細(xì)胞焦亡在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用研究進(jìn)展*

萬(wàn)義鵬，張望，朱萱

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，江西 南昌330006）

肝纖維化是各種慢性肝臟疾病的最后共同通路，其由各種病因?qū)е赂涡菭罴?xì)胞活化，膠原纖維產(chǎn)生過(guò)多、分解減少，最后引起膠原纖維過(guò)度沉積于細(xì)胞外間質(zhì)而形成，如病因未得到控制，則可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝癌，最終肝功能衰竭導(dǎo)致死亡[1-2]。細(xì)胞死亡是非常普遍的生命現(xiàn)象，在生長(zhǎng)發(fā)育和疾病的發(fā)生、發(fā)展中都扮演著重要作用[3]。在肝臟疾病中可觀察到肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞死亡，以及不同細(xì)胞死亡形式，包括壞死、自噬、凋亡、鐵死亡、焦亡[4-5]。細(xì)胞焦亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型促炎程序性細(xì)胞死亡。本文主要綜述肝臟內(nèi)各種細(xì)胞焦亡在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 細(xì)胞焦亡的途徑

在1992年，細(xì)胞焦亡的形態(tài)特征和功能在革蘭陰性桿菌感染的巨噬細(xì)胞中被觀察到，但當(dāng)時(shí)被誤認(rèn)為是細(xì)胞凋亡[6]。直到2000年，BRENNAN等[7]才首次提出細(xì)胞焦亡的概念。細(xì)胞焦亡是一種新型促炎程序性細(xì)胞死亡的方式，其依賴于半胱天冬酶（cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase）活化，隨后介導(dǎo)Gasdermin D（GSDMD）水解成有生物活性的GSDMD-N，嵌入細(xì)胞質(zhì)膜并形成直徑10～15 nm 膜穿孔，導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加、離子代償失調(diào)、細(xì)胞間質(zhì)的水流入細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、乳酸脫氫酶和促炎細(xì)胞因子的大量釋放，如IL-1β、IL-18[8-9]。

細(xì)胞焦亡是由Caspase 活化介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡的結(jié)果，其由經(jīng)典焦亡途徑和非經(jīng)典焦亡途徑。經(jīng)典途徑是指依賴于Caspase-1 活化介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，而Caspase-1 的活化依賴于不同的炎癥小體活化后將pro-Caspase-1 剪切為成熟的Caspase-1。目前研究證實(shí)與細(xì)胞焦亡相關(guān)的炎癥小體包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2 炎癥小體[10]，而研究最為廣泛的是NLRP3 炎癥小體活化介導(dǎo)的經(jīng)典細(xì)胞焦亡。NLRP3 由包括C 端富含亮氨酸的重復(fù)序列、中心核苷酸結(jié)合寡聚化域、N 端半胱天冬酶激活和募集域或Pyrin 域組成[11]。中心核苷酸結(jié)合寡聚化域結(jié)構(gòu)域具有激活后NLRP3 寡聚化所需的ATP酶活性，NLRP3 的Pyrin 結(jié)構(gòu)域與ASC 的Pyrin 結(jié)構(gòu)域相互作用以啟動(dòng)炎性體組裝，配體識(shí)別和自身免疫需要富含亮氨酸的重復(fù)序列[11]。在受到病原相關(guān)分子模式（PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）刺激后招募凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白，并與NLRP3 形成偶聯(lián)體，將pro-Caspase-1 剪切為成熟Caspase-1，活化的Caspase-1， 進(jìn)一步將GSDMD 剪切為GSDMD-N 和GSDMD-C，最后由GSDMD-N 形成細(xì)胞膜穿孔，同時(shí)釋放大量的促炎因子，形成炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)，加重炎癥、促進(jìn)疾病的進(jìn)展[8，12]。除了GSDMD， GSDMs 還包括 GSDMA、 GSDMB、GSDMC、GSDME 和PJVK 等[13-14]。這 些GSDMs 有2 個(gè)保守域，包括C 端域和N 端，這2 個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合在一起可以穩(wěn)定GSDMs 構(gòu)象。然而，GSDM 在剪切C 端結(jié)構(gòu)域后，其N 端蛋白水解酶被釋放，并與細(xì)胞膜的脂質(zhì)成分結(jié)合形成寡聚體導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[3]。然而，有研究還發(fā)現(xiàn)除了GSMDM，Gasdermin 家族蛋白其他成員并不是Caspase 的底物，不參與細(xì)胞焦亡[15]。

非經(jīng)典途徑是依賴于Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[3]，值得注意的是非經(jīng)典途徑細(xì)胞焦亡有種屬之間的差異，即Caspase-4、Caspase-5 介導(dǎo)人源細(xì)胞焦亡，Caspase-11 介導(dǎo)鼠源細(xì)胞焦亡[16]。與Caspase-1 不同的是，Caspase-4、Caspase-5、Caspase-1 的N 端半胱天冬酶激活和募集域結(jié)構(gòu)域可以與細(xì)菌的脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）和革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的外膜囊泡直接結(jié)合并剪切Pro-Caspase-4、 Pro-Caspase-5、 Pro-Caspase-11，活化的Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 水解GSDMD 成為GSDMD-N，形成細(xì)胞膜穿孔，誘導(dǎo)焦亡的發(fā)生[17-18]。有研究表明，活化Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，同時(shí)也可以間接通過(guò)GSDMD 介導(dǎo)的細(xì)胞膜孔形成K+外流，或Pannexin-1 裂解/ATP釋放/P2X7/K+釋放介導(dǎo)的非經(jīng)典NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[19-20]。另外有研究表明Caspase-11 可能通過(guò)GSDMD 誘導(dǎo)的膜孔的K+流出，顯著激活NLPR3 依賴性Caspase-1 炎癥小體，進(jìn)一步激化經(jīng)典途徑細(xì)胞焦亡[21]。因此，不難發(fā)現(xiàn)GSDMD 在經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑與非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑中均發(fā)揮執(zhí)行蛋白的功能，具有重要作用。另外，細(xì)胞焦亡的非經(jīng)典途徑與經(jīng)典途徑存在交互作用。

2 細(xì)胞焦亡對(duì)肝纖維化的影響

眾所周知，肝星狀細(xì)胞活化是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心事件，其活化后產(chǎn)生結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor, CTGF）、金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue inhibitors of metalloproteinases 1, TIMP1）和膠原蛋白沉積，促進(jìn)疾病的發(fā)生、發(fā)展。研究表明肝星狀細(xì)胞可發(fā)生細(xì)胞焦亡，并被活化后高表達(dá)纖維化相關(guān)基因[22]。其機(jī)制可能是細(xì)胞焦亡后釋放的IL-1β 通過(guò)IL-1R1、JNK 和AP-1信號(hào)通路促進(jìn)靜止型肝星狀細(xì)胞向活化型肝星狀細(xì)胞改變，促進(jìn)肝纖維化發(fā)展[23-24]。

細(xì)胞焦亡的發(fā)生依賴于炎癥小體、Caspase 和GSDMD 的介導(dǎo)。WREE 等[24]研究表明NLRP3 誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡會(huì)增加CTGF、TIMP1 的表達(dá)和膠原蛋白的沉積。另外，在突變的NLRP3 敲入過(guò)表達(dá)的小鼠模型中，NLRP3 介導(dǎo)細(xì)胞焦亡導(dǎo)致更加嚴(yán)重的肝臟炎癥和纖維化[24]。相反，NLRP3 缺乏可以緩解硫代乙酰胺、四氯化碳和蛋氨酸-膽堿缺乏飲食（Methionine-choline deficiency, MCD）誘導(dǎo)的肝纖維化[25-26]。有研究表明，Caspase-1 抑制劑可阻斷肝細(xì)胞焦亡并抑制肝星狀細(xì)胞活化，最終緩解肝纖維化[27]。嗜酸性粒細(xì)胞也可發(fā)生細(xì)胞焦亡，并介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展；而Caspase-1 抑制劑可緩解嗜酸性粒細(xì)胞焦亡和肝纖維化[28]。GSDMD 在細(xì)胞焦亡、肝臟炎癥及肝纖維化中起重要的作用，尤其在細(xì)胞焦亡過(guò)程中起著不可或缺的作用[8，29]。在MCD 飲食的肝纖維化模型小鼠中，GSDMD敲除的小鼠平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的基因表達(dá)及羥脯氨酸含量顯著低于野生型小鼠，表明GSDMD 在MCD 誘導(dǎo)的肝纖維發(fā)展中起到重要作用[29]。

3 各種肝臟內(nèi)細(xì)胞焦亡與肝纖維化的關(guān)系

肝臟是對(duì)各種病原微生物及其產(chǎn)物產(chǎn)生防御的第一道防線。肝臟巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞的炎癥小體高表達(dá)，并且在受到PAMPs 和DAMPs 刺激后可激活，發(fā)生炎癥反應(yīng)、抵抗相關(guān)損害因素，同時(shí)也可介導(dǎo)細(xì)胞焦亡[30]。

3.1 肝細(xì)胞焦亡與肝纖維化

許多研究已觀察到在肝纖維化中肝細(xì)胞可發(fā)生細(xì)胞焦亡。WREE 等[24]復(fù)制全身和髓樣細(xì)胞特異性NLRP3敲入過(guò)表達(dá)的2 種小鼠模型，以闡明在不同細(xì)胞中激活NLRP3 炎癥小體對(duì)肝臟病理生理的差異。該研究發(fā)現(xiàn)與全身敲入NLRP3小鼠相比，髓樣特異性NLRP3小鼠檢測(cè)不到肝細(xì)胞焦亡，并且肝臟炎癥、肝星狀細(xì)胞活化和纖維化的嚴(yán)重程度也較低。該研究首次發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞焦亡在肝纖維化中的重要作用[24]。該研究團(tuán)隊(duì)最近復(fù)制了肝細(xì)胞特性敲入NLRP3過(guò)表達(dá)的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠可自發(fā)性發(fā)生肝臟炎癥及肝纖維化改變[27]。這個(gè)結(jié)果直接證實(shí)了NLRP3 介導(dǎo)經(jīng)典途徑的肝細(xì)胞焦亡在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中起到非常重要作用。同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，原代小鼠肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞在LPS 加尼日利亞菌素（NIG）處理后可發(fā)生細(xì)胞焦亡，并將NLRP3 炎癥小體的寡聚體釋到細(xì)胞外，可在上清液中檢測(cè)到。通過(guò)對(duì)NLRP3 寡聚體進(jìn)行熒光標(biāo)記后與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果表明肝星狀細(xì)胞可以內(nèi)吞炎癥小體的寡聚體并激活靜息狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞，使I 型膠原蛋白和α-SMA 表達(dá)明顯升高。這些結(jié)果表明肝細(xì)胞焦亡和炎癥體成分的釋放是傳播肝損傷和肝纖維化發(fā)展的又一新分子機(jī)制[27]。有研究發(fā)現(xiàn)micro-RNA 也可參與調(diào)控肝細(xì)胞焦亡、肝纖維化。LI 等[31]研究觀察到亞砷酸鹽可誘導(dǎo)肝細(xì)胞Cleaved-Caspase-1、GSDMD 表達(dá)升高，IL-1β 釋放增加，而miR-379-5p 水平下降；miR-379-5p 過(guò)表達(dá)可抑制砷酸鹽誘導(dǎo)的GSDMD 水平升高和IL-1β 釋放，從而改善肝細(xì)胞焦亡、肝損傷。研究還發(fā)現(xiàn)亞砷酸鹽誘導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡后的上清液處理刺激肝星狀細(xì)胞，結(jié)果肝星狀細(xì)胞被活化，分泌I 型膠原蛋白、α-SMA 水平升高，而使用IL-1β 中和抗體后可抑制肝星狀細(xì)胞活化[31]。另外研究發(fā)現(xiàn)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)表明GSDMD 是miR-379-5p 的直接靶標(biāo)。同時(shí)miR-379-5p 在亞砷酸鹽誘導(dǎo)肝損傷和肝纖維化的分子機(jī)制在動(dòng)物內(nèi)體實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證。這些研究結(jié)果表明miR-379-5p可以直接調(diào)控GSDMD，改善肝細(xì)胞焦亡，間接調(diào)控肝星狀細(xì)胞狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)肝損傷及肝纖維的進(jìn)展。另一個(gè)研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新型的肝細(xì)胞焦亡信號(hào)通路在肝纖維化中的作用[32]。該研究指出鞘磷脂合酶1（Sphingomyelin synthase 1, SMS1）產(chǎn)生的甘油二酯（Diacylglycerol, DAG）激活PKCδ、NLRC4炎癥小體以誘導(dǎo)肝細(xì)焦亡焦，而抑制Caspase-1、NLRC4 和SMS1 缺乏可減輕高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡、肝臟炎癥和肝纖維化。該模型中敲除NLRC4可以阻止肝細(xì)胞焦亡和肝臟炎癥的發(fā)展。研究表明，SMS1 是通過(guò)DAG/PKCδ/NLRC4 炎癥小體信號(hào)通路介導(dǎo)經(jīng)典途徑的肝細(xì)胞焦亡，促進(jìn)NASH 和肝纖維化發(fā)生、發(fā)展[32]。

3.2 肝星狀細(xì)胞焦亡與肝纖維化

NLRP3 炎癥小體在肝星狀細(xì)胞內(nèi)中等表達(dá)，并可以介導(dǎo)焦亡發(fā)生[22，33-34]。KONG 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲(chóng)的可溶性蛋抗原可誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞中Caspase-1 和反應(yīng)活性氧族（reactive oxygen species,ROS）明顯升高，同時(shí)乳酸脫氫酶和碘化丙錠染色也明顯升高。而使用ROS 抑制劑可下調(diào)肝星狀細(xì)胞Caspase-1 活性和細(xì)胞焦亡。該研究表明可溶性蛋抗原可通過(guò)ROS 介導(dǎo)Caspase-1 活化導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞焦亡，促進(jìn)肝臟炎癥進(jìn)展及肝纖維化的形成[22]。另一項(xiàng)研究報(bào)道在酸誘導(dǎo)的模型中酸感應(yīng)離子通道1a（Acid-sensing ion channel 1a, ASIC1a）介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化，α-SMA 和I 型膠原蛋白表達(dá)水平顯著升高，但NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白和GSDMD 表達(dá)下調(diào)。相反，抑制或沉默ASIC1a 可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞焦亡和肝纖維化進(jìn)展[35]。DONG等[36]研究表明，棕櫚酸可以激活肝星狀細(xì)胞上的TLR4/NF-κB/NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)肝纖維進(jìn)展。JIANG 等[37]研究發(fā)現(xiàn)ATP刺激人肝星狀細(xì)胞后，P2x7R、NLRP3、Caspase-1和IL-1β 明顯升高，并且α-SMA 和I 型膠原蛋白也升高；使用P2x7R 選擇性抑制劑后上述現(xiàn)象被抑制。研究表明，ATP 可通過(guò)P2x7R/NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化。

3.3 肝臟巨噬細(xì)胞焦亡與肝纖維化

肝臟巨噬細(xì)胞是肝臟內(nèi)表達(dá)NLRP3 的主要來(lái)源，其在介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化和焦亡中起到重要作用[34]。肝臟巨噬細(xì)胞是肝臟抵抗病原微生物和發(fā)揮自身免疫功能的第一道防線，在肝臟的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[38]。研究表明肝臟巨噬細(xì)胞在NASH 和肝纖維化等疾病中起到重要作用[39-41]。然而，肝臟巨噬細(xì)胞焦亡在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中作用的研究非常有限。在2020年，ZHANG 等[42]研究了lncRNA-Lfar1 在肝纖維化中對(duì)肝臟巨噬細(xì)胞焦亡的作用。該研究發(fā)現(xiàn)，在四氯化碳和膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化模型中沉默lncRNA-Lfar1 可減輕NLRP3 介導(dǎo)的肝臟巨噬細(xì)胞焦亡。體外實(shí)驗(yàn)同樣表明lncRNA-Lfar1基因沉默可顯著抑制LPS/ATP 和LPS/NIG 誘導(dǎo)的NLRP3 炎癥體介導(dǎo)KCs 焦亡。表明肝臟巨噬細(xì)胞焦亡可以促進(jìn)肝纖維化。這些結(jié)果表明，lncRNA-Lfar1 調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞焦亡在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中起至關(guān)重要的作用，并可能成為治療肝纖維化的新靶標(biāo)[42]?？紤]到肝臟巨噬細(xì)胞焦亡在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中的相關(guān)研究很少，且相關(guān)分子機(jī)制尚未完全闡明，因此將來(lái)需要進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)其重要性。

4 總結(jié)

細(xì)胞焦亡是依賴于Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 介導(dǎo)的促炎性程序性細(xì)胞死亡，釋放大量促炎因子，促進(jìn)肝臟炎癥和肝臟疾病發(fā)展。目前研究最為廣發(fā)的是NLRP3 炎癥小體活化介導(dǎo)的經(jīng)典途徑細(xì)胞焦亡。肝臟內(nèi)的肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肝臟巨噬細(xì)胞均可發(fā)生細(xì)胞焦亡，釋放大量的促炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)肝臟炎癥和肝星狀細(xì)胞活化，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。因此，不可否認(rèn)的是細(xì)胞焦亡可能成為治療肝纖維化的新靶點(diǎn)。目前研究已報(bào)道Caspase-1 和GSDMD 的抑制劑可以緩解細(xì)胞焦亡。但是，不可忽視的是抑制細(xì)胞焦亡的同時(shí)可能會(huì)下調(diào)自身免疫力，從而增加感染的風(fēng)險(xiǎn)和不良反應(yīng)。因此，在未來(lái)需要進(jìn)一步研究如何精準(zhǔn)、適度地調(diào)控細(xì)胞焦亡，以達(dá)到緩解肝臟炎癥和纖維化，又不過(guò)度下調(diào)自身免疫力而增加感染風(fēng)險(xiǎn)的目的。