fā)利用具有十分重要的意義。