腎上腺素受體介導(dǎo)ROS產(chǎn)生的分子機制*

陳顯達， 張幼怡， 肖 晗

（北京大學(xué)第三醫(yī)院心內(nèi)科、血管醫(yī)學(xué)研究所，國家衛(wèi)生健康委心血管分子生物學(xué)與調(diào)節(jié)肽重點實驗室，分子心血管學(xué)教育部重點實驗室，心血管受體研究北京市重點實驗室，北京100191）

交感腎上腺素系統(tǒng)過度激活是高血壓、冠心病、房顫和心衰等多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理因素。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，交感應(yīng)激常導(dǎo)致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生增加。在生理情況下，ROS 在調(diào)節(jié)心臟發(fā)育、心肌細(xì)胞成熟、鈣離子流、興奮-收縮偶聯(lián)和血管張力方面發(fā)揮重要作用[1]。而在病理情況下，ROS 生成或代謝失控，引起ROS 水平升高，進而導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂類發(fā)生氧化損傷，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔激活，線粒體功能障礙，乃至細(xì)胞死亡[2]。因此，過多ROS 的產(chǎn)生是心肌肥厚、心臟缺血再灌注損傷和糖尿病心肌病等病理性心臟重構(gòu)和心力衰竭進展的關(guān)鍵因素之一[3-6]。本綜述主要關(guān)注交感腎上腺素系統(tǒng)對心血管系統(tǒng)ROS 產(chǎn)生調(diào)控機制的研究進展，以期為心血管疾病的防治提供新思路。

1 ROS的產(chǎn)生

ROS包括超氧陰離子（·O2-）、羥自由基和過氧化氫（H2O2），是細(xì)胞呼吸和新陳代謝的副產(chǎn)物，或由專門參與氧化還原信號的酶產(chǎn)生。心血管系統(tǒng)ROS的來源主要包括線粒體電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC）、線粒體和胞質(zhì)中的某些代謝酶，如線粒體單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）、環(huán)加氧酶（cyclooxygenase，COX）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）等，以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（NADPH oxidase，NOX）。鑒于ROS 信號在心臟生理和疾病中的重要作用，ROS 信號必須受到嚴(yán)格的調(diào)控來維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的穩(wěn)態(tài)，以確保ROS信號發(fā)揮生理作用而不導(dǎo)致病理效應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)ROS水平由一系列復(fù)雜的抗氧化物控制，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）/還原酶系統(tǒng)和過氧化物氧還蛋白（peroxiredoxin，Prx）/硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）系統(tǒng)，這些系統(tǒng)參與ROS 清除。當(dāng)ROS 的產(chǎn)生量超過內(nèi)源性清除能力時，就會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS 蓄積。因此，與ROS產(chǎn)生過多類似，細(xì)胞清除ROS能力受損也會導(dǎo)致心臟功能障礙[7-10]。

2 腎上腺素受體（adrenergic receptor，AR）

有研究發(fā)現(xiàn)AR 可介導(dǎo)交感過度激活引起的細(xì)胞ROS 生成[11-14]。交感應(yīng)激時，神經(jīng)遞質(zhì)兒茶酚胺通過與特定的腎上腺素受體結(jié)合來發(fā)揮作用。根據(jù)對激動劑及拮抗劑的親和力、所介導(dǎo)的信號通路和氨基酸序列的差異性，可將AR分為α1、α2和β三類。

α1-AR 激動時主要通過Gq/11蛋白激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC），PLC 促進磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸（phosphatidylinositol 4，5-biphosphate，PIP2）水解產(chǎn)生三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）與二?；视停╠iacylglycerol，DAG），DAG 繼而激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），調(diào)控鈣通道釋放鈣離子，介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞收縮。α2-AR主要分布在血管的交感神經(jīng)節(jié)后纖維的突觸前膜和后膜，通過與Gi蛋白偶聯(lián)使腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）活性降低，環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）生成減少，cAMP 依賴性蛋白激酶活性降低，引起平滑肌細(xì)胞的收縮。

β-AR 可以與Gs和Gi蛋白偶聯(lián)，此外也介導(dǎo)非G蛋白依賴的β-arrestin 信號通路。β1-AR 激動時主要通過偶聯(lián)Gs蛋白使AC 激活，cAMP 依賴性蛋白激酶激活，導(dǎo)致心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞L 型鈣通道的開放，鈣離子內(nèi)流的增加，繼而引起心臟正性變力、正性變時作用和血管平滑肌舒張。

目前認(rèn)為AR 激動能夠調(diào)控線粒體來源（包括線粒體呼吸鏈、線粒體融合分裂和線粒體MAO）及NOX 來源的ROS。另外，AR 還能通過抑制抗氧化系統(tǒng)下調(diào)ROS 的清除能力，導(dǎo)致ROS 蓄積。下面我們將從上述3 個方面對AR 調(diào)控心血管系統(tǒng)ROS 產(chǎn)生的機制進行綜述（圖1）。

3 AR介導(dǎo)線粒體來源的ROS

3.1 線粒體ETC 在機體內(nèi)，線粒體呼吸鏈?zhǔn)悄芰可a(chǎn)的中心。它具有偶聯(lián)呼吸鏈復(fù)合物之間電子轉(zhuǎn)移和線粒體內(nèi)膜上質(zhì)子運輸?shù)墓δ埽援a(chǎn)生合成ATP 所必需的電化學(xué)梯度。在氧消耗和ATP 產(chǎn)生之間，電子向下傳遞通常不是完全偶聯(lián)的。因此，一小部分（＜0.1%）電子可以從ETC 中泄漏，有一部分O2被還原，形成或H2O2。其中，最為重要的是它是大部分ROS 的前體，主要由線粒體內(nèi)膜呼吸鏈中的酶復(fù)合體I、III產(chǎn)生。

生理狀態(tài)下，β-AR 激動通過經(jīng)典的Gs/AC/cAMP/PKA通路發(fā)揮正性肌力作用，促進線粒體三羧酸循環(huán)、氧化呼吸增強和耗氧增多，導(dǎo)致更多的電子通過ETC 泄漏到線粒體內(nèi)外膜間隙，故線粒體ROS產(chǎn)生增多。蓄積的ROS 最終擴散到胞質(zhì)中，作為信號分子發(fā)揮氧化作用[15]。病理情況下，持續(xù)激活的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）能使多種參與胞內(nèi)鈣離子調(diào)控的關(guān)鍵分子發(fā)生磷酸化，包括L 型鈣通道（L-type calcium channel，LTCC）、雷諾丁受體（ryanodine receptor，RyR）、受磷蛋白（phospholamban，PLN）和肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP 酶（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）[15-20]，進而導(dǎo)致胞內(nèi)鈣超載，線粒體膜上鈣離子單向轉(zhuǎn)運體（mitochondrial calcium uniporter，MCU）攝取的鈣離子增多而使線粒體內(nèi)鈣離子濃度異常升高，線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電勢差（mitochondrial membrane potential，MMP）升高，線粒體功能異常，產(chǎn)生的ROS 增多[21-23]。Theccanat 等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，β-AR 激動所引起的ROS 產(chǎn)生增多并不完全依賴于PKA通路，可見β-AR激動導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增多還存在別的機制。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，急性β-AR 激動導(dǎo)致ROS 的產(chǎn)生分2 個階段，分別是早期階段（10～15 min）和延遲階段（90～120 min）。在新生小鼠原代心肌細(xì)胞中，β-AR 激動的早期（15 min），線粒體ROS 的產(chǎn)生依賴于cAMP/PKA 通路；而延遲期（2 h）則由非經(jīng)典的G 蛋白偶聯(lián)受 體 激 酶2（G protein-coupled receptor kinase 2，GRK2）/β-arrestin-1/NOX4 通路介導(dǎo)，且早期ROS 的產(chǎn)生以線粒體為主而不是胞漿NOX來源[25-26]。

3.2 線粒體分裂 線粒體在哺乳動物細(xì)胞中是一種動態(tài)變化的細(xì)胞器。隨著各種刺激和代謝的需要，線粒體的形狀、大小、數(shù)量和位置不斷變化。線粒體分裂和融合的平衡決定了線粒體的形狀，這也是維持線粒體和細(xì)胞功能的關(guān)鍵。線粒體通過不斷的分裂融合過程維持自身穩(wěn)定，分裂會使線粒體碎片化，而融合則促進線粒體形成管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在病理和不利因素作用下，線粒體過度分裂，發(fā)生碎片化，ETC 遭到破壞，導(dǎo)致大量電子漏出和ROS 產(chǎn)生。而線粒體融合增強可提高呼吸鏈相關(guān)蛋白活性，修復(fù)損傷線粒體，降低氧化應(yīng)激水平[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，AR 可以通過影響線粒體分裂和融合蛋白的活動進而調(diào)節(jié)線粒體ROS 的生成[27]。苯腎上腺素（phenylephrine，PE）特異性激動大鼠原代心肌細(xì)胞的α1-AR后，Gq/蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）通路激活，PKD 由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體外膜上，使線粒體發(fā)動蛋白樣蛋白1（dynamin-like protein 1，DLP1）第616 位和第637 位絲氨酸發(fā)生磷酸化，隨后磷酸化的DLP1 轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)，線粒體分裂，引起線粒體膜孔開放增多、產(chǎn)生的ROS增多和呼吸增強，并激活凋亡[13]。此外，這2 個位點同時也受β-AR 調(diào)控。β1-AR 可分別通過鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）和PKA通路使得DLP1第616位和第637位絲氨酸磷酸化；β2-AR 可通過蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）和PKA/鈣 調(diào) 磷 酸酶（calcineurin，CaN）分別使DLP1 第616 位和第637 位絲氨酸磷酸化，隨后轉(zhuǎn)移到線粒體外膜，進而線粒體發(fā)生分裂，產(chǎn)能增多的同時ROS 產(chǎn)生也增多[27-28]。由此可見，DLP1 的這2 個絲氨酸位點與線粒體分裂密切相關(guān)，且其磷酸化受AR的調(diào)控。

3.3 MAO MAO 存在于線粒體外膜，負(fù)責(zé)兒茶酚胺（如腎上腺素、多巴胺和血清素）氧化脫氨的同時，還能產(chǎn)生H2O2、NH4+和活性醛。MAO 有A 亞型和B亞型（MAO-A 和MAO-B）之分，是線粒體H2O2的重要來源之一。Kaludercic 等[29]的研究證實，用去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）刺激分離培養(yǎng)的新生和成年小鼠心肌細(xì)胞時，MAO-A 被激活，隨后心肌細(xì)胞體積變大，ROS 產(chǎn)生增多，并表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大。所有這些離體細(xì)胞的表型不完全依賴于α-AR 和β-AR 信號通路，并且可被MAO-A 的抑制劑氯己定（clorgyline）抑制。在壓力超負(fù)荷導(dǎo)致左室擴張和心力衰竭的小鼠模型中，MAO-A 對NE 的分解代謝增強并伴有氧化應(yīng)激加重。提示AR 可能通過激活線粒體外膜上的MAO-A 促進ROS 生成，但是具體分子機制仍有待研究。MAO-B 的作用與MAO-A 相似，在人和小鼠的心臟中均有表達。有研究稱MAO-B 敲除可以改善由壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心衰[30]，但是關(guān)于腎上腺素受體激動與MAO-B的關(guān)系尚未見報道。

4 AR調(diào)控NOX來源的ROS

除了線粒體，ROS 的另一個重要來源是分布于質(zhì)膜和多種細(xì)胞器膜上的NOX。NOX 家族共有7 個成員，即NOX1～5 型及Duox1 和2 型，是一類參與細(xì)胞內(nèi)ROS生成的酶，能催化NADPH 的電子向分子氧轉(zhuǎn)移，生成超氧化物和過氧化氫[31]。NOX 由2 個與膜相關(guān)的催化亞基（NOX 和p22phox）和3 個細(xì)胞質(zhì)調(diào)節(jié)亞基p47phox、p67phox和p40phox組成。鑒于NOX2 是第一個被發(fā)現(xiàn)的NOX 亞型，并且對其激活機制的研究比較豐富，以下我們就以NOX2 亞型為例對NOX 的激活過程進行闡述。靜息狀態(tài)下，NOX2和p22phox（也被稱為細(xì)胞色素b-245輕鏈）共同構(gòu)成未激活復(fù)合物定位于細(xì)胞膜上，而p40phox（也被稱為中性粒細(xì)胞胞質(zhì)因子4）、p67phox（也被稱為中性粒細(xì)胞胞質(zhì)因子2）和p47phox（也被稱為中性粒細(xì)胞胞質(zhì)因子1）則位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。此外，NOX2 完全激活還需要與小GTPase p21-RAC1（也被稱為Ras 相關(guān)的C3 肉毒毒素底物1）在膜上進行組裝。當(dāng)NOX2激活時，RAC1被募集到胞膜上，p47phox被PKC 磷酸化并與p67phox和p40phox一起轉(zhuǎn)運到膜上。由于p47phox發(fā)生磷酸化改變了其構(gòu)象，使得p47phox的Src 同源結(jié)構(gòu)域SH3 可以結(jié)合到p22phox胞質(zhì)側(cè)碳端富含脯氨酸的區(qū)域上，實現(xiàn)了NOX2的激活[31]。

心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達NOX1、NOX2、NOX4 和NOX5 這4 種亞型，血管平滑肌細(xì)胞表達NOX1、NOX4和NOX5這3種亞型[31]。目前已知的受AR 調(diào)控的亞型主要是NOX2 和NOX4。盡管它們的結(jié)構(gòu)相似，但二者存在明顯的差異。例如，NOX2 需要胞質(zhì)中的一些調(diào)節(jié)亞基才能激活，而NOX4 則不需要。NOX2 和NOX4 在不同的細(xì)胞類型中有不同的亞細(xì)胞定位。一般來說，NOX2 主要定位于質(zhì)膜，而NOX4 則主要定位于細(xì)胞內(nèi)膜，包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核膜。多種細(xì)胞外刺激通過細(xì)胞內(nèi)第二信使使NOX2 快速激活。而NOX4 是持續(xù)性激活的，其活性主要與表達量相關(guān)，受其表達水平的調(diào)控[32]。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)，在血管平滑肌中，NOX4/p22phox復(fù)合體活性受聚合酶δ 相互作用蛋白2（polymerase δ-interacting protein 2，POLDIP2）的調(diào)控，后者能與NOX4/p22phox相互作用并提高NOX4 的活性，從而介導(dǎo)ROS 的產(chǎn)生和Rho 依賴的細(xì)胞骨架重塑及細(xì)胞遷移[33]。

在成年大鼠心肌細(xì)胞中，特異性激動α1-AR 后，產(chǎn)生的ROS明顯增多，并激活了下游的Ras-MEK1/2-ERK1/2 通路，導(dǎo)致心肌肥大。增多的ROS 只能被NOX 的抑制劑[二苯多銨、氧化苯胂、4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟和鎘]抑制，而不受線粒體ETC、NOS、XO 和COX 的抑制劑的影響[34]。這提示心肌細(xì)胞α1-AR 激動引起的ROS 產(chǎn)生主要來自NOX。Matsushima 等[35]用PE 特異性激動小鼠心肌細(xì)胞的α1-AR，發(fā)現(xiàn)NOX4 的表達水平呈劑量依賴性上調(diào)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，α1-AR激動會通過核膜上的NOX4引起核內(nèi)ROS 產(chǎn)生增多，最終導(dǎo)致心肌肥厚。而在主動脈血管平滑肌細(xì)胞中，α1-AR 長時間（大于4 h）激動會通過NOX 引起ROS 產(chǎn)生過多并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[36]。Tsai等[37]用NE 處理內(nèi)皮剝脫的大鼠尾動脈，發(fā)現(xiàn)NE 激動α1-AR后能激活NOX產(chǎn)生大量ROS，并通過RhoA/Rho 激酶依賴途徑改變肌球蛋白磷酸酶介導(dǎo)的肌球蛋白輕鏈20 磷酸化，進而促進血管平滑肌收縮。NOX2 被激活后，產(chǎn)生的ROS（尤其是H2O2）會激活原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src，導(dǎo)致表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）轉(zhuǎn)激活和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）依賴的RAC1 活化；RAC1 作為NOX2 的亞基之一，它的活化能增強NOX2 的活性，進一步放大NOX2的激活[31]。

β-AR 激動除了通過上述經(jīng)典的cAMP/PKA 通路引起線粒體ROS產(chǎn)生增多外，還能通過上調(diào)NOX4的表達來促進ROS產(chǎn)生[24，38]。Theccanat等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，用異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）刺激H9c2心肌細(xì)胞會引起NOX4 表達升高（NOX2 表達水平無明顯變化），提示NOX4 是β-AR 激動后線粒體產(chǎn)生ROS 的主要來源之一。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ISO 引起的NOX4 表達水平升高不通過經(jīng)典β1-AR/cAMP/PKA 通路，而是由β1-AR/GRK2/β-arrestin 通路介導(dǎo)。如果敲減GRK2的表達，或是使用了NOX4的干擾RNA 后，β-AR 激動所引起的ROS 增多受到抑制；而使用β-arrestin 過表達腺病毒則促進ISO 引起的ROS產(chǎn)生增多。Saleem 等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，用AR 激動劑NE（能同時激動α-和β-AR）處理大鼠心肌細(xì)胞系H9c2，短時間（10 min）內(nèi)產(chǎn)生的ROS 主要來自被激活的NOX2，且ROS 定位于胞漿和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而不是線粒體。

上述研究提示，α1-AR 激動可以通過激活質(zhì)膜上的NOX2促進胞質(zhì)ROS的生成。此外，α1-AR激動還可引起核膜NOX4 表達水平升高促進細(xì)胞核內(nèi)ROS產(chǎn)生增多，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。而β1-AR激動則導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜上的NOX4 表達水平升高進而促進線粒體ROS的生成增多。目前尚未發(fā)現(xiàn)直接證據(jù)證明β1-AR激動能夠增強NOX2活性來促進ROS產(chǎn)生。

5 AR調(diào)控抗氧化系統(tǒng)

為了防止ROS 的積累，心肌細(xì)胞具有小到ROS清除劑，大到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的抗氧化酶共同組成的抗氧化系統(tǒng)[39]，包括SOD、CAT、GPx 和Prx/Trx 系統(tǒng)等。NADH 是在三羧酸循環(huán)過程中產(chǎn)生的一類重要的抗氧化分子。在生理條件下，線粒體煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶（nicotinamide nucleotide transhydrogenase，NNT）催化NADH+NADP+→NADPH+NAD+的反應(yīng)，增強NADPH 依賴性的抗氧化能力，以清除氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的ROS。而在心臟病理性超負(fù)荷期間，該反應(yīng)發(fā)生逆轉(zhuǎn)（NADPH+NAD+→NADH+NADP+），以犧牲NADPH 依賴的抗氧化能力為代價，再生NADH來維持ATP的供應(yīng)。

當(dāng)β-AR 激動發(fā)揮正性肌力作用時，高負(fù)荷工作的心肌依賴線粒體呼吸來維持足夠的能量供應(yīng)。隨著工作負(fù)荷的增加，ATP 水解速率的提高會刺激氧化磷酸化，從而通過ETC 加速線粒體NADH 氧化和電子傳遞。因此，從ETC 中漏出的單電子率更高，產(chǎn)生的ROS 增多。與此同時，為了產(chǎn)生更多的ATP 而大量消耗NADH 和NADPH，從而線粒體的抗氧化防御系統(tǒng)被削弱。Srivastava 等[40]的研究發(fā)現(xiàn)，ISO 能通過β1-AR 使心肌細(xì)胞抗氧化能力明顯減弱，包括使SOD1（即copper/zinc SOD，Cu/Zn-SOD）活性及其mRNA 和蛋白水平下降，使正性調(diào)控SOD 表達的轉(zhuǎn)錄因子Elk-1 減少，負(fù)性調(diào)控因子YY-1 增多，但是對于SOD2（即manganese SOD，Mn-SOD）、CAT 和GPx無明顯影響。

6 小結(jié)

大量研究表明，AR 激動引起的ROS 產(chǎn)生過多是心血管疾病病理生理過程中的重要環(huán)節(jié)。在心血管疾病的發(fā)病過程中，ROS由多種來源產(chǎn)生，主要是線粒體氧化呼吸鏈和NOX。但是，AR 對不同ROS產(chǎn)生系統(tǒng)的調(diào)控機制尚不十分明確。因此，對AR 調(diào)控ROS產(chǎn)生機制的進一步探究將為心血管疾病的發(fā)生發(fā)展提供新的見解，如AR 激活調(diào)控線粒體MAO和NOX 的分子機制。選擇性靶向特定的關(guān)鍵分子，如不同亞型的NOX 或MAO-A 以糾正線粒體功能障礙，從而抑制ROS產(chǎn)生，可能是一種用于治療各種心血管疾病的非常有益的新策略。