低氧性肺動(dòng)脈高壓中線粒體鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

趙恩麒，蓋祥云,3，葉 萍

(1. 青海民族大學(xué)藥學(xué)院， 2. 青海省青藏高原植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3. 青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種以肺動(dòng)脈阻力升高和血管重塑為特征的慢性血管疾病，缺氧是肺動(dòng)脈高壓的主要因素，由于缺氧引起的肺動(dòng)脈高壓稱(chēng)之為低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)[1]。低氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)和低氧性肺血管重構(gòu)(hypoxic pulmonary vascular remodeling，HPVR)是低氧性肺動(dòng)脈高壓的兩大病理特征。根據(jù)暴露在低氧條件下的時(shí)間不同，可以將HPV分為急性期HPV和持續(xù)性HPV，其中急性期HPV表現(xiàn)為低氧引發(fā)的快速的肺血管收縮反應(yīng)。持續(xù)性HPV，指長(zhǎng)時(shí)間的肺泡低氧條件引發(fā)的難以逆轉(zhuǎn)的低氧性肺血管重構(gòu)。線粒體中Ca2+是普遍存在的、多能的、動(dòng)態(tài)的因子，決定著細(xì)胞的增殖和凋亡，是許多細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵因子。研究表明Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在HPV和HPVR中發(fā)揮著重要的作用。HPH的發(fā)病機(jī)制及其與線粒體Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系尚不明確，本文就近幾年文獻(xiàn)中所研究的線粒體Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與HPH之間的關(guān)系做一綜述。

1 線粒體攝取Ca2+的機(jī)制

線粒體攝取Ca2+必須通過(guò)線粒體外膜和線粒體內(nèi)膜。氫離子移動(dòng)通過(guò)電子傳遞鏈(electron transport chain，ETC)穿過(guò)線粒體內(nèi)膜形成濃度梯度，提供鈣離子積累電化學(xué)驅(qū)動(dòng)力。線粒體鈣單向傳遞體(mitochondrial Ca2+uniporter，MCU)是線粒體攝取Ca2+的主要途徑，存在于線粒體內(nèi)膜。線粒體鈣攝取-1(mitochondrial Ca2+uptake-1，MICU1)是MCU復(fù)合體的一部分，只允許Ca2+進(jìn)入線粒體。Ca2+首先通過(guò)電壓依賴(lài)型陰離子通道1穿過(guò)線粒體外膜，然后通過(guò)MCU穿過(guò)線粒體內(nèi)膜，進(jìn)入線粒體[2]。線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria-associated ER membranes，MAMs)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)與線粒體之間緊密連接的通訊物理基礎(chǔ)[3]。Ca2+從ER轉(zhuǎn)移到線粒體中要借助MAMs表面專(zhuān)有的鈣離子通道。細(xì)胞鈣儲(chǔ)庫(kù)釋放Ca2+的部位在MAMs處形成高鈣胞質(zhì)，并在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到很高的Ca2+濃度，其濃度遠(yuǎn)高于細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度。ER和肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)中的Ca2+可通過(guò)其表面存在的三磷酸肌醇受體(inositol triphosphate receptors，IP3R)或者雷尼丁受體(ryanodine receptor，RyR)釋放進(jìn)入線粒體基質(zhì)中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體相互作用發(fā)生在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)，Ca2+是細(xì)胞器用來(lái)交流的最重要的信號(hào)之一。

2 Ca2+調(diào)節(jié)線粒體功能在HPV中的作用

HPV是指急性缺氧導(dǎo)致肺泡氧分壓下降到一定閾值時(shí)，肺血管迅速發(fā)生可逆的收縮反應(yīng)，從而糾正肺內(nèi)通氣/血流的不匹配，使肺動(dòng)脈壓不變的情況下最大程度的提高血液的氧飽和度。低氧引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)收縮是引發(fā)HPV的關(guān)鍵因素，而細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高是引起PASMCs收縮的主要原因之一[4]。低氧可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣儲(chǔ)庫(kù)釋放Ca2+，促進(jìn)線粒體攝取Ca2+并導(dǎo)致細(xì)胞中Ca2+濃度(intracellular Ca2+concentration，[Ca2+]i)升高，進(jìn)而引發(fā)HPV。PASMCs中的線粒體在生理缺氧中主要扮演傳感器的作用。

2.1 MCU在Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用MCU對(duì)Ca2+具有高度選擇性，是線粒體攝取Ca2+的主要途徑[5]。MICU1是MCU復(fù)合物中的組成部分,當(dāng)胞質(zhì)中Ca2+濃度低時(shí)，通過(guò)設(shè)置一個(gè)門(mén)檻來(lái)阻止線粒體攝取Ca2+，從而起到看門(mén)人的作用[6]。此外，MCU復(fù)合體的調(diào)控蛋白還包括MICU2、MCUb、EMRE。低氧可促進(jìn)線粒體攝取Ca2+，進(jìn)而促進(jìn)線粒體產(chǎn)生活性氧( reactive oxygen species，ROS)，導(dǎo)致線粒體中活性氧濃度(mitochondrial ROS concentration，[ROS]mito)升高。細(xì)胞中ROS主要來(lái)源于線粒體產(chǎn)生的ROS。細(xì)胞中ROS濃度(intracellular ROS concentration，[ROS]i)升高可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣儲(chǔ)庫(kù)釋放Ca2+，[Ca2+]i升高，進(jìn)而引發(fā)HPV。線粒體攝取Ca2+過(guò)程的高效率可歸因于線粒體和鈣池離子之間的密切配合。此外，線粒體Na+/Ca2+交換器(mitochondrial Na+/Ca2+exchanger，mNCX)可平衡MCU對(duì)Ca2+的吸收。

2.2 ROS、RyR和IP3R在Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用SR釋放的Ca2+是興奮-收縮偶聯(lián)的關(guān)鍵[7]。線粒體與SR緊密相連，Ca2+是這些細(xì)胞器維持最佳功能的關(guān)鍵因素。SR中的RyR Ca2+釋放通道通過(guò)多種蛋白調(diào)節(jié)Ca2+的釋放進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。研究表明RyR受體可介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)SR中的Ca2+釋放，其中Ⅱ型雷尼丁受體(ryanodine receptor type-2，RYR2)發(fā)揮主要作用。IP3R含有多種反應(yīng)性硫醇，是ROS的常見(jiàn)分子靶點(diǎn)。低氧誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所是ETC復(fù)合物Ⅲ。低氧可誘導(dǎo)線粒體中ROS的產(chǎn)生并增加PASMCs內(nèi)Ca2+濃度，進(jìn)而促進(jìn)PASMCs中線粒體攝取Ca2+，這可能在HPV及其相關(guān)的肺動(dòng)脈高壓中起重要作用[8]。研究表明低氧時(shí)復(fù)合物Ⅲ中的Rieske Fe/S蛋白(rieske iron-sulfur protein，RISP)可介導(dǎo)ROS的生成，進(jìn)而使PASMCs內(nèi)Ca2+水平升高[9]。線粒體攝取Ca2+抑制劑RU360通過(guò)抑制線粒體中低氧誘導(dǎo)的ROS的生成，進(jìn)而抑制線粒體攝取Ca2+，最終抑制低氧誘導(dǎo)的線體Ca2+超載。低氧條件下，ETC復(fù)合物Ⅲ中，RISP依賴(lài)的線粒體ROS的產(chǎn)生，能夠激活磷脂酶(PLC)C-γ1導(dǎo)致IP3產(chǎn)生，IP3R通道開(kāi)放并釋放Ca2+。因此[ROS]mito在低氧誘導(dǎo)SR的Ca2+釋放和PASMCs收縮中發(fā)揮重要的作用。低氧可誘導(dǎo)SR中RyR2介導(dǎo)的Ca2+釋放，促進(jìn)線粒體攝取Ca2+并促進(jìn)線粒體中ROS的生成[8]。[ROS]mito升高可激活RyR2/Ca2+釋放通道，導(dǎo)致線粒體中Ca2+濃度(mitochondrial Ca2+concentration，[Ca2+]mito)升高。[Ca2+]mito升高又會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，引發(fā)PTP孔開(kāi)放，最終導(dǎo)致[Ca2+]i升高形成一個(gè)正反饋機(jī)制。同時(shí)，PASMCs中ROS和氧化還原偶還可抑制氧敏感電壓門(mén)控鉀通道Kv，激活電壓門(mén)控鈣通道CaL，進(jìn)而增加[Ca2+]i，導(dǎo)致PASMCs收縮，引發(fā)HPV。

3 線粒體中Ca2+與 HPVR之間的相互作用

低氧引起的肺血管重構(gòu)主要與PASMCs增殖/凋亡之間的不平衡有關(guān)[10]。線粒體中Ca2+在平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)線粒體受到刺激時(shí)會(huì)吸收Ca2+來(lái)提高有氧代謝，使細(xì)胞對(duì)凋亡敏感。在PASMCs中，[Ca2+]mito升高會(huì)抑制平滑肌細(xì)胞增殖，因此這一策略可作為治療HPH的潛在手段[11]。在肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中[Ca2+]mito升高會(huì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，促進(jìn)炎性應(yīng)答，抑制NO的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致HPH的發(fā)生。

3.1 IP3R通路在Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用Mendes Carolina等人[12]研究證明IP3R的三種亞型中的Ⅲ型優(yōu)先將鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)到線粒體中，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ATP可誘導(dǎo)線粒體對(duì)Ca2+的攝取，通過(guò)沉默Ⅲ型IP3R比沉默Ⅰ型或沉默Ⅱ型更能有效的抑制線粒體攝取Ca2+[12]。Ⅲ型三磷酸肌醇受體(type Ⅲ inositol trisphosphate receptor，IP3R3)在絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)等激酶的磷酸化作用下抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，[Ca2+]mito降低，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖[13]。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激時(shí)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)轉(zhuǎn)移至MAMs界面，激活A(yù)kt-IP3R3通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體鈣轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

3.2 MCU在Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用MCU為線粒體Ca2+通道[14]，在Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要的作用。線粒體膜電位作為驅(qū)動(dòng)力促使Ca2+轉(zhuǎn)移到線粒體中，MCU介導(dǎo)的線粒體攝取Ca2+在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物能量學(xué)和細(xì)胞凋亡中起重要作用，其失調(diào)與多種人類(lèi)疾病有關(guān)[15]。低氧可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣儲(chǔ)庫(kù)釋放Ca2+，并通過(guò)刺激細(xì)胞膜上鈣通道導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。MCU能夠清除胞質(zhì)中過(guò)量的Ca2+，同時(shí)線粒體也利用這些離子產(chǎn)生細(xì)胞能量[16]。MCU可能與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生相關(guān)，持續(xù)低氧可造成MCU功能受損，導(dǎo)致[Ca2+]mito降低，進(jìn)而促進(jìn)PASMCs增殖。

3.3 MAMs在Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用擾亂MAMs的形成，會(huì)導(dǎo)致線粒體缺陷，抑制ATP生成和線粒體攝取Ca2+能力降低[13]。線粒體內(nèi)Ca2+水平降低是抑制有氧呼吸，促進(jìn)增殖的關(guān)鍵因素[17]。緩慢增加[Ca2+]mito可促進(jìn)線粒體內(nèi)Ca2+依賴(lài)酶的活性，從而促進(jìn)葡萄糖氧化，抑制糖酵解，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。因此[Ca2+]mito升高在促進(jìn)細(xì)胞有氧呼吸和抑制細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要的作用。

MAMs界面含有眾多可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體鈣轉(zhuǎn)移軸的蛋白和信號(hào)通路[17]。網(wǎng)狀蛋白Nogo-B是網(wǎng)狀蛋白家族4(reticulon protein family 4，Rtn4,又名Nogo)中的一員。低氧可促進(jìn)Nogo-B的表達(dá)并抑制Nogo-B受體(NgBR)表達(dá)，進(jìn)而抑制MAMs的形成。NgBR失調(diào)可破壞MAMs和增加IP3R3磷酸化，進(jìn)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，導(dǎo)致[Ca2+]mito降低，促進(jìn)細(xì)胞增殖[18]。將NgBR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到PASMCs中，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組的增殖相關(guān)蛋白表達(dá)水平降[18]。低氧可抑制MAMs的形成，進(jìn)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體鈣轉(zhuǎn)移，[Ca2+]mito降低，抑制PASMCs凋亡。Nogo-B可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的距離增加，對(duì)鈣敏感的線粒體酶受到抑制，線粒體內(nèi)Ca2+水平降低，線粒體膜電位增加，[ROS]mito降低，線粒體依賴(lài)凋亡減少，進(jìn)而參與血管重構(gòu)。當(dāng)?shù)脱醢l(fā)生時(shí)，平滑肌細(xì)胞中活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor6，ATF6)轉(zhuǎn)錄激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白Nogo-B，通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)來(lái)減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體膜之間的接觸，進(jìn)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，減少線粒體對(duì)Ca2+的攝取。促進(jìn)Nogo-B的表達(dá)能促進(jìn)磷酸化蛋白激酶B (pAkt)表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)IP3R3的磷酸化。抑制IP3R3的磷酸化可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+釋放，使流入線粒體中的Ca2+增加，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。

鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路參與缺氧誘導(dǎo)PASMCs增殖，并為CaSR興奮假說(shuō)防治肺動(dòng)脈高壓提供了新的靶點(diǎn)[19]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular-signal regulated ki-nase，ERK1/2)是PASMCs凋亡的調(diào)節(jié)因子，以該激酶為中心的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)為靶點(diǎn)，可能開(kāi)發(fā)出治療肺動(dòng)脈高壓的潛在策略[20]。段旦[21]研究表明低氧促進(jìn)RELMβ、鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)、活化T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor of activated T cells，NFATc3)的表達(dá)，可引起大鼠PASMCs增殖，RELMβ可能通過(guò)Ca2+/ Calcineurin/ NFATc3信號(hào)通路促進(jìn)低氧性大鼠PASMCs增殖。

低氧可抑制MAMs的形成，進(jìn)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體鈣轉(zhuǎn)移，[Ca2+]mito降低，抑制PASMCs凋亡。同時(shí)抑制MAMs的形成導(dǎo)致線粒體攝取Ca2+的能力降低，此時(shí)線粒體不能清除細(xì)胞內(nèi)多余的Ca2+，[Ca2+]i升高，引發(fā)PASMCs增值，進(jìn)而參與血管重構(gòu)。在體內(nèi)低氧暴露的平滑肌細(xì)胞中，抑制NgBR的表達(dá)可使Nogo-B的表達(dá)增加進(jìn)而破壞MAMs的形成，并激活MAMs鈣轉(zhuǎn)移pAkt-IP3R3通路，線粒體Ca2+水平降低，調(diào)控細(xì)胞增殖[18]。綜上，NgBR可通過(guò)調(diào)節(jié)MAMs形成及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體鈣轉(zhuǎn)移pAkt-IP3R3通路調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖。

4 內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)

4.1 MAMs在Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用誘導(dǎo)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，可引發(fā)肺動(dòng)脈高壓[22]。研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)凋亡在肺動(dòng)脈高壓發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起中心作用，以ECs修復(fù)和再生為目標(biāo)的治療策略可能是治療這種疾病的唯一有效的方法[23]。鄧超等[24]研究表明，肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能在大鼠肺動(dòng)脈重構(gòu)中起重要作用。將肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞低氧處理24 h后，檢測(cè)MAMs組成蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明，低氧組MAMs組成蛋白表達(dá)情況明顯高于常氧組。因此，低氧可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中MAMs的形成。研究表明，破壞MAMs的形成能顯著抑制[Ca2+]mito升高，修復(fù)線粒體功能，抑制細(xì)胞凋亡。MAMs可調(diào)節(jié)線粒體攝取Ca2+，進(jìn)而影響線粒體功能[19]。促進(jìn)MAMs的形成可促進(jìn)線粒體攝取Ca2+，導(dǎo)致[Ca2+]mito升高，介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷[18]。因此低氧可誘導(dǎo)線粒體攝取Ca2+能力增加，促進(jìn)線粒體Ca2+超載，導(dǎo)致線粒體功能損害，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎癥應(yīng)答。線粒體Ca2+還可通過(guò)調(diào)控線粒體通透轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放，來(lái)調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性及線粒體內(nèi)損傷分子的釋放，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。線粒體Ca2+超載可引起線粒體通透轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，損害質(zhì)子濃度梯度，引起ATP生成障礙，并促進(jìn)ROS生成。

4.2 ROS在Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用細(xì)胞內(nèi)Ca2+在信息傳遞中起非常重要的作用。線粒體Ca2+和線粒體膜電位異?？纱龠M(jìn)線粒體產(chǎn)生ROS。Suresh等[25]研究表明，ROS的生成可增加ECs中[Ca2+]i，因此ROS和[Ca2+]i的升高在PH中扮演著不可替代的作用。低氧可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中ROS生成增多，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣儲(chǔ)庫(kù)釋放Ca2+，進(jìn)而促進(jìn)線粒體攝取Ca2+，[Ca2+]mito升高，引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。線粒體中Ca2+水平升高又可促進(jìn)線粒體中ROS的生成形成一個(gè)正反饋機(jī)制，加速ECs凋亡。高肺血流量可上調(diào)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞CaSR的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控線粒體通路，誘發(fā)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，最終引發(fā)PAH。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，細(xì)胞中Ca2+超載是導(dǎo)致HPV和HPVR的關(guān)鍵因素。急性低氧可誘導(dǎo)PASMCs中線粒體ROS的生成，[ROS]i升高，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣儲(chǔ)庫(kù)釋放Ca2+，[Ca2+]i升高，PASMCs收縮。同時(shí)低氧又可直接引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣儲(chǔ)庫(kù)釋放Ca2+，促進(jìn)線粒體攝取Ca2+，[Ca2+]mito升高，進(jìn)而促進(jìn)線粒體中ROS生成，形成一個(gè)正反饋機(jī)制，最終引發(fā)HPV。持續(xù)性低氧可引起PASMCs內(nèi)MCU損傷并抑制MAMs的形成，[Ca2+]mito降低，進(jìn)而促進(jìn)PASMCs增殖。低氧在不同的細(xì)胞中的誘導(dǎo)方式有所不同。在內(nèi)皮細(xì)胞中低氧可促進(jìn)MAMs的形成，進(jìn)而促進(jìn)線粒體攝取Ca2+，[Ca2+]mito升高，線粒體損害，最終引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞損傷。線粒體中Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在HPV和HPVR中扮演非常重要的角色，其作用機(jī)制也引起越來(lái)越多的研究者關(guān)注。線粒體中的Ca2+影響 HPV和HPVR的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制還未完全闡明，有待進(jìn)一步研究。