激素性股骨頭壞死中細(xì)胞自噬的作用

陳俊名 劉又文 何沛霖 張虹 張俊濤 孫含瑞 岳辰

(1福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350001;2河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院);3河南中醫(yī)藥大學(xué))

股骨頭壞死(ONFH)是骨科常見的一種由多種因素造成的疾病〔1〕。長期或短期過量使用糖皮質(zhì)激素(GCs)是發(fā)生ONFH的常見誘因，其中長期過量使用GCs會(huì)有超過40%的人群發(fā)生激素性股骨頭缺血性壞死(SONFH)，SONFH是一種代謝性疾病，其發(fā)病特點(diǎn)為多位雙側(cè)發(fā)病，且壞死范圍較大，發(fā)病年齡主要為中年及青年，研究發(fā)現(xiàn)其進(jìn)展具有不可逆性〔2〕，且目前缺乏有效的治療方法。SONFH有許多發(fā)病機(jī)制，如破壞成骨分化和脂肪形成分化之間的平衡，脂肪栓塞，循環(huán)障礙，細(xì)胞凋亡和功能障礙，髓內(nèi)壓力變化及凝血功能障礙〔3，4〕等。GCs作用下細(xì)胞凋亡及正常細(xì)胞活性受抑的原因尚不完全明確，有觀點(diǎn)表明：在SONFH發(fā)生、發(fā)展過程中，細(xì)胞凋亡及正常骨活性受抑與其細(xì)胞自噬失調(diào)密切相關(guān)〔5～7〕。

1 細(xì)胞自噬

1.1細(xì)胞自噬的概念 自噬(Autophagy)即指細(xì)胞通過產(chǎn)生“自噬體”吞噬胞內(nèi)衰老、失能的細(xì)胞結(jié)構(gòu)并與溶酶體融合后通過水解酶將上述物質(zhì)降解并回收利用的過程。當(dāng)細(xì)胞處在饑餓、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、輻射、缺氧等條件刺激下，便會(huì)轉(zhuǎn)錄并表達(dá)自噬的相關(guān)基因(ATG)并將在細(xì)胞內(nèi)形成自噬體，自噬體隨后與溶酶體結(jié)合后吞噬胞內(nèi)衰老、失能的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，降解回收胞內(nèi)異常大分子化合物和受損細(xì)胞器〔8～11〕，最后這些小分子物質(zhì)透過溶酶體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，重新參與細(xì)胞能量代謝。該過程為細(xì)胞生存提供能量前體物質(zhì)，是細(xì)胞的自我保護(hù)行為，是機(jī)體適應(yīng)傷害性刺激的表現(xiàn)，該過程在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞正常功能、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞發(fā)揮正常功能方面發(fā)揮重要作用〔12，13〕。自噬的種類主要分三種，包括巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)及分子伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA)〔14〕。

1.2細(xì)胞自噬的分子生物學(xué)過程 自噬的過程是一個(gè)連續(xù)動(dòng)態(tài)的自我保護(hù)過程，其中自噬體形成是細(xì)胞自噬的重要環(huán)節(jié)，通過對(duì)微生物的觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬主要分為5個(gè)階段，細(xì)胞自噬相關(guān)基因ATG約為35種，這35種ATG在自噬體形成的過程中，每一種ATG各自表達(dá)所產(chǎn)生的功能不一樣，整個(gè)自噬過程與自噬相關(guān)基因關(guān)聯(lián)密切〔15〕。有研究表明：當(dāng)細(xì)胞在消耗營養(yǎng)的過程中，雷帕霉素復(fù)合-1(mTOR-1)會(huì)被抑制，然后形成ULK1-ATG13-FIP200復(fù)合體(ULK1-ATG13-FIP200)，自噬正調(diào)控蛋白是提高自噬活動(dòng)性的重要調(diào)節(jié)蛋白，隨后ATG5與ATG12相互結(jié)合，成為ATG5與ATG12的復(fù)合體，其在微管相關(guān)蛋白的促進(jìn)和驅(qū)使下會(huì)相互連接進(jìn)一步形成微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)，當(dāng)形成自噬體標(biāo)記蛋白后，由于這些蛋白的所處環(huán)境及特性會(huì)在已形成的自噬體膜上發(fā)生連接反應(yīng)，形成最終的自噬體〔16〕。當(dāng)自噬被激活時(shí)，自噬活動(dòng)便開始，已成形的自噬體會(huì)包裹機(jī)體不再需要的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)聚合體，并攜帶需要回收的細(xì)胞器與蛋白質(zhì)聚合體與溶酶體進(jìn)行融合，這個(gè)過程會(huì)將這些物質(zhì)進(jìn)行分解重吸收后合成新的大分子。其中重要的調(diào)節(jié)因素包括了mTOR-1、絲氨酸、P62等。研究表明：mTOR可以使Atg13磷酸化，磷酸化后不能再與Atg1結(jié)合，便不能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)自噬的發(fā)生〔17〕。正常情況下，細(xì)胞自噬處于低水平狀態(tài)，當(dāng)處于異常的情況下時(shí)，細(xì)胞自噬會(huì)被激活從而具有保護(hù)功能，但是只有處在適度的自噬狀態(tài)下才會(huì)起到保護(hù)細(xì)胞的作用。自噬失調(diào)包括了自噬活性過低和自噬活性過高，二者都會(huì)抑制細(xì)胞自噬正常功能，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡并對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損害〔18，19〕。當(dāng)細(xì)胞自噬活性過低時(shí)，細(xì)胞自噬無法正常及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)受損、失能的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)聚合體，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)無法循環(huán)利用，自我保護(hù)能力降低。而當(dāng)細(xì)胞自噬活性過高時(shí)，自噬性溶酶體會(huì)吞噬異常及一些正常的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)聚合體，細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)也會(huì)因此受損〔20，21〕。

2 SONFH與細(xì)胞自噬

2.1SONFH發(fā)展過程中細(xì)胞自噬的相關(guān)信號(hào)通路 自噬是復(fù)雜的生物學(xué)過程，與之相關(guān)的信號(hào)通路有多條〔22〕，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)與SONFH有關(guān)的細(xì)胞自噬信號(hào)通路主要包括磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路與磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信號(hào)通路。研究表明mTOR可分為mTORC1和mTORC2，其中mTORC1是細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)過程中的主要蛋白。

AMPK/mTOR是調(diào)控自噬最為關(guān)鍵的信號(hào)通路〔23，24〕。其調(diào)控細(xì)胞自噬的途徑為：AMPK/mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵酶為AMPK，它由α、β、γ三個(gè)亞基構(gòu)成，γ亞基為AMP及ATP的結(jié)合位點(diǎn)；當(dāng)各種原因?qū)е掳麅?nèi)AMP水平升高，ATP水平降低時(shí)，更多的AMP會(huì)與γ亞基結(jié)合，AMPK會(huì)發(fā)生磷酸化并被激活為p-AMPK存在；形成p-AMPK后可直接激活ULK1而啟動(dòng)細(xì)胞自噬。而另外一種方式也可通過磷酸化Raptor及TSC2的Ser而對(duì)mTOR產(chǎn)生降低活性的作用。mTOR是自噬的主要抑制活性的信號(hào)，它的最主要功能是將ATG13磷酸化，使其不能與ULK1結(jié)合形成自噬體而關(guān)閉自噬啟動(dòng)信號(hào)〔25～28〕。因此，AMPK信號(hào)通路的激活表現(xiàn)為AMPK激活，mTOR受抑，ULK1被激活而最終啟動(dòng)自噬。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞自噬經(jīng)典的信號(hào)通路〔29〕，PI3K是一種脂質(zhì)激酶，參與到細(xì)胞增殖及代謝等多種過程，其作用是可以轉(zhuǎn)導(dǎo)下游信號(hào)，從其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分類主要分為三種類型，其中第一種PI3K是由亞基(P85)和催化亞基(P110)組成一種異二聚體，主要又分為2個(gè)類別，第一個(gè)子類別為A類PI3Kα，β和δ，其是由p85α，p85β，p55γ三個(gè)中的一個(gè)和p110α，p110β或p110δ3個(gè)催化亞基之一組成；第二個(gè)子類別是由調(diào)節(jié)亞基p101和催化亞基p110γ組成的B類PI3K。Akt PI3K，是PI3K活動(dòng)下游的直接效應(yīng)分子，其功能主要是可以調(diào)節(jié)多個(gè)下游信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化及代謝。其中細(xì)胞自噬可以通過2個(gè)途徑被激活，第一個(gè)為mTOR依賴途徑，第二個(gè)為非mTOR依賴途徑。第一種途徑即PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控的細(xì)胞自噬，現(xiàn)有研究表明，這個(gè)信號(hào)通路在細(xì)胞自噬誘導(dǎo)SONFH中起到了非常重要的作用〔29〕，其中以mTOR為核心的經(jīng)典自噬通路的研究最多見。

2.2SONFH的病因研究 GCs作用下誘發(fā)ONFH是許多疾病使用激素藥物治療后常見的并發(fā)癥，根據(jù)近年研究發(fā)現(xiàn)，激素可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞程序性死亡的發(fā)生，并且會(huì)發(fā)生局部無菌性炎癥，促進(jìn)非創(chuàng)傷性O(shè)NFH的發(fā)生〔30〕。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：長期及過量應(yīng)用激素或者在關(guān)節(jié)內(nèi)直接注射激素都會(huì)增加股骨頭壞死的發(fā)生概率，其具體機(jī)制主要考慮：由于長期及大量激素使用會(huì)導(dǎo)致股骨頭血供不足，致使股骨頭內(nèi)成骨細(xì)胞和骨髓細(xì)胞死亡，隨著嚴(yán)重程度加重造成股骨頭內(nèi)支撐結(jié)構(gòu)(骨小梁)改變，股骨頭隨后發(fā)生塌陷，并表現(xiàn)為髖部疼痛和髖關(guān)節(jié)活動(dòng)受限〔31〕。GCs作用下股骨頭細(xì)胞凋亡，成骨活性下降，骨修復(fù)能力不足，繼而導(dǎo)致骨小梁力學(xué)強(qiáng)度降低是誘發(fā)SONFH的常見機(jī)制，是出現(xiàn)股骨頭塌陷的重要因素之一〔32～34〕。

而目前國內(nèi)外對(duì)于SONFH的具體機(jī)制仍沒有完全研究清楚，近年的進(jìn)展更傾向于研究基因的表達(dá)與調(diào)控在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)系，關(guān)于SONFH與細(xì)胞自噬的具體機(jī)制被學(xué)者重視，激素可以導(dǎo)致股骨頭血供不足，是發(fā)生細(xì)胞自噬失調(diào)的重要原因〔35〕。研究者傾向于關(guān)注自噬及其信號(hào)通路在各種疾病的發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制，目前大多數(shù)研究通過研究mTOR的上下游信號(hào)通路來確定調(diào)控細(xì)胞自噬的關(guān)鍵〔36〕。

2.3超量激素引起自噬失調(diào)誘發(fā)SONFH的機(jī)制 在SONFH發(fā)生、發(fā)展過程中，細(xì)胞凋亡及正常成骨活性受抑與其自噬失調(diào)密切相關(guān)〔5，14，7〕。She等〔6〕發(fā)現(xiàn)，SONFH患者壞死骨組織中成骨細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)水平明顯高于正常骨組織。通過阻斷自噬相關(guān)AMPK/mTOR信號(hào)通路，成骨細(xì)胞自噬表達(dá)水平明顯降低，但成骨細(xì)胞凋亡水平卻進(jìn)一步加重。Li等〔5〕研究也得到相似的結(jié)論，并認(rèn)為對(duì)成骨細(xì)胞自噬水平的調(diào)控將成為SONFH治療的新靶點(diǎn)。Zhang等〔7〕研究表明，在生理低劑量地塞米松作用下，成骨細(xì)胞的自噬被激活(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)而產(chǎn)生自我保護(hù)，此時(shí)細(xì)胞凋亡水平極低。但加入自噬抑制劑后，成骨細(xì)胞凋亡水平則明顯提高。Han等〔37〕的研究則證實(shí)，地塞米松作用下大鼠成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，成骨活性明顯受抑，同時(shí)其自噬水平(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，Beclin-1)較正常有所增高。然而，通過自噬激活劑進(jìn)一步提高成骨細(xì)胞自噬表達(dá)水平后，細(xì)胞凋亡減少，同時(shí)成骨活性明顯提高。上述結(jié)果充分說明GCs作用下細(xì)胞自噬失調(diào)是導(dǎo)致其凋亡、骨活性受抑，從而誘發(fā)SONFH發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。

AMPK/mTOR信號(hào)通路在GCs介導(dǎo)的細(xì)胞自噬失調(diào)中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔6，27，28〕。GCs是調(diào)控機(jī)體能量代謝的重要物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)胞內(nèi)ADP/ATP發(fā)生變化，通過影響AMPK表達(dá)水平而調(diào)控mTOR及ULK1的表達(dá)量，影響細(xì)胞自噬水平〔26〕。相關(guān)研究證實(shí)SONFH患者壞死骨組織AMPK表達(dá)水平明顯高于正常骨組織，通過AMPK抑制劑(compound C)抑制AMPK表達(dá)水平后，成骨細(xì)胞凋亡水平進(jìn)一步加重〔6〕。Guo等〔27〕的研究表明，通過compound13(AMPK激活劑)提高AMPK的表達(dá)水平能夠明顯提高小鼠成骨細(xì)胞的生物活性，抑制其凋亡。另一項(xiàng)研究也通過OSU53(AMPK另一種激活劑)對(duì)人OB-6成骨細(xì)胞進(jìn)行類似研究，得到相同結(jié)論〔28〕。因此，激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路可能提高成骨細(xì)胞自噬水平而減輕其自噬失調(diào)程度，抑制凋亡、增強(qiáng)成骨活性，從而成為干預(yù)SONFH發(fā)病進(jìn)程的新途徑。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是經(jīng)典的自噬信號(hào)通路之一，研究表明該通路現(xiàn)有已知通路中唯一的抑制性通路，可以通過活化該通路來抑制自噬，保護(hù)細(xì)胞并抑制其程序性死亡，反之抑制該通路就能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡。其中mTOR是PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路種重要組成蛋白，PI3K/Akt通路是mTORC1主要的上游調(diào)節(jié)劑，抑制ULK復(fù)合物的形成，可以阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成脫落進(jìn)而對(duì)細(xì)胞自噬形成負(fù)調(diào)控〔38〕。在SONFH中可能存在自噬過度活化的現(xiàn)象，過度活化自噬會(huì)導(dǎo)致骨壞死的發(fā)生，我們可以通過誘導(dǎo)并激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞存活并抑制過度活化自噬，有助于阻礙SONFH的發(fā)生及進(jìn)展〔39〕。

以上研究表明，細(xì)胞自噬影響SONFH發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的相互作用。很早就有研究證實(shí)了SONFH發(fā)病機(jī)制與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化及凋亡有關(guān)系，而細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡同樣關(guān)系非常密切〔40〕。這些研究表明細(xì)胞自噬可以增加或者減少細(xì)胞凋亡及增加骨量等，而細(xì)胞自噬在SONFH中具有雙向調(diào)節(jié)作用。

3 總結(jié)與展望

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞內(nèi)重要的維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境及穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，根據(jù)相關(guān)研究及實(shí)驗(yàn)觀察證實(shí)：長期和過量使用激素可以導(dǎo)致ONFH。SONFH中細(xì)胞自噬是程序性細(xì)胞死亡研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，近年來的研究充分說明了細(xì)胞自噬廣泛參與到SONFH的全過程。雖然在自噬的分子機(jī)制和調(diào)控機(jī)制等方面有一些研究進(jìn)展，但是細(xì)胞自噬調(diào)控SONFH的作用機(jī)制的研究還比較少，就目前而言，僅僅只能說明細(xì)胞自噬誘發(fā)SONFH有直接或間接的關(guān)系，其關(guān)系主要有2種：一種是正面調(diào)節(jié)作用，即細(xì)胞自噬活性適當(dāng)提高可以抑制SONFH壞死的進(jìn)程，可以改善激素導(dǎo)致股骨頭缺血壞死的情況，如果降低自噬活性則會(huì)起到相反作用；另外一種是則是負(fù)面調(diào)節(jié)作用，即細(xì)胞自噬活性適當(dāng)降低可以抑制SONFH壞死的進(jìn)程，可以改善激素導(dǎo)致股骨頭缺血壞死的情況，如果提高自噬活性則會(huì)起到相反作用?；诂F(xiàn)有研究可以展望如果我們?cè)赟ONFH發(fā)病機(jī)制中進(jìn)一步研究細(xì)胞自噬并取得突破性成果，我們將有望通過調(diào)控(激活或者抑制)細(xì)胞自噬來達(dá)到改善疾病進(jìn)程的目的，為SONFH的治療提供更多可靠的辦法和更有效的方案。