真姬菇次生代謝產(chǎn)物化學(xué)成分的研究

蔡 旭，肖 咪，薛宏坤，鄒先偉，唐勁天*

（1.清華大學(xué)工程物理系，教育部粒子與輻射成像重點實驗室，北京 100084；2.華中科技大學(xué)協(xié)和江北醫(yī)院，武漢市蔡甸區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430065）

藥食兩用真菌是我國中醫(yī)藥寶庫的重要組成部分，具有數(shù)千年的應(yīng)用歷史，為人們提供了大量的食品藥品資源。真菌的代謝產(chǎn)物是其功效及防治疾病的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其資源豐富，提供了眾多安全、有效的活性分子，通過菌種誘變、培養(yǎng)條件、代謝調(diào)控等方法優(yōu)化，藥食兩用真菌可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、種類豐富、生物活性獨特的次生代謝產(chǎn)物，而且大多具有再生性，例如從側(cè)耳屬菌中分離得到截短側(cè)耳素類、新骨架eryngiolide A、雙萘并吡喃酮等類型活性成分［1-3]，從牛樟芝Antrodia camphorata中分離得到三萜、馬來酸衍生物、安卓奎諾爾等活性成分［4-5]，從金針菇Flammulina velutiper 次生代謝產(chǎn)物中分離得到花側(cè)柏烷型單萜化合物enokipodins A～D 等［6]。

真姬菇Hypsizygus marmoreus（Peck）H.E.Bigelow 屬于離褶傘科玉蕈屬真菌，又名海鮮菇、斑玉蕈、蟹味菇等，主要分布于日本、中國、北歐等地，富含蛋白質(zhì)、必需氨基酸、微量元素等，具有獨特的蟹香味，是一種營養(yǎng)價值較高的藥食兩用真菌［7]。目前對真姬菇的研究大多局限于其品種、栽培、提取物活性、提取工藝等，對其化學(xué)成分報道較少［8-13]，僅分離到具有抗氧化、抗腫瘤活性的β-（1-3）-D-葡聚糖［14]，抑制 HepG2 細胞的hypsiziprenol A9，人白血病U937 細胞的糖蛋白HM-3A［15-16]。為了更深入地開發(fā)利用真姬菇，本實驗對其進行大米固體發(fā)酵后，用乙酸乙酯提取其次生代謝產(chǎn)物，從中分離鑒定了11 個化合物，均為首次從玉蕈屬真菌次生代謝產(chǎn)物中分離得到。

1 材料

AvanceⅢ400-NMR 超導(dǎo)核磁共振儀（德國Bruker BioSpin 公司）；Agilent 6520 Q-TOF 質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）；Dionex Ultimate 3000 液相色譜儀（美國Dionex 公司）；賽普銳斯中壓液相色譜儀（賽普銳斯北京科技有限公司）；柱色譜硅膠（100～200、200～300 目）、硅膠薄層板GF254（青島海洋化工廠）；RP-C18色譜填料、HPLC 制備柱（250 mm×20 mm，5 μm，日本YMC 公司）。液相用純凈水（實驗室自制）；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等分析純（北京市通廣精細化工公司）；色譜純甲醇（美國Sigma 公司）。RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；ZF-2三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）。

真姬菇菌種于2018 年購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC?），編號CICC50078，收藏于清華大學(xué)醫(yī)學(xué)物理與工程研究所。

2 提取與分離

將菌株接種到經(jīng)高壓滅菌的PDA 平板培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂，PDA）在25 ℃下活化培養(yǎng)7 d后，接種至250 mL 培養(yǎng)瓶，每瓶50 mL，液體培養(yǎng)基（0.4% 葡萄糖、1% 麥芽提取物、0.4% 酵母提取物）在25 ℃下培養(yǎng)7 d，配制15 瓶（大米80 g、水120 mL），121 ℃高壓滅菌鍋滅菌25 min后備用。從液體培養(yǎng)基中接種適量種子培養(yǎng)物到滅菌后的三角瓶中，放置于培養(yǎng)架上，室溫下培養(yǎng)21 d。

發(fā)酵完成后，分別用2 倍體積200 mL 石油醚、乙酸乙酯對每瓶發(fā)酵產(chǎn)物萃取3 次，濾過，合并濾液，濃縮，得到乙酸乙酯粗提物10.3 g。將乙酸乙酯粗提物（14.6 g）經(jīng)RP-C18色譜柱，用水、20%、40%、60%、95%甲醇各2.0 L 依次梯度洗脫，收集餾分，每瓶100 mL，薄層硅膠板檢測合并餾分，減壓回收甲醇，干燥，得到5 個餾分（Fr.A～Fr.E）。Fr.B 分別用石油醚、二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，濾過，得化合物1（0.73 g）；Fr.E 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，薄層硅膠板檢測合并餾分，經(jīng)石油醚-二氯甲烷（10∶1～2∶1）梯度洗脫，得到3 個亞組分Fr.E1～E3。Fr.E1 經(jīng)過制備型HPLC 甲醇-水（80∶20～90∶10）梯度洗脫，得化合物2（2.5 mg）、3（4.5 mg）；Fr.E2 經(jīng)制備型HPLC 甲醇-水（85∶15～95∶5）梯度洗脫，得化合物4（4.8 mg）、5（3.4 mg）、6（8.9 mg）、7（6.8 mg）、8（1.8 mg）、9（1.9 mg）；Fr.E3 經(jīng)過硅膠石油醚-二氯甲烷（1∶1）洗脫得化合物10（3.8 mg）、11（3.6 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，10% 硫酸乙醇，加熱105 ℃，呈灰色；EI-MS m/z：462.654 1 ［M +H]+，分子式C29H40N3O2。1H-NMR（400 MHz，C5D5N） δ：7.71（1H，s，H-4），7.06（1H，s，H-6），3.36（2H，td，J=14.5，3.1 Hz，H-8），4.09（1H，ddd，J=8.4，4.2 Hz，H-9），6.28（1H，dd，J=17.4，10.5 Hz，H-16），5.14（1H，dd，J=17.4，10.5 Hz，H-17），1.54（3H，s，H-18），1.54（3H，s，H-19），3.59（4H，m，H-20，25），5.46（1H，t，J=7.3 Hz，H-21），5.60（1H，t，J=7.4 Hz，H-26），1.73（3H，s，H-28），1.73（3H，s，H-29）；13C-NMR（100 MHz，C5D5N） δ：141.7（C-2），106.4（C-3），130.2（C-3a），115.7（C-4），130.8（C-5），122.1（C-6），123.9（C-7），132.1（C-7a），32.3（C-8），56.7（C-9），56.7（C-10），168.4（C-11），51.4（C-12），21.5（CH3-12），168.4（C-14），39.3（C-15），146.8（C-16），111.3（C-17），28.1（C-18），28.1（C-19），34.9（C-20），125.4（C-21），133.1（C-22），17.5（C-23），25.4（C-24），34.9（C-25），123.0（C-26），133.1（C-27），25.4（C-28），17.5（C-29）。以上數(shù)據(jù)與文獻［17] 基本一致，故鑒定為灰綠曲霉素。

化合物2：黃色固體，10% 硫酸乙醇，加熱105 ℃，呈黃綠色；EI-MS m/z：322.380 4 ［M+Na]+，分子式C19H22O3Na。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.48（1H，s，H-4），11.73（1H，s，6-OH），6.75（1H，s，H-7），6.35（1H，d，J=15.8 Hz，H-9），6.54（1H，m，H-10），2.27（2H，m，H-11），1.57（2H，m，H-12），1.00（3H，t，J=7.4 Hz，H-13），10.26（1H，s，H-14），3.43（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.37（1H，t，J=7.4 Hz，H-16），1.81（3H，s，H-18），1.74（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：110.8（C-1），128.6（C-2），148.4（C-3），119.4（C-4），126.4（C-5），157.6（C-6），98.9（C-7），157.6（C-8），118.4（C-9），135.4（C-10），35.0（C-11），22.1（C-12），13.7（C-13），193.0（C-14），27.5（C-15），121.3（C-16），134.0（C-17），25.8（C-18），17.8（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻［18-19] 基本一致，故鑒定為2-（3，8-環(huán)氧-7，9-庚二烯基）-6-羥基-5-（17-甲基-2-丁烯基）苯甲醛。

化合物3：黃色固體，10% 硫酸乙醇，加熱105 ℃，呈墨綠色；EI-MS m/z：296.374 4［M]+，分子式C19H20O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.48（1H，s，H-4），11.75（1H，s，6-OH），6.82（1H，s，H-7），6.34（1H，d，J=15.5 Hz，H-9），6.97（1H，dd，J=15.5，10.8 Hz，H-10），6.25（1H，t，J=15.5 Hz，H-11），6.00（1H，dq，J=14.0，6.8 Hz，H-12），1.89（3H，d，J=6.6 Hz，H-13），10.27（1H，s，H-14），3.44（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.37（1H，t，J=7.4 Hz，H-16），1.81（3H，s，H-18），1.75（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：112.8（C-1），128.1（C-2），156.9（C-3），118.8（C-4），126.4（C-5），156.7（C-6），102.9（C-7），147.3（C-8），116.5（C-9），134.1（C-10），131.0（C-11），131.4（C-12），18.2（C-13），194.0（C-14），27.5（C-15），121.6（C-16），134.4（C-17），25.5（C-18），18.0（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻［18-19] 基本一致，故鑒定為2-（3，8-環(huán)氧-7，9，11-庚三烯基）-6-羥基-5-（17-甲基-2-丁烯基）苯甲醛。

化合物4：黃色固體，10% 硫酸乙醇，加熱105 ℃，呈墨綠色；ESI-MS m/z：301.179 4 ［MH]-，分子式 C19H24O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：6.91（1H，s，H-4），11.97（1H，s，6-OH），2.98（2H，t，J=7.5 Hz，H-7），2.31（2H，m，H-8），5.48（1H，m，H-9），5.48（1H，m，H-10），1.97（2H，m，H-11），1.36（2H，dt，J=14.6，7.3 Hz，H-12），0.89（3H，t，J=7.4 Hz，H-13），10.25（1H，s，H-14），3.32（2H，d，J=7.3 Hz，H-15），5.30（1H，t，J=7.3 Hz，H-16），1.72（3H，s，H-18），1.79（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：117.3（C-1），128.8（C-2），145.0（C-3），125.8（C-4），127.5（C-5），155.8（C-6），24.2（C-7），34.1（C-8），128.3（C-9），132.6（C-10），34.6（C-11），22.5（C-12），13.6（C-13），195.6（C-14），27.0（C-15），121.1（C-16），133.8（C-17），17.8（C-18），25.8（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻［20] 基本一致，故鑒定為2-（E-3-庚烯基）-3，6-二羥基-5-（17-甲基-2-丁烯基）苯甲醛。

化合物5：黃色固體，10% 硫酸乙醇，加熱105 ℃，呈墨綠色；ESI-MS m/z：301.179 8 ［MH]-，分子式 C19H25O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：6.95（1H，s，H-4），2.94（2H，t，J=8.4 Hz，H-7），2.03（2H，m，H-8），1.31（2H，m，H-9），1.51（2H，m，H-10），5.44（1H，m，H-11），5.44（1H，m，H-12），1.64（3H，d，J=4.5 Hz，H-13），10.28（1H，s，H-14），3.27（2H，d，J=7.5 Hz，H-15），5.30（1H，t，J=6.0 Hz，H-16），1.72（3H，s，H-18），1.77（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：117.5（C-1），128.6（C-2），145.1（C-3），125.8（C-4），128.7（C-5），156.2（C-6），24.0（C-7），31.6（C-8），29.8（C-9），32.6（C-10），133.4（C-11），125.6（C-12），17.6（C-13），195.6（C-14），27.1（C-15），121.2（C-16），133.8（C-17），17.8（C-18），25.8（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻［21] 基本一致，故鑒定為isotetrahydroauroglaucin。

化合物6：黃色固體，10% 硫酸乙醇，加熱105 ℃，呈墨綠色；ESI-MS m/z：299.165 0 ［MH]-，分子式 C19H23O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：6.95（1H，s，H-4），11.95（1H，s，6-OH），3.0（2H，t，J=7.7 Hz，H-7），2.36（2H，q，J=7.4，6.7 Hz，H-8），6.03（1H，m，H-9），5.61（1H，dp，J=13.7，6.8 Hz，H-10），6.03（1H，m，H-11），5.61（1H，dp，J=13.7，6.8 Hz，H-12），1.75（3H，d，J=6.8 Hz，H-13），10.23（1H，s，H-14），3.31（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.30（1H，t，J=7.3 Hz，H-16），1.71（3H，s，H-18），1.77（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：117.3（C-1），128.8（C-2），145.3（C-3），126.0（C-4），127.6（C-5），155.7（C-6），24.1（C-7），34.2（C-8），128.1（C-9），131.9（C-10），129.5（C-11），131.2（C-12），18.1（C-13），195.6（C-14），27.1（C-15），121.2（C-16），133.8（C-17），17.8（C-18），25.7（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻［22] 基本一致，故鑒定為異二氫金（色）灰綠曲霉素。

化合物7：黃色固體，10% 硫酸乙醇，加熱105 ℃，呈墨綠色；ESI-MS m/z ：303.196 5 ［MH]-，分子式 C19H27O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：4.49（1H，s，3-OH），6.92（1H，s，H-4），11.95（1H，s，6-OH），2.91（2H，t，J=7.9 Hz，H-7），1.60（2H，m，H-8），1.33（8H，m，H-9，10，11，12），0.90（3H，t，J=6.6 Hz，H-13），10.28（1H，s，H-14），3.32（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.32（1H，t，J=7.4 Hz，H-16），1.72（3H，s，H-18），1.79（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：117.3（C-1），128.8（C-2），145.3（C-3），126.0（C-4），127.6（C-5），155.7（C-6），24.1（C-7），34.2（C-8），128.1（C-9），131.9（C-10），129.5（C-11），131.2（C-12），18.1（C-13），195.6（C-14），27.1（C-15），121.2（C-16），133.8（C-17），17.8（C-18），25.7（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻［20-21] 基本一致，故鑒定為灰綠曲霉黃色素。

化合物8：黃色固體，10% 硫酸乙醇，加熱105 ℃，呈墨綠色；EI-MS m/z：339.188 5 ［M+Na]+，分子式C19H24O4Na。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：6.98（1H，s，H-4），12.01（1H，s，6-OH），3.12（2H，t，J=7.5 Hz，H-7），2.25（1H，m，H-8），2.02（1H，m，H-8），4.50（1H，t，J=7.4 Hz，H-9），5.87（1H，dd，J=15.7，5.5 Hz，H-10），5.95（1H，dd，J=15.7，5.5 Hz，H-11），4.41（1H，q，J=6.2 Hz，H-12），1.34（3H，d，J=6.4 Hz，H-13），10.24（1H，s，H-14），3.31（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.32（1H，t，J=7.4 Hz，H-16），1.71（3H，s，H-18），1.77（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：116.5（C-1），120.4（C-2），146.8（C-3），126.3（C-4），129.6（C-5），155.1（C-6），19.9（C-7），27.3（C-8），74.8（C-9），127.7（C-10），137.6（C-11），66.4（C-12），23.2（C-13），195.7（C-14），26.3（C-15），121.8（C-16），132.6（C-17），24.3（C-18），16.9（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻［18] 基本一致，故鑒定為毛殼菌吡喃寧。

化合物9：黃色固體，10% 硫酸乙醇，加熱105 ℃，呈墨綠色；EI-MS m/z：337.149 4 ［M+Na]+，分子式C19H22O4Na。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.00（1H，s，H-4），12.03（1H，s，6-OH），3.15（2H，t，J=7.5 Hz，H-7），2.25（1H，m，H-8），1.96（1H，m，H-8），4.71（1H，m，H-9），6.43（1H，dd，J=16.0，1.7 Hz，H-10），6.85（1H，dd，J=16.0，1.7 Hz，H-11），2.34（3H，s，H-13），10.24（1H，s，H-14），3.33（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.32（1H，t，J=7.4 Hz，H-16），1.72（3H，s，H-18），1.79（3H，s，H-19），12.01（1H，s，6-OH）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：116.5（C-1），119.4（C-2），145.8（C-3），127.3（C-4），130.6（C-5），156.7（C-6），20.0（C-7），26.8（C-8），73.8（C-9），144.2（C-10），130.5（C-11），196.8（C-12），27.6（C-13），194.2（C-14），26.3（C-15），121.8（C-16），132.6（C-17），24.3（C-18），16.9（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻［19] 基本一致，故鑒定為6′-oxo-chaetopyranin。

化合物10：黃色固體，10% 硫酸乙醇，加熱105 ℃，呈墨綠色；EI-MS m/z：323.400 7 ［M+Na]+，分子式C19H22O3Na。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.03（1H，s，H-4），11.73（1H，s，6-OH），6.52（1H，1H，d，J=16.3 Hz，H-7），6.47（1H，dd，J=16.3，10.1 Hz，H-8），6.30（1H，dd，J=14.7，10.1 Hz，H-9），5.92（1H，dt，J=14.7，7.5 Hz，H-10），2.17（2H，dd，J=13.9，6.7 Hz，H-11），1.48（2H，dt，J=13.9，7.0 Hz，H-12），0.97（3H，t，J=7.3 Hz，H-13），10.11（1H，s，H-14），3.34（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.32（1H，t，J=3.0 Hz，H-16），1.72（3H，s，H-18），1.79（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：117.3（C-1），128.8（C-2），145.3（C-3），126.0（C-4），127.6（C-5），155.7（C-6），118.1（C-7），137.9（C-8），129.5（C-9），138.2（C-10），34.2（C-11），24.0（C-12），13.6（C-13），195.6（C-14），29.7（C-15），121.1（C-16），133.8（C-17），17.7（C-18），25.7（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻［22] 基本一致，故鑒定為二氫金（色）灰綠曲霉素。

化合物11：黃色固體，10% 硫酸乙醇，加熱105 ℃，呈墨綠色；ESI-MS m/z：301.167 7 ［MH]-，分子式 C19H25O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.01（1H，s，H-4），11.94（1H，s，6-OH），6.56（1H，d，J=8.7 Hz，H-7），6.03（1H，m，H-8），2.35（2H，dd，J=7.7，1.8 Hz，H-9），1.52（2H，q，J=7.7，1.8 Hz，H-10），1.35（4H，m，H-11，12），0.97（3H，t，J=7.2 Hz，H-13），10.03（1H，s，H-14），3.32（2H，d，J=7.3 Hz，H-15），5.30（1H，t，J=7.3 Hz，H-16），1.72（3H，s，H-18），1.79（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：117.1（C-1），129.7（C-2），144.8（C-3），125.2（C-4），124.6（C-5），155.3（C-6），120.3（C-7），142.6（C-8），34.0（C-9），28.5（C-10），31.6（C-11），22.4（C-12），14.0（C-13），195.9（C-14），27.0（C-15），121.0（C-16），133.7（C-17），17.8（C-18），25.8（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻 ［20] 基本一致，故鑒定為曲霉素。

4 討論

本研究從真姬菇大米發(fā)酵的乙酸乙酯提取物中分離鑒定出11 個化合物，主要為苯甲醛類衍生物。苯甲醛類衍生物已從冠突散囊菌 Eurotium cristatum、海洋真菌 Aspergillus sp 和 Asperillus glaucus HB1-19 等中分離獲得，并具有較強的抗氧化、抗炎等活性［20，23-24]。本研究首次從藥食兩用真菌——真姬菇次生代謝產(chǎn)物中分離得到苯甲醛類衍生物，以期豐富玉蕈屬真菌次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分及其種類，為藥食兩用真菌資源的開發(fā)提供參考。