非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白CD2v的功能研究進(jìn)展①

王 曼 沈宇清

（東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京210000）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）類(lèi)屬非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，是一種有包膜的、核衣殼呈二十面體對(duì)稱(chēng)形態(tài)的病毒。ASFV基因組由線性的雙鏈DNA 組成，大小為170～193 kbp。其中包含150～167個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼150～200 種蛋白質(zhì)。ALEJO 等［1］利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定出68種病毒蛋白，僅占基因組編碼能力的39%。這些蛋白在病毒組裝、基因轉(zhuǎn)錄和RNA 修飾、維護(hù)基因組完整性、入侵宿主和免疫逃逸等方面發(fā)揮著重要作用。

ASFV 的感染與傳播途徑為野豬-軟蜱-家豬。首先是疣豬、叢林豬等因?yàn)槟撤N不明確的途徑被感染，軟蜱叮咬被感染豬而攜帶病毒，繼而叮咬家豬后將病毒傳播給家豬。在傳播過(guò)程中，疣豬等天然宿主的臨床癥狀很輕，而家豬感染后會(huì)出現(xiàn)急性出血熱，病死率很高。軟蜱作為病毒的生物載體和貯藏庫(kù)對(duì)病毒的傳播起關(guān)鍵作用。

ASFV 的致病機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全解析。ASFV 的主要宿主細(xì)胞是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，也能感染樹(shù)突狀細(xì)胞。它通過(guò)宿主巨噬細(xì)胞中網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和巨噬細(xì)胞胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞。病毒進(jìn)入內(nèi)體中，在內(nèi)體內(nèi)發(fā)生脫殼，病毒核酸物質(zhì)通過(guò)微管系統(tǒng)遷移到病毒工廠進(jìn)行復(fù)制［2-3］。感染的巨噬細(xì)胞還可能通過(guò)分泌IL-1α、TNF-α 等細(xì)胞因子來(lái)誘導(dǎo)未感染的T、B 淋巴細(xì)胞大量凋亡，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能受損［4-5］。

目前，ASFV 中的p72、p30、p54 等蛋白的研究進(jìn)展已被許多綜述提及，而本文主要關(guān)注的是ASFV的CD2v 蛋白［6-7］。CD2v 是由ASFV 的EP402R 基因編碼的病毒外膜糖蛋白，也被稱(chēng)為pEP402R。它由402個(gè)氨基酸（amino acid，aa）構(gòu)成，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)大小為46.5 kD［8］。因其aa 序列與T 淋巴細(xì)胞表面黏附受體CD2 具有很高的相似性，被認(rèn)為是CD2 的同源物。CD2v在促進(jìn)病毒復(fù)制與傳播、病毒免疫逃逸等方面發(fā)揮著重要作用，也是ASFV 疫苗研究的熱點(diǎn)靶標(biāo)。

1 ASFV包膜蛋白CD2v的結(jié)構(gòu)特征

CD2v 是一種病毒包膜蛋白，其結(jié)構(gòu)被分為4 個(gè)結(jié)構(gòu)域：①20 個(gè)aa 構(gòu)成的N 端信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域［9］；②183 個(gè)aa 構(gòu)成的胞外結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域存在高度的糖基化現(xiàn)象［10］；③25 個(gè)aa 構(gòu)成的疏水跨膜區(qū)域；④174 個(gè)aa 構(gòu)成的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。當(dāng)ASFV 入侵宿主細(xì)胞后，CD2v 會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體中被切割，經(jīng)切割后產(chǎn)生的63 kD 的N 端以糖基化形式存在，而26 kD的C端以非糖基化形式存在［10］。

測(cè)序結(jié)果顯示，CD2v與CD2的胞外結(jié)構(gòu)域具有很高的相似性，但胞內(nèi)區(qū)域序列的相似性較低。CD2v C 端包含11 個(gè)重復(fù)的六肽序列PPPKPC，為CD2v 的特有序列。在C 端還存在一段富含脯氨酸的酸性結(jié)構(gòu)域，其功能尚未被解析。

2 CD2v在ASFV致病機(jī)制中的作用

2.1 介導(dǎo)紅細(xì)胞吸附，促進(jìn)病毒的體內(nèi)播散 大多數(shù)的ASFV 毒株都能誘導(dǎo)紅細(xì)胞吸附，其特征是豬紅細(xì)胞黏附在病毒感染細(xì)胞的表面，從而使得感染細(xì)胞能夠隨著紅細(xì)胞傳播。RODRíGUE 等［9］發(fā)現(xiàn)CD2v 的破壞會(huì)抑制ASFV 感染細(xì)胞與豬紅細(xì)胞的黏附能力，說(shuō)明CD2v 在介導(dǎo)感染細(xì)胞與紅細(xì)胞黏附中起主要作用，借此參與病毒的體內(nèi)播散。

CD2v能夠增加軟蜱中病毒的復(fù)制。ASFV可以在軟蜱體內(nèi)復(fù)制，存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3～5年，并可通過(guò)軟蜱叮咬傳播給家豬等易感動(dòng)物。ROWLANDS 等［11］發(fā)現(xiàn)天然低毒性ASFV 分離株NH/P68 基因組中CD2v 基因被破壞。他們通過(guò)在NH/P68 中過(guò)表達(dá)CD2v 基因，使其恢復(fù)了紅細(xì)胞吸附表型，并發(fā)現(xiàn)重組病毒在軟蜱中能夠建立持續(xù)感染，證明了CD2v蛋白具有介導(dǎo)紅細(xì)胞吸附并增加ASFV 在宿主中傳播功能。

2.2 協(xié)助病毒定位病毒工廠，促進(jìn)病毒的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制 CD2v的C端序列能夠幫助ASFV定位在病毒工廠（viral factory，VF）區(qū)域附近從而促使病毒的復(fù)制。在病毒的復(fù)制周期中，病毒在離散的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行蛋白翻譯和結(jié)構(gòu)組裝，該區(qū)域被稱(chēng)為“病毒工廠”。其定位特點(diǎn)為在工廠的外圍分布著磷酸化的翻譯起始復(fù)合物eIF4F。ASFV 晚期mRNA 以及核糖體、線粒體等細(xì)胞器也位于這些區(qū)域［12］。VF位于靠近細(xì)胞核的細(xì)胞質(zhì)中，由中間絲蛋白Vimentin所包繞［13］。GOATLEY 等［10］將V5 標(biāo)簽插在CD2v 基因的5'端，將HA 標(biāo)簽插在CD2v 基因的3'端，構(gòu)建成質(zhì)粒SV5CD2vHA。同時(shí)還構(gòu)建了1 個(gè)刪除了大部分胞內(nèi)序列的突變質(zhì)粒SV5CD2v-cytoHA。他們將2 種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后用ASFV BA71V 病毒毒株進(jìn)行感染，18 h后分別用抗V5抗體、抗HA抗體和抗VP72 抗體（針對(duì)ASFV 主要衣殼蛋白的抗體）對(duì)表達(dá)SV5CD2vHA 蛋白和SV5CD2v-cytoHA 蛋白的細(xì)胞進(jìn)行染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SV5CD2vHA蛋白無(wú)論是用抗V5 抗體還是用抗HA 抗體檢測(cè)，都與用抗VP72 抗體鑒定的病毒工廠共定位，而SV5CD2v-cytoHA 蛋白并沒(méi)有出現(xiàn)與病毒工廠共定位現(xiàn)象。因此推測(cè)SV5CD2v-cytoHA 中缺失的胞質(zhì)片段是CD2V蛋白定位在VF所必需的，即CD2v的C端序列能夠幫助其定位在VF附近，從而促進(jìn)病毒的復(fù)制。

2.3 影響病毒的體內(nèi)復(fù)制，但不影響病毒的毒力8-DR 和EP402R 均為編碼CD2v 的基因名稱(chēng)。BROCA 等［14］構(gòu)建了ASFV 分離株Malawi Lil-20/1 的基因缺失突變體Δ8-DR 及其回復(fù)突變體8-DR.R。在體外，Δ8-DR、8-DR.R 和親本病毒在豬巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中表現(xiàn)出難以區(qū)分的生長(zhǎng)特征。為了更詳細(xì)地比較它們致病力的差異，BROCA 等［15］將3 株病毒分別感染模型動(dòng)物。在感染后2 d、4 d、6 d 和8 d處死動(dòng)物并收集組織樣本，測(cè)量其中病毒的滴度。他們發(fā)現(xiàn)感染了Δ8-DR 病毒的豬淋巴組織和骨髓中病毒滴度較野生豬和8-DR.R 低，這表明CD2v 在一定程度上影響了病毒的體內(nèi)復(fù)制能力。但是他們也發(fā)現(xiàn)Δ8-DR、8-DR.R和親本病毒在模型動(dòng)物的疾病發(fā)作、病程和死亡率上都相似，因此CD2v 不影響病毒的毒力。與此一致的是，BROCA 等［15］發(fā)現(xiàn)從 ASFV 分離株Georgia2010 的基因組中刪除8DR基因（ASFV-G-Δ8-DR）并不會(huì)顯著改變病毒的毒力。他們證實(shí)感染ASFV-G-Δ8-DR 與親本病毒的動(dòng)物臨床癥狀非常相似，只是在病毒滴度上顯示出一些差異。除此之外，RAQUEL等［16］發(fā)現(xiàn)低毒性ASFV分離株NH/P68 除了包含8DR 的突變外，它還具有MGF360和505基因的缺失。已有研究表明MGF360和505 基因與ASFV 的毒力密切相關(guān)，這可能才是NH/P68 株毒力降低的主要原因［17］。綜上所述，雖然CD2v 影響病毒的體內(nèi)復(fù)制，但并不影響病毒的毒力。

2.4 參與病毒的免疫逃逸 CD2v 的C 端的重復(fù)序列PPPKPC與SH3P7蛋白的相互作用可能參與ASFV的免疫逃逸。KAY-JACKSON等［18］利用酵母雙雜交系統(tǒng)，將SH3P7基因分別與CD2vi（編碼221 aa～342 aa，包含C 端的重復(fù)序列）、CD2vii（編碼221 aa～306 aa，不包含C端的重復(fù)序列）、CD2viii（編碼297 aa～335 aa，僅包含C端的重復(fù)序列）基因共轉(zhuǎn)化酵母，通過(guò)檢測(cè)β-糖苷酶的表達(dá)來(lái)定位CD2v 與SH3P7 相互作用的區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有CD2vi 和CD2viii 出現(xiàn)了陽(yáng)性的相互作用，說(shuō)明CD2v通過(guò)C端的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)與SH3P7 相互作用。SH3P7 是一種多功能的銜接蛋白，它能夠偶聯(lián)細(xì)胞膜受體與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架參與淋巴細(xì)胞的活化，能夠通過(guò)GTPase依賴(lài)性方式定位在肌動(dòng)蛋白組裝的位點(diǎn)、細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的前沿，也能調(diào)節(jié)JNK1 的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程從而激活轉(zhuǎn)錄因子［19-20］。由于SH3P7 與肌動(dòng)蛋白組裝和高爾基體囊泡運(yùn)輸有關(guān)，因此CD2v 與SH3P7 的相互作用可能參與ASFV 感染的細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白絲的重排和高爾基體的功能，影響多種免疫分子包括細(xì)胞因子、黏附因子和主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）等的運(yùn)輸，從而影響免疫系統(tǒng)的識(shí)別［21］。

CD2v 與AP-1 的相互作用在免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。AP-1 是一種銜接蛋白，參與了蛋白質(zhì)從高爾基體到內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)［22］。它能募集網(wǎng)格蛋白形成囊泡并通過(guò)識(shí)別膜蛋白胞質(zhì)尾部的分類(lèi)信號(hào)在胞內(nèi)的“ 貨物”分類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用。 PéREZNú?EZ 等［23］發(fā)現(xiàn)CD2v 的羧基末端能夠與AP-1 結(jié)合，并且在ASFV 的感染過(guò)程中與AP-1 共定位在病毒工廠的周?chē)?。AP-1 已被證明能夠與多種病毒蛋白包括HIV-Nef 和BPV-E6 結(jié)合。這種相互作用被認(rèn)為能夠破壞宿主細(xì)胞胞內(nèi)一些物質(zhì)運(yùn)輸，在病毒感染細(xì)胞的免疫逃逸方面發(fā)揮作用。如在HIV 的感染中，AP-1 與HIV-Nef 蛋白的結(jié)合能夠?qū)HCⅠ隔離在細(xì)胞質(zhì)中，降低胞膜表面MHCⅠ類(lèi)分子的表達(dá)，從而使病毒感染細(xì)胞逃脫CTL 細(xì)胞的殺傷［24］。因此推測(cè)CD2v 和AP-1 的相互作用在ASFV 的免疫逃逸中具有重要作用，但目前尚缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

3 CD2v在ASFV疫苗研究中的應(yīng)用

3.1 基于CD2v 的ASFV 疫苗研究 迄今已有CD2v 應(yīng)用于減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA 疫苗和病毒載體疫苗的研究報(bào)道。MONTEAGUDO 等［25］刪除了強(qiáng)毒株BA71 的部分CD2v 基因（除了C 末端的其他序列），將其作為減毒活疫苗進(jìn)行動(dòng)物免疫。發(fā)現(xiàn)BA71ΔCD2v 能夠以劑量依賴(lài)的方式保護(hù)豬免受ASFV 的攻擊。 該疫苗不僅能夠抵抗同源的BA71 病毒攻擊，也能抵抗異源強(qiáng)毒株E75 的攻擊。BA71ΔCD2v 在COS-1 細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)良好而不影響其遺傳穩(wěn)定性、致病性和免疫原性，適合應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)，具有良好的疫苗生產(chǎn)和應(yīng)用前景。

RUIZ-GONZALVO 等［26］構(gòu)建了一種能夠表達(dá)CD2v 蛋白的重組桿狀病毒。利用3 只豬接種重組CD2v 蛋白后再用野生ASFV 病毒毒株E75 攻擊，最終3 只豬都獲得了保護(hù)性免疫并且產(chǎn)生了針對(duì)CD2v的特異性抗體。這些結(jié)果驗(yàn)證了CD2v蛋白作為ASFV亞單位疫苗的可行性。

在核酸疫苗研究中，ARGILAGUET 等［27］構(gòu)建了3 種質(zhì)粒：pCMV-PQ（表達(dá)p54 和p30 蛋白）、pCMVsHAPQ（表達(dá)p54、p30 和CD2v胞外端蛋白）和pCMV-UbsHAPQ（表達(dá)與泛素融合的p54、p30 和CD2v 胞外端蛋白）作為DNA 疫苗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有用pCMV-UbsHAPQ 免疫的豬能夠獲得部分免疫保護(hù)。因此推測(cè)，泛素化CD2v 蛋白可靶向蛋白酶體發(fā)生降解，參與MHCⅠ類(lèi)分子的遞呈途徑，激活特異性T 細(xì)胞免疫。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)pCMV-UbsHAPQ 免疫后的豬在ASFV 攻擊后，體內(nèi)CD8+T 細(xì)胞數(shù)量急劇擴(kuò)增，說(shuō)明機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)CD2v的特異性T細(xì)胞免疫與該疫苗的保護(hù)作用相關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)均提示CD2v可以作為ASFV疫苗設(shè)計(jì)和研發(fā)的靶點(diǎn)分子。

引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的另一種方法是使用病毒載體。BacMam 是一種基于桿狀病毒的載體，通過(guò)感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)靶基因。ARGILAGUET 等［28］構(gòu)建了承載CD2v、p54 和p30 基因的BacMam-sHAPQ 載體，免疫后通過(guò)用ASFV 進(jìn)行致死性攻擊來(lái)測(cè)試該疫苗的保護(hù)潛力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ASFV 感染后，免疫的6 只豬中有4 只豬獲得了保護(hù)性免疫，這種保護(hù)作用與疫苗接種后產(chǎn)生的病毒特異性T 細(xì)胞有關(guān)。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了CD2v 在未來(lái)疫苗開(kāi)發(fā)中的潛力。

3.2 CD2v 分子的抗原表位研究 BURMAKINA等［29-30］在CD2v中鑒定出了4個(gè)T細(xì)胞表位，2個(gè)位于胞外區(qū)，2 個(gè)位于胞內(nèi)區(qū)富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域內(nèi)。應(yīng)用IFN-γ ELISPOT 實(shí)驗(yàn)評(píng)估針對(duì)不同的CD2v 表位的應(yīng)答強(qiáng)度：在模型動(dòng)物被ASFV 攻擊7～10 d 后分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，接著通過(guò)IFN- γ ELISPOT 測(cè)定這些細(xì)胞與CD2v 的不同抗原肽孵育后T 細(xì)胞的應(yīng)答程度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)針對(duì)這4 個(gè)表位均出現(xiàn)了T 細(xì)胞應(yīng)答，而針對(duì)胞內(nèi)區(qū)富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域的T 細(xì)胞應(yīng)答更為強(qiáng)烈，說(shuō)明這2 個(gè)表位是免疫優(yōu)勢(shì)表位，也是疫苗設(shè)計(jì)的良好靶點(diǎn)。

MINMA 等［31］對(duì)ASFV 分離株Georgia 2007/1 的CD2v蛋白主要序列進(jìn)行了計(jì)算機(jī)分析，使用計(jì)算機(jī)模擬方法鑒定CD2v 蛋白的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞表位。通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)，在CD2v蛋白胞外區(qū)（17 aa～204 aa）中鑒定出了4 個(gè)B 細(xì)胞表位和5 個(gè)T 細(xì)胞表位。對(duì)鑒定出的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞表位進(jìn)行保守性分析后繪制了CD2v 蛋白序列中免疫表位分布的圖譜，為針對(duì)CD2v抗原的疫苗設(shè)計(jì)提供了幫助。

4 CD2在ASFV基因分型中的作用

SANNA 等［32］提出將CD2v 蛋白C 端重復(fù)六肽序列的基因作為一種新的遺傳標(biāo)記，對(duì)來(lái)自不同地區(qū)的ASFV 進(jìn)行基因分型，借此追蹤病毒毒株的起源與傳播。針對(duì)大量的撒丁島ASFV 樣本，對(duì)ASFV 中編碼p72蛋白、p54蛋白和中央可變區(qū)的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同病毒分離株的這些基因并無(wú)區(qū)別。但不同病毒毒株CD2v C 端重復(fù)六肽序列的重復(fù)數(shù)目不同，其基因長(zhǎng)度可用于不同病毒毒株的鑒別。MOLINI等［33］也證明CD2v C 端重復(fù)六肽序列可對(duì)納米比亞ASFV 進(jìn)行分型。因此，CD2v 可以作為不同ASFV病毒毒株的鑒別標(biāo)志。

5 小結(jié)及展望

CD2v 作為一種結(jié)構(gòu)蛋白，在ASFV 復(fù)制、體內(nèi)播散和免疫逃逸中發(fā)揮著重要的作用。CD2v 可以通過(guò)介導(dǎo)紅細(xì)胞吸附增加ASFV 在宿主中的播散；C 端能幫助病毒定位VF 促進(jìn)病毒的復(fù)制；它還可以與SH3P7 蛋白和AP-1 蛋白相互作用參與病毒的免疫逃逸。對(duì)CD2v 蛋白結(jié)構(gòu)和功能的解析促進(jìn)了它的應(yīng)用研究。研究人員以CD2v 為靶點(diǎn)進(jìn)行了減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA 疫苗和病毒載體疫苗的研究，以CD2v 的C 端為遺傳標(biāo)記進(jìn)行ASFV 基因分型。

但是對(duì)于CD2v 蛋白的結(jié)構(gòu)解析和功能還有許多未解之處：比如目前只解析出CD2v 在體內(nèi)能夠被加工成3 種形式，但是并沒(méi)有確定加工位點(diǎn)及加工后產(chǎn)物的功能。CD2v 蛋白介導(dǎo)感染細(xì)胞與紅細(xì)胞的黏附，但是它位于紅細(xì)胞上的受體尚未找到。CD2v 蛋白C 端的重復(fù)六肽序列PPPKPC 和富含脯氨酸的酸性結(jié)構(gòu)域是ASFV 的特異性序列，它們的功能也尚未明確。CD2v 蛋白介導(dǎo)病毒的免疫逃逸機(jī)制仍未完全證實(shí)。對(duì)于這些問(wèn)題的進(jìn)一步解決可以幫助人們更加深入地了解ASFV，為非洲豬瘟的防治提供幫助。