基于腺病毒載體的新型冠狀病毒肺炎疫苗研究進(jìn)展*

魯 凡，黃 婷，尹海燕

（暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院1急診科，2婦產(chǎn)科，3重癥醫(yī)學(xué)科，廣東廣州510630）

新型冠狀病毒自2019年底以來(lái)在全球范圍內(nèi)持續(xù)傳播，對(duì)全世界人類的身體健康和生產(chǎn)生活造成了嚴(yán)重的影響［1］。雖然佩戴口罩、保持安全的社交距離等公共衛(wèi)生干預(yù)措施對(duì)于控制疫情起到了非常重要的作用，但目前普遍認(rèn)為徹底結(jié)束此次疫情需要通過(guò)實(shí)現(xiàn)群體免疫，而接種疫苗是最安全有效的方法［2-3］。目前新冠疫苗采取了不同的技術(shù)路線，如核酸類疫苗、病毒載體類疫苗、基因工程重組疫苗、病毒滅活疫苗等。其中基于腺病毒載體技術(shù)研發(fā)的疫苗Ad5-nCoV、AZD1222、Ad26.COV2.S和Sputnik V均取得了較快的研究進(jìn)展，但AZD1222和Ad26.COV2.S在大規(guī)模的接種中均被報(bào)道有少量血栓形成的病例出現(xiàn)［4］，部分國(guó)家目前暫停了相關(guān)疫苗的接種工作，同一技術(shù)研發(fā)的其它疫苗也因此受到質(zhì)疑。為更好地了解基于腺病毒載體技術(shù)研制的新型冠狀病毒疫苗，本文對(duì)其特點(diǎn)及研發(fā)進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 腺病毒載體技術(shù)的發(fā)展

病毒載體技術(shù)是利用病毒具有感染細(xì)胞并將其基因組轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞內(nèi)的能力，因而被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、基因治療和疫苗的制備。目前常用來(lái)制備載體的病毒主要有：腺病毒、副流感病毒和麻疹病毒［5］。其中腺病毒作為載體與其它病毒相比具有一定的優(yōu)勢(shì)：宿主范圍較廣，可以感染分裂細(xì)胞和非分裂的細(xì)胞；病毒的顆粒穩(wěn)定不易產(chǎn)生突變；具有在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行高效復(fù)制的能力；重組病毒顆粒的致病力弱；攜帶保護(hù)性抗原的病毒可以刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答；可制備成不同的劑型便于運(yùn)輸和接種等［6-7］。

腺病毒載體技術(shù)主要經(jīng)歷3個(gè)發(fā)展階段：第1代腺病毒載體［8］是將具有病毒編碼轉(zhuǎn)錄功能的E1/E3區(qū)基因序列敲除，此類型為復(fù)制缺陷型載體，只能在人胚腎細(xì)胞HEK293內(nèi)完成復(fù)制，使用較為安全；第2代技術(shù)是在第1代的基礎(chǔ)上，將E2區(qū)或E4區(qū)的基因部分或全部敲除，因此增加了可插入的外源基因容量，同時(shí)降低了病毒的毒力［9］；第3代技術(shù)是將病毒具有編碼蛋白功能的基因組序列全部敲除，僅保留末端反向重復(fù)序列和病毒包裝元件，此類病毒載體的復(fù)制、包裝均需要輔助病毒協(xié)助完成［10］。目前針對(duì)新冠病毒的腺病毒載體疫苗在設(shè)計(jì)中多采用的是第1代技術(shù)，如Ad5-nCoV和Sputnik V等。

2 疫苗的設(shè)計(jì)與載體的選擇

病毒載體疫苗是將具有保護(hù)性抗原的基因重組到病毒基因組，通過(guò)活病毒作為載體，使抗原在宿主體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)。腺病毒載體疫苗的主要設(shè)計(jì)步驟為：（1）將目的基因進(jìn)行酶切和優(yōu)化，構(gòu)建出含有目的基因的穿梭質(zhì)粒載體；（2）將含有目的基因的穿梭質(zhì)粒與腺病毒載體質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)重組，制備出重組腺病毒骨架重組子；（3）通過(guò)酶切鑒定選出正確的克??；（4）將篩選到的重組腺病毒運(yùn)用脂質(zhì)體法等方式轉(zhuǎn)染到人胚腎細(xì)胞HEK293中，利用帶有E1基因的HEK293細(xì)胞作為包裝細(xì)胞，短期內(nèi)可包裝出相應(yīng)的腺病毒載體，通過(guò)擴(kuò)增，可大量生產(chǎn)病毒顆粒［11］。

疫苗的研發(fā)首先需要選擇合適的腺病毒載體。Ad5是一種被研究較多的腺病毒血清型，我國(guó)曾成功上市一款針對(duì)埃博拉病毒的疫苗Ad5-EBOV。Ad5相對(duì)于其它血清型可以在體內(nèi)誘導(dǎo)出更高的抗體表達(dá)水平和T細(xì)胞反應(yīng)，且有一定的臨床使用經(jīng)驗(yàn)。但腺病毒作為一種常見(jiàn)的呼吸道病原體，在部分人群中的感染率較高，人群感染后產(chǎn)生的抗體會(huì)影響疫苗接種后的效果。Wang等［12］在研究中得到結(jié)論，在中國(guó)Ad5腺病毒中和抗體的血清陽(yáng)性率達(dá)到了70%以上。Ad5-nCoV的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，508名參與者中有266名（52%）體內(nèi)存在有針對(duì)Ad5腺病毒的抗體，這些抗體不僅會(huì)降低疫苗所誘導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)水平，還會(huì)加劇疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度衰減［8］。Li等［13］認(rèn)為，對(duì)于此類人群接種一次疫苗不足以誘導(dǎo)高水平的體液免疫反應(yīng)，在第3個(gè)月至第6個(gè)月給予靈活的額外劑量可能是增強(qiáng)免疫應(yīng)答的潛在解決方案。因此，部分研究團(tuán)隊(duì)為減少體內(nèi)針對(duì)腺病毒的中和抗體的影響，在研發(fā)疫苗的過(guò)程中嘗試使用其它類型的腺病毒載體，如牛津Jenner研究所使用的是黑猩猩腺病毒載體Ch‐AdOx1［14］；俄羅斯加馬利亞研究所［15］使用重組腺病毒26型（rAd26）和重組腺病毒5型（rAd5）兩種載體組成了一種疫苗；還有部分團(tuán)隊(duì)［16］在研究中嘗試使用不同的病毒載體（Ad5/MVA）或不同的疫苗（Ad5/DNA，Ad5/蛋白疫苗）等方式，可能會(huì)減少因體內(nèi)腺病毒中和抗體導(dǎo)致的免疫原性下降的問(wèn)題。但相關(guān)疫苗的安全性和免疫原性還需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)證實(shí)。

3 抗原靶點(diǎn)的選擇

在疫苗的研發(fā)過(guò)程中，選擇合適的抗原基因重組到病毒載體上決定了疫苗是否能引起足夠的免疫反應(yīng)。目前多數(shù)疫苗在設(shè)計(jì)中將刺突糖蛋白（以下稱S蛋白）作為抗原位點(diǎn)。S蛋白是一種高度糖基化的I型膜蛋白，以三聚體的形式存在，可以被furin蛋白酶切割產(chǎn)生S1亞基和S2亞基。S1亞基由N端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD）和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（receptor binding domain，RBD）組成，其作用為識(shí)別細(xì)胞的受體；S2亞基的作用為介導(dǎo)病毒和細(xì)胞膜融合［17］。S1亞基的受體結(jié)合域可與宿主細(xì)胞表面的受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin-converting en‐zyme 2，ACE2）結(jié)合，并被跨膜絲氨酸蛋白酶2（transmembrane serine protease 2，TMPRSS2）在S2位點(diǎn)進(jìn)行切割，組織蛋白酶B和組織蛋白酶L可引起觸發(fā)S1亞基的解離和S2亞基折疊成融合后構(gòu)象。S2亞基中的七肽重復(fù)序列1（HR1）和七肽重復(fù)序列2（HR2）相互作用形成融合核心，導(dǎo)致病毒與宿主細(xì)胞的融合。目前普遍認(rèn)為S蛋白可以促進(jìn)冠狀病毒進(jìn)入細(xì)胞，是宿主產(chǎn)生中和抗體的重要作用位點(diǎn)，針對(duì)S蛋白的多克隆抗體可以抑制冠狀病毒進(jìn)入細(xì)胞，故S蛋白是現(xiàn)階段相關(guān)疫苗設(shè)計(jì)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)［18］。

部分疫苗如AZD1222［19］可以編碼全長(zhǎng)野生型SARS-CoV-2刺突蛋白，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域包括N端結(jié)構(gòu)域、受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、融合肽、七肽重復(fù)序列1、中心螺旋結(jié)構(gòu)域、連接器結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，在N端有額外的組織纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，tPA）分泌信號(hào)。疫苗可以編碼產(chǎn)生一個(gè)包括跨膜結(jié)構(gòu)域的野生型S蛋白序列，通過(guò)tPA信號(hào)序列轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，進(jìn)而刺激細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。部分團(tuán)隊(duì)［10］在設(shè)計(jì)中通過(guò)引入突變來(lái)增加S蛋白的穩(wěn)定性或者增加S蛋白的表達(dá)，如Ad26.COV2.S的設(shè)計(jì)中在furin蛋白酶切割位點(diǎn)引入突變，并且引入了增加穩(wěn)定性的兩個(gè)脯氨酸突變，表達(dá)全長(zhǎng)跨膜S蛋白；部分團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的疫苗如hAd5-COVID-19，可同時(shí)在體內(nèi)表達(dá)病毒內(nèi)部核衣殼和外部刺突蛋白，但該疫苗的臨床試驗(yàn)進(jìn)度目前較為緩慢，效果尚未明確。

4 疫苗在動(dòng)物試驗(yàn)中可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)

多數(shù)團(tuán)隊(duì)選擇在動(dòng)物試驗(yàn)中采用BALB/C小鼠和恒河猴模型驗(yàn)證疫苗的安全性和免疫原性，多數(shù)疫苗在給予動(dòng)物模型進(jìn)行接種后可檢測(cè)到體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

Doremalen等［19］在小鼠模型上接種AZD1222疫苗，9～14 d后通過(guò)檢測(cè)觀察到S蛋白特異性中和抗體（neutralizing antibody，NAb）、特異性IgG和IgM等抗體的表達(dá)升高，分析IgG的亞類和細(xì)胞因子后顯示疫苗引起的免疫反應(yīng)受到Th1細(xì)胞調(diào)節(jié)；再通過(guò)干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（enzymelinked immunosorbent spot，ELISpot）法和細(xì)胞因子染色等方式測(cè)定脾臟內(nèi)的免疫細(xì)胞，結(jié)果顯示接種組IFN-γ和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá)明顯增高，證實(shí)接種組在接種疫苗后產(chǎn)生了細(xì)胞免疫反應(yīng)；但該疫苗在恒河猴的攻毒模型中效果不佳，接種組6只恒河猴里有2只的支氣管肺泡灌洗液中檢測(cè)到病毒基因組RNA（gRNA）和亞基因組RNA（sgRNA），而接種組鼻拭子中的病毒載量與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，但接種組的肺部未觀察到明顯的病理性變化。Graham等［20］在小鼠和豬的模型上通過(guò)單劑量接種與單劑量接種+加強(qiáng)免疫2種接種方式進(jìn)行比較，試驗(yàn)中通過(guò)病毒中和試驗(yàn)和假病毒中和試驗(yàn)證實(shí)疫苗組單次接種后產(chǎn)生的中和抗體滴度與人類無(wú)癥狀感染患者的血清中滴度大致相當(dāng)，而加強(qiáng)免疫后的中和抗體滴度接近于恢復(fù)期的COVID-19患者血清中的滴度，病毒中和抗體隨著加強(qiáng)免疫的方式表達(dá)增高。Silva-Cayetano等［21］研究中檢測(cè)到AZD1222在成年小鼠體內(nèi)單劑量接種后，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1細(xì)胞、Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和抗原特異性CD8+T細(xì)胞；S蛋白特異性IgG和IgM可以通過(guò)濾泡外B細(xì)胞反應(yīng)和濾泡輔助性T細(xì)胞調(diào)控的生發(fā)中心反應(yīng)產(chǎn)生；而AZD1222在老年小鼠體內(nèi)接種后觀測(cè)到的免疫反應(yīng)比成年小鼠低，進(jìn)行二次接種后可以增強(qiáng)老年小鼠的B細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。因此，Silva-Cayetano等［21］認(rèn)為結(jié)合臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，加強(qiáng)免疫可能是一種提高老年人免疫原性和療效的可行策略。

中和抗體的滴度在流感疫苗等疫苗的研發(fā)中被認(rèn)為與疫苗的保護(hù)效力有關(guān)，研究人員不需要進(jìn)行大規(guī)模臨床試驗(yàn)來(lái)測(cè)試疫苗的保護(hù)效力，而是通過(guò)檢測(cè)疫苗能否誘導(dǎo)受試者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生足夠水平的中和抗體。McMahan等［22］在研究中從康復(fù)的恒河猴血液中提取IgG抗體，按不同劑量注射到恒河猴體內(nèi)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明隨著IgG抗體劑量增加，保護(hù)效力提高；隨后他們?cè)賹D8+抗體注射到恒河猴體內(nèi)清除CD8+T細(xì)胞，結(jié)果顯示，感染并康復(fù)的猴子再次暴露時(shí)感染的幾率顯著增加，這一結(jié)果證實(shí)了CD8+T細(xì)胞可能對(duì)于病毒起到一定的防感染作用。

5 腺病毒載體疫苗臨床進(jìn)展

5.1 臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì) 由于新冠疫情發(fā)展較為迅速，相關(guān)疫苗在動(dòng)物試驗(yàn)取得一定的進(jìn)展后即開(kāi)始了臨床試驗(yàn)。如Ad5-nCoV的I期臨床試驗(yàn)［23］是一項(xiàng)劑量增加、單中心、開(kāi)放標(biāo)簽、非隨機(jī)的臨床試驗(yàn)：試驗(yàn)的樣本量較小，108名受試者分為低劑量組、中劑量組和高劑量組；研究的持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短（數(shù)據(jù)報(bào)道時(shí)僅包含接種后28 d的數(shù)據(jù)）；缺乏隨機(jī)對(duì)照組；受試者的年齡均低于60歲，僅有16%的受試者超過(guò)50歲。在Ⅱ期臨床研究中［12］由于國(guó)內(nèi)疫情基本得到控制，沒(méi)有參與者在接種疫苗后接觸到SARS-CoV-2病毒，故研究團(tuán)隊(duì)無(wú)法評(píng)估疫苗的有效性或接種組產(chǎn)生免疫反應(yīng)時(shí)可能出現(xiàn)的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)；其次Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究的對(duì)象不包括兒童。Ⅲ期臨床試驗(yàn)是全球多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的臨床試驗(yàn)，目前還在繼續(xù)進(jìn)行。Sputnik V疫苗的I/Ⅱ期試驗(yàn)［24］同樣存在一定的問(wèn)題：隨訪時(shí)間較短，只有42 d；參與的受試者數(shù)量較少，僅有76例，同時(shí)還分成冷凍劑型和凍干劑型兩種劑型分別進(jìn)行試驗(yàn)；試驗(yàn)沒(méi)有設(shè)置安慰劑組或者對(duì)照疫苗組；試驗(yàn)是一項(xiàng)開(kāi)放標(biāo)簽、非隨機(jī)研究的試驗(yàn)，其干預(yù)手段和試驗(yàn)結(jié)果之間的聯(lián)系可能會(huì)受到其他因素的影響，比如醫(yī)生的治療等；受試者普遍較年輕，需要進(jìn)一步評(píng)估該疫苗在老年人群和免疫力較低的人群中的應(yīng)用效果。AZD1222和Ad26.COV2.S的I/Ⅱ期試驗(yàn)均采用了多中心、隨機(jī)對(duì)照設(shè)計(jì)，后者還設(shè)立了65歲以上年齡組觀察老年人群對(duì)于疫苗的反應(yīng)。

5.2 劑量選擇和接種方案 對(duì)于疫苗中病毒顆粒的選擇，多數(shù)團(tuán)隊(duì)根據(jù)既往同載體其他類似疫苗的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行選擇，隨后根據(jù)臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)的免疫原性和安全性進(jìn)行調(diào)整。如Ad5-nCoV疫苗的研究團(tuán)隊(duì)［12，23］曾設(shè)計(jì)出5×1010、1×1011和1.5×1011三種劑量，在I期和Ⅱ期的臨床研究中觀察到更高的劑量并不具有更強(qiáng)的免疫原性，反而帶來(lái)更多的副作用如疼痛、發(fā)熱等。Sputnik V的研究團(tuán)隊(duì)［24］根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定每劑含有1011個(gè)病毒顆粒。AZD1222的研究團(tuán)隊(duì)［25］在試驗(yàn)中采取了兩種方案，部分受試者接種兩劑標(biāo)準(zhǔn)劑量（5×1010），部分受試者接種一半劑量作為第1次注射劑量，標(biāo)準(zhǔn)劑量作為第2次注射劑量，Ⅲ期試驗(yàn)中低劑量后接種標(biāo)準(zhǔn)劑量組的有效性高于前者。對(duì)于腺病毒載體疫苗的使用劑量和接種方案，并不存在一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，可能會(huì)根據(jù)疫苗的種類，接種人群以及體內(nèi)中和抗體的水平存在一定的變化。

目前多數(shù)疫苗的給藥方式為肌肉注射給藥，而部分團(tuán)隊(duì)嘗試其它方式進(jìn)行接種，如使用口服給藥的方式的疫苗有VXA-CoV2-1和hAd5 S-Fusion+NETSD；使用鼻內(nèi)給藥的方式進(jìn)行接種的BBV154疫苗，吸入用Ad5-nCoV目前也在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。Doremalen等［26］使 用 倉(cāng) 鼠 和 恒 河 猴 模 型 評(píng) 估AZD1222疫苗鼻內(nèi)接種的潛力，研究人員使用的是帶有D614G突變的SARS-CoV-2病毒，與對(duì)照組相比，經(jīng)鼻接種的倉(cāng)鼠鼻拭子中的病毒載量顯著降低，在攻毒模型和傳播模型中的肺組織內(nèi)均未觀察到病毒RNA或傳染性病毒。經(jīng)鼻接種疫苗后恒河猴可減少病毒的脫落，減少支氣管肺泡灌洗液和下呼吸道組織中的病毒載量。鼻腔接種在兩種不同的動(dòng)物模型中減少了病毒脫落，證明了鼻腔黏膜接種途徑具有一定的可行性。對(duì)于疫苗接種來(lái)說(shuō)，如能完成口服接種或者鼻腔吸入接種，將大大加快疫苗接種的速度，有利于控制疫情的發(fā)展。對(duì)于腺病毒載體疫苗可以有更多的接種方式可進(jìn)行相關(guān)研究。

5.3 臨床試驗(yàn)中具有一定的免疫原性和安全性

疫苗首先需要在臨床試驗(yàn)中驗(yàn)證免疫原性和安全性才能進(jìn)一步推廣接種。Ad5-nCoV的I期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)中［12，23］，研究團(tuán)隊(duì)可在疫苗接種14 d時(shí)可檢測(cè)到RBD結(jié)合抗體，28 d時(shí)RBD結(jié)合抗體可升高至4倍以上；疫苗誘導(dǎo)的中和抗體滴度水平相對(duì)較低，低、中劑量組的中和抗體血清轉(zhuǎn)化率分別是47%和59%、通過(guò)IFN-γELISpot法測(cè)定到的接種28 d后低、中劑量組特異性T細(xì)胞反應(yīng)率分別是88%和90%?？傮w上接種28 d后有91%和95%的疫苗組成員出現(xiàn)了細(xì)胞或者體液反應(yīng)。

Sputnik V疫苗Ⅲ期臨床試驗(yàn)中［27］，疫苗組接種42 d后，RBD特異性抗體幾何平均滴定度為8 996，血清轉(zhuǎn)化率為98.25%，中和抗體幾何平均數(shù)滴定度為44.5，血清轉(zhuǎn)化率95.83%。通過(guò)IFN-γ的分泌水平顯著升高證明在抗原表達(dá)后產(chǎn)生了T細(xì)胞免疫反應(yīng)。在有效性方面，所有年齡組中觀察到的疫苗效力均大于87%。值得注意的是，在60歲以上的參與者中，疫苗的有效性為91.8%，疫苗對(duì)中度或重度COVID-19的有效性為100%。

AZD1222疫苗的Ⅲ期臨床試驗(yàn)采取了兩種不同的接種方式［25］，中期療效分析報(bào)告后顯示：在接受兩種標(biāo)準(zhǔn)劑量的參與者中，疫苗的有效性為62.1%；低劑量后標(biāo)準(zhǔn)劑量組的疫苗有效率為90%；兩組參與者總體的疫苗有效力為70.4%。減少初始劑量的接種反而帶來(lái)了更高的中和抗體表達(dá)，這類似的結(jié)果在其它疫苗［28］上也有所體現(xiàn)，具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

Ad26.COV2.S的Ⅲ期試驗(yàn)［29］顯示疫苗接種28 d后對(duì)中重度感染病例的預(yù)防總體有效率達(dá)66%，對(duì)于嚴(yán)重病例的有效預(yù)防率達(dá)到了85%。該疫苗在不同地區(qū)的研究中存在差異，在美國(guó)的有效率為72%，而在拉丁美洲和南非的有效率分別為68%和64%，這一不同地區(qū)的疫苗有效率之間的差異可能是由于地區(qū)之間的COVID-19病毒的變異所造成的。

目前評(píng)價(jià)疫苗有效性時(shí)常采取的方式是測(cè)定疫苗誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體的滴度。Anand等［30］對(duì)32名COVID-19康復(fù)患者體內(nèi)的中和抗體滴度進(jìn)行了追蹤研究，患者出現(xiàn)癥狀31周后，只有38%和54%的患者的血漿樣本中可以檢測(cè)到針對(duì)S蛋白的IgM和IgA，100%的患者樣本能檢測(cè)到IgG；樣本的平均中和抗體滴度從出現(xiàn)癥狀后第6周的155.6降低到第31周的60.0，而77%的患者在最后一個(gè)時(shí)點(diǎn)無(wú)法檢測(cè)到中和抗體活性；中和抗體的Fc端介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的效應(yīng)作用，可以殺死被COVID-19細(xì)胞感染的細(xì)胞，降低COVID-19感染的嚴(yán)重程度；研究人員還觀察到抗體依賴性細(xì)胞毒性（antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC）活性與第6周時(shí)相比有降低，85%的患者在31周后仍能激發(fā)強(qiáng)烈的ADCC活性；而針對(duì)S蛋白受體結(jié)合域具有特異性的記憶B細(xì)胞水平在出現(xiàn)COVID-19癥狀后的8個(gè)月內(nèi)逐步上升并保持穩(wěn)定。根據(jù)研究結(jié)果Anand等［30］認(rèn)為，中和抗體的滴度雖然隨著時(shí)間逐步下降，但由于存在細(xì)胞免疫反應(yīng)，中和抗體滴度的下降不代表保護(hù)能力的降低，因此對(duì)于疫苗誘發(fā)的中和抗體反應(yīng)和細(xì)胞反應(yīng)，有可能會(huì)有類似的保護(hù)效果，疫苗保護(hù)效力的評(píng)價(jià)需要多方面的進(jìn)行。

6 存在的問(wèn)題

盡管腺病毒載體疫苗在研發(fā)過(guò)程中取得了較快的進(jìn)展，但在此次新冠疫情之前，被正式批準(zhǔn)使用的腺病毒載體疫苗只有兩種埃博拉疫苗，分別是Ad5-EBOV［31］和Zabdeno［32］。其中Ad5-EBOV被研制后處于國(guó)家應(yīng)急儲(chǔ)備階段，并未進(jìn)行大規(guī)模量產(chǎn)；而Zab‐deno是一種和Mvabea組成雙劑接種的埃博拉疫苗，到2020年為止Zabdeno的接種量才達(dá)到21.5萬(wàn)。目前AZD1222等腺病毒載體疫苗在未完全完成臨床試驗(yàn)就進(jìn)行了大規(guī)模的接種。因此，相關(guān)團(tuán)隊(duì)可能會(huì)進(jìn)一步觀察到在臨床試驗(yàn)階段未表現(xiàn)出的問(wèn)題。

6.1 病毒變異可能導(dǎo)致疫苗失效 2020年12月以來(lái)，在英國(guó)、印度、巴西以及南非等國(guó)家先后報(bào)道了新冠病毒的變異毒株。如在英國(guó)出現(xiàn)的B.1.1.7變異毒株［33］，在南非報(bào)道出現(xiàn)的B.1.351變異［34］等。目前印度出現(xiàn)的B.1.617變異毒株，RNA序列有多處突變，其中E484Q位點(diǎn)的突變與英國(guó)變種、南非變種相似，L452R位點(diǎn)的突變則與美國(guó)B.1.427和B.1.429變種相似。研究顯示，這兩個(gè)位點(diǎn)的突變都能增強(qiáng)病毒的傳染性，并能降低人體內(nèi)抗體的識(shí)別率［35］。Ad26.COV2.S在Ⅲ期試驗(yàn)中不同地區(qū)的研究中存在差異，可能是病毒變異株所產(chǎn)生的影響［29］。Hacisuleyman等［36］觀察到突變株引起的感染占紐約新發(fā)病例的72%，主要來(lái)自B.1.1.7突變株和B.1.526突變株，而兩名患者均接種過(guò)疫苗，通過(guò)假病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)到，患者體內(nèi)存在較高水平的中和抗體，體外血清樣品檢測(cè)其對(duì)野生型病毒、E484k突變和B.1.526突變株具有有效性，抗體識(shí)別了這些突變，然而并不足以防止感染。因此，對(duì)于接種疫苗后感染突變病毒的病例，還需要持續(xù)監(jiān)測(cè)多種新冠病毒突變，包括對(duì)有癥狀和無(wú)癥狀人群進(jìn)行病毒檢測(cè)，對(duì)病毒RNA進(jìn)行測(cè)序，以及監(jiān)測(cè)中和抗體的效價(jià)。

6.2 部分疫苗可能誘發(fā)罕見(jiàn)血栓 腺病毒載體疫苗在臨床試驗(yàn)階段中［8，23-24］報(bào)道的并發(fā)癥多數(shù)為疲勞、頭痛、肌肉疼痛和注射部位疼痛等。AZD1222疫苗在臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)了2例橫向脊髓炎［14，25］，獨(dú)立委員會(huì)調(diào)查后認(rèn)為與疫苗具有相關(guān)性的可能性較小，還有4例非COVID-19肺炎相關(guān)的死亡病例，均被認(rèn)為與疫苗無(wú)關(guān)。Ad26.COV2.S在Ⅲ期試驗(yàn)［28］中疫苗組出現(xiàn)11例靜脈血栓栓塞，對(duì)照組出現(xiàn)3例。但在進(jìn)行大規(guī)模接種后，AZD1222和Ad26.COV2.S均被報(bào)道出現(xiàn)血栓形成事件［37］。Schultz等［38］報(bào)道了5例靜脈血栓形成和血小板減少的患者，均在接種AZD1222后7～10 d出現(xiàn)，患者的血液中可以檢測(cè)到高水平的針對(duì)PF4-聚陰離子復(fù)合物的抗體，這些抗體能激活血小板，導(dǎo)致血栓的不正常形成和游離血小板數(shù)目的下降，研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為這些病例代表一種非常罕見(jiàn)的與疫苗相關(guān)的肝素誘導(dǎo)血小板減少癥變體。Greinacher等［39］對(duì)11名接種AZD1222疫苗后出現(xiàn)血栓的患者進(jìn)行分析，所有患者在接種AZD1222疫苗的5～16 d后出現(xiàn)了一次或多次血栓形成事件，并伴有血小板減少，他們認(rèn)為這些癥狀類似于除肝素以外的其它因素如陰離子藥物、病毒或細(xì)菌感染所誘導(dǎo)的臨床癥狀，在檢測(cè)后同樣觀察到血清中攜帶高水平針對(duì)PF4的抗體。他們?cè)谘芯恐形茨苊鞔_抗體形成的原因，但認(rèn)為輸入高劑量的免疫球蛋白可以抑制Fcγ受體介導(dǎo)的血小板激活的過(guò)程，而這些病人的癥狀與肝素誘導(dǎo)血小板減少癥非常相似，在檢測(cè)排除肝素的作用之前建議使用非肝素類抗凝血藥物。

6.3 人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）可能影響腺病毒疫苗的安全性 部分學(xué)者認(rèn)為，Ad5疫苗可能會(huì)增加對(duì)HIV的易感性。由于在先前的Step和Phambili 2b期研究中，Ad5載體HIV-1疫苗增加了接種者對(duì)于HIV-1的易感性，而參與Phambili研究的異性戀男性也存在HIV感染增加的風(fēng)險(xiǎn)，故Buchbinder等［40］認(rèn)為Ad5疫苗在HIV流行地區(qū)的使用會(huì)增加相應(yīng)人群感染HIV的風(fēng)險(xiǎn)。Fauci等［40］認(rèn)為，Ad5疫苗的這種副作用可能是HIV疫苗特有的，在HIV流行地區(qū)進(jìn)行Ad5疫苗試驗(yàn)后，應(yīng)檢測(cè)HIV的發(fā)病率。

6.4 疫苗使用的安全性尚未覆蓋全部群體 感染COVID-19病毒的重癥患者多為老年人或存在基礎(chǔ)性疾病的患者，但在臨床試驗(yàn)中選擇的對(duì)象多為健康成年人。相關(guān)疫苗對(duì)于這部分人群的保護(hù)作用和安全性評(píng)價(jià)尚在研究，報(bào)道相對(duì)較少。例如在Ad5-nCoV疫苗I期臨床試驗(yàn)［23］的初步結(jié)果顯示：18～44歲接種者中和抗體的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率高于45～60歲接種者，但I(xiàn)期臨床試驗(yàn)的志愿者中僅16%的受試者年齡超過(guò)50歲，且沒(méi)有納入60歲以上人群。因此，I期臨床試驗(yàn)的結(jié)果所提供的信息有限，所以試驗(yàn)人員在Ⅱ期試驗(yàn)中納入了60歲以上的志愿者。Sputnik V疫苗Ⅲ期臨床試驗(yàn)的中期報(bào)告表明，疫苗對(duì)于老年人群具有保護(hù)作用，特別是在2144名60歲以上的志愿者中（1 611名疫苗組，533名安慰劑組），疫苗的有效性達(dá)到了91.8%，其中有1 369名60歲以上的志愿者接受了2次劑量的接種［27］，疫苗對(duì)于老年人群的保護(hù)效力更有助于在此次疫情中降低易感人群的死亡率。Ad26.COV2.S的Ⅲ期試驗(yàn)中有34%（n=14 672）的志愿者年齡達(dá)到60歲以上，并且有41%的志愿者患有與進(jìn)展為重癥新冠肺炎風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的合并癥：肥 胖（41%）、2型 糖 尿 ?。?.3%）、高 血 壓（10.3%）、艾滋?。?.8%）［28］；其他免疫功能低下的志愿者也參與了研究，具體數(shù)據(jù)還在進(jìn)一步研究中。對(duì)存在基礎(chǔ)疾病的患者，目前尚缺乏具體的臨床試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)，這可能是疫情后期需要重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題之一。

綜上所述，基于腺病毒載體技術(shù)研制的新冠疫苗在相關(guān)研究中表現(xiàn)了一定的安全性和合適的免疫原性，但仍需要在臨床的大規(guī)模接種中繼續(xù)嚴(yán)密觀察副作用和對(duì)病毒變異株的有效性。腺病毒載體技術(shù)在疫苗研制的方向具有很高的科研和臨床研究?jī)r(jià)值，在未來(lái)對(duì)于可能出現(xiàn)的其它病毒的防治具有重要的意義。