慢性皮膚創(chuàng)面免疫微環(huán)境的特點(diǎn)及調(diào)控①

舒文韜 郭長松 王軼楠

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院臨床研究部生物樣本庫,長春 130000)

糖尿病、惡性腫瘤、感染等慢性疾病患者日益增多，全世界有650多萬慢性皮膚創(chuàng)面患者，治療慢性皮膚創(chuàng)面的總醫(yī)療費(fèi)用每年超過250億美元[1-2]。然而，在過去的一個世紀(jì)里，臨床治療方法和創(chuàng)面護(hù)理的創(chuàng)新一直不夠[3]。在健康的生理?xiàng)l件下，皮膚創(chuàng)面愈合是一個高度有序的生物過程，由不同免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞通過信號介質(zhì)的溝通機(jī)制協(xié)調(diào)[4-5]。如果愈合過程不順利，急性皮膚創(chuàng)面將演變?yōu)槁云つw創(chuàng)面。一般來說，3個月內(nèi)無法通過正常、有序、及時的修復(fù)過程達(dá)到解剖和功能上的完整性即被認(rèn)定為慢性皮膚創(chuàng)面[6]。慢性皮膚創(chuàng)面的分類是多種多樣的，大量促炎細(xì)胞因子、蛋白酶和活性氧(reactive oxygen species,ROS)在慢性皮膚創(chuàng)面的形成中起關(guān)鍵作用[7]。在創(chuàng)面免疫微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞對愈合進(jìn)程產(chǎn)生的不利影響尤為突出[8-9]。而在細(xì)胞因子方面，慢性皮膚創(chuàng)面局部細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和TNF-α等相關(guān)因子的高水平表達(dá)是導(dǎo)致創(chuàng)面無法正常完成愈合階段的罪魁禍?zhǔn)譡10]。在眾多針對改善慢性皮膚創(chuàng)面免疫微環(huán)境的手段中，生物材料的應(yīng)用取得了較好的療效。本文將介紹慢性皮膚創(chuàng)面的成因、免疫微環(huán)境的形成機(jī)制，并對近年來國內(nèi)外利用相關(guān)藥物及生物材料調(diào)控免疫微環(huán)境的研究加以綜述。

1 慢性皮膚創(chuàng)面的成因及免疫微環(huán)境的形成機(jī)制

1.1皮膚創(chuàng)面的正常愈合過程 皮膚在損傷后會進(jìn)入一個動態(tài)的、高度可控的恢復(fù)過程，該過程中涉及的不同類型的細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信號通路已得到廣泛研究[11]。這一過程包括4個連續(xù)的、部分交織的階段：止血、炎癥、增殖和組織重塑，代表了大多數(shù)組織的修復(fù)原則。止血期形成的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)不僅有助于增強(qiáng)屏障功能，還能促進(jìn)細(xì)胞遷移和成纖維細(xì)胞增殖。局部中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的增加代表進(jìn)入炎癥期，通常持續(xù)不到1周。在增殖期，角質(zhì)形成，細(xì)胞遷移到受損真皮后，肉芽組織取代了止血期間形成的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，這種新的基質(zhì)有助于角質(zhì)形成細(xì)胞的成熟，完成上皮化過程。損傷后2周可開始組織重塑，持續(xù)時間可達(dá)1年[11-12]。

1.2慢性皮膚創(chuàng)面的形成原因 影響慢性皮膚創(chuàng)面形成的因素是多樣化的。局部壞死組織的存在、各種病原體引起的感染增多、局部血管條件差和過度分泌的促炎細(xì)胞因子、蛋白酶和ROS等都可導(dǎo)致創(chuàng)面停滯在炎癥反應(yīng)階段，無法正常愈合。此外，部分創(chuàng)面還可能在組織重塑階段形成嚴(yán)重的疤痕增生或瘢痕疙瘩而無法愈合[6,13]。

慢性皮膚創(chuàng)面形成的基礎(chǔ)疾病包括糖尿病、心腦血管疾病、惡性腫瘤和免疫抑制狀態(tài)，以及局部血管疾病、感染和重復(fù)性創(chuàng)傷。傷口愈合不良的特征包括慢性炎癥、細(xì)胞衰老、不良的細(xì)胞因子環(huán)境和嚴(yán)重的細(xì)菌定植[14]。根據(jù)病因，慢性皮膚創(chuàng)面發(fā)生率最高的類別是糖尿病性足潰瘍(diabetic foot ulcers，DFUs)、下肢靜脈潰瘍(venous leg ulcers，VLUs)和壓力性潰瘍(pressure ulcers，PUs)[15]。DFUs是糖尿病患者最常見的慢性并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致患者下肢截肢的主要原因[16]。VLUs的主要病因是靜脈瓣膜功能不全和小腿肌肉泵功能不全，導(dǎo)致靜脈瘀血和高血壓，進(jìn)而由于下肢靜脈壓力過大，導(dǎo)致靜脈血流量異常，最終在小腿皮膚上形成慢性潰瘍[17-18]。PUs是皮膚或皮下軟組織的局部損傷，表現(xiàn)為皮膚完整或開放性潰瘍，可能伴有疼痛，通常發(fā)生在骨突出的部位或醫(yī)療器械的壓迫部位[19]。損傷發(fā)生的主要因素包括應(yīng)力因素(如抗壓強(qiáng)度和持續(xù)時間)和組織耐受性，主要受患者自身因素和外部微環(huán)境的影響[20-21]。

1.3慢性皮膚創(chuàng)面局部免疫微環(huán)境的形成機(jī)制 固有免疫介導(dǎo)的初始監(jiān)視在創(chuàng)面愈合進(jìn)程中對病原體和壞死組織的清除至關(guān)重要[22]。在創(chuàng)面愈合前期，Toll樣受體識別來自壞死組織和受損細(xì)胞外基質(zhì)的信號以激活組織中的巨噬細(xì)胞，并募集其他炎癥相關(guān)細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞。中性粒細(xì)胞產(chǎn)生抗菌物質(zhì)并分泌細(xì)胞因子，肥大細(xì)胞可繼續(xù)招募中性粒細(xì)胞到損傷部位，并分泌細(xì)胞因子激活組織駐留的巨噬細(xì)胞。細(xì)胞因子的分泌將進(jìn)一步介導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)的激活，T、B等淋巴細(xì)胞活化，促使炎癥反應(yīng)持續(xù)，最終導(dǎo)致慢性皮膚創(chuàng)面形成[23]。

與正常創(chuàng)面相比，慢性皮膚創(chuàng)面中的趨化因子表達(dá)失調(diào)和延長導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤過度和持續(xù)。盡管免疫細(xì)胞的初始浸潤受到損害，但一旦激活，創(chuàng)面處會產(chǎn)生高炎癥反應(yīng)，促使炎癥細(xì)胞因子過度產(chǎn)生并損害其他對愈合至關(guān)重要的事件和過程，例如成纖維細(xì)胞的遷移和增殖，膠原蛋白的合成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞和血管前體細(xì)胞的凋亡。NF-κB調(diào)節(jié)的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)產(chǎn)生也會增加，導(dǎo)致細(xì)胞外過量基質(zhì)破壞和肉芽組織形成嚴(yán)重受損[24]。特別是中性粒細(xì)胞通過在慢性皮膚創(chuàng)面中上調(diào)MMP-8和下調(diào)MMP抑制劑金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP1)的釋放而導(dǎo)致這些破壞性創(chuàng)面的狀況[25]。其中糖尿病創(chuàng)面是慢性皮膚創(chuàng)面中的一種，這種病理性炎癥是通過過度的TLR激活介導(dǎo)的。會導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子如IL-6、IL-8和MCP-1表達(dá)量相應(yīng)增加。TLR介導(dǎo)的炎癥異常還會導(dǎo)致肥大性瘢痕形成，促使創(chuàng)面過度愈合。由于過度生產(chǎn)細(xì)胞外基質(zhì)成分(如膠原蛋白)，會在創(chuàng)傷后產(chǎn)生肥厚性疤痕[26]。

2 調(diào)控免疫細(xì)胞，改善慢性皮膚創(chuàng)面免疫微環(huán)境

2.1天然免疫細(xì)胞

2.1.1巨噬細(xì)胞 巨噬細(xì)胞是被招募到創(chuàng)面部位最重要的細(xì)胞。在炎癥早期，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出促炎表型，釋放促炎介質(zhì)，如TNF-α、NO和IL-6，并產(chǎn)生蛋白酶和ROS來對抗病原微生物。此外，巨噬細(xì)胞還會吞噬創(chuàng)面碎片和凋亡細(xì)胞[27]。對凋亡細(xì)胞的吞噬會將促炎巨噬細(xì)胞(M1型)轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡拙奘杉?xì)胞(M2型)，以完成炎癥階段向ECM重塑階段的轉(zhuǎn)化，抗炎表型的巨噬細(xì)胞有助于再上皮化、膠原蛋白沉積、血管生成、肉芽組織形成和創(chuàng)面修復(fù)[28-29]。功能失調(diào)的巨噬細(xì)胞與慢性皮膚創(chuàng)面的延遲愈合有關(guān)。然而，在創(chuàng)面愈合進(jìn)程中對巨噬細(xì)胞功能有決定性影響的因素尚不明確。有文獻(xiàn)報(bào)道，過氧化物酶體增殖激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)家族分子可能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能調(diào)控慢性皮膚創(chuàng)面愈合。PPARs屬于核受體超家族的配體激活轉(zhuǎn)錄因子，有3個同種型，PPARα、PPARβ/δ和PPARγ。其中，PPARγ是轉(zhuǎn)錄協(xié)調(diào)巨噬細(xì)胞功能的關(guān)鍵因素[30-31]。CHEN等[32]研究發(fā)現(xiàn)，慢性皮膚創(chuàng)面局部巨噬細(xì)胞表面PPARγ表達(dá)上調(diào)。為了探究PPARγ的表達(dá)對慢性皮膚創(chuàng)面局部巨噬細(xì)胞功能的影響，該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了巨噬細(xì)胞PPARγ敲除(PPARγ-KO)小鼠，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，PPARγ-KO小鼠創(chuàng)面局部巨噬細(xì)胞釋放更多的TNF-α；且PPARγ的缺乏下調(diào)了CD36、Mertk、Mfge8、C1qb和C1qc在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，從而降低巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬作用。CD36和Mertk是細(xì)胞表面受體，是凋亡細(xì)胞正確結(jié)合和隨后內(nèi)在化所必需的。Mfge8、Gas6和C1q亞基(C1qb和C1qc)是調(diào)理素，其與凋亡細(xì)胞表面結(jié)合以啟動吞噬作用。由此推測PPARγ對于創(chuàng)面局部巨噬細(xì)胞功能的發(fā)揮，如對凋亡細(xì)胞的吞噬、抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生、促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生等非常重要。巨噬細(xì)胞的表型隨著創(chuàng)面愈合過程中局部免疫微環(huán)境的變化而發(fā)生改變，在愈合早期，以CD11b+/F4/80+/Ly6Chi巨噬細(xì)胞為主，發(fā)揮M1型巨噬細(xì)胞的促炎作用；進(jìn)入中期愈合后，CD11b+/F4/80+/Ly6Chi巨噬細(xì)胞比例下降，表達(dá)甘露糖受體(CD206)的M2型巨噬細(xì)胞比例增加，通過分泌產(chǎn)生IL-10、TGF-β和VEGF等細(xì)胞因子發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。SHOOK等[33]的研究進(jìn)一步探索了表達(dá)CD301b的巨噬細(xì)胞亞群在皮膚創(chuàng)面愈合中的作用。研究者通過白喉毒素介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞耗竭小鼠模型表明，表達(dá)CD301b的中期巨噬細(xì)胞的選擇性清除與多種髓系細(xì)胞清除會產(chǎn)生表型一致的傷口愈合缺陷；此外，將流式分選的髓系細(xì)胞亞群移植到同基因小鼠的3D創(chuàng)面時，只有CD206+/CD301b+巨噬細(xì)胞顯著促進(jìn)增殖和成纖維細(xì)胞群重建。這些數(shù)據(jù)表明，在皮膚修復(fù)中期，表達(dá)CD301b的巨噬細(xì)胞亞群對修復(fù)過程的激活至關(guān)重要。

在慢性皮膚創(chuàng)面修復(fù)的過程中，將巨噬細(xì)胞從M1表型切換到M2表型是一種具有應(yīng)用潛力的治療策略?；诓煌愋途奘杉?xì)胞發(fā)揮不同作用的特點(diǎn)，巨噬細(xì)胞原位活化或外源巨噬細(xì)胞添加的策略有助于巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變，從而改善創(chuàng)面修復(fù)[34-35]。然而，創(chuàng)面環(huán)境復(fù)雜，其中的多種蛋白水解酶會造成相關(guān)因子的半衰期縮短，限制其作用。補(bǔ)充的外源性M2或M1減毒可能會導(dǎo)致免疫失衡，并形成可能導(dǎo)致胰島素抵抗的促炎環(huán)境[36-37]。因此，GAN等[38]從安全角度出發(fā)，設(shè)計(jì)和開發(fā)了一種魔芋葡甘露聚糖修飾的SiO2納米顆粒，該納米粒子可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表面CD206的納米簇的聚集，研究表明CD206分子的聚集不僅是巨噬細(xì)胞表型的變化，也改變了巨噬細(xì)胞的功能，促使炎癥性巨噬細(xì)胞極化為M2型巨噬細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示損傷后第7天，納米粒子組創(chuàng)面組織中F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞(M2型)數(shù)量明顯高于對照組，創(chuàng)面中F4/80+/CD86+巨噬細(xì)胞(M1型)數(shù)量減少。納米粒子組中創(chuàng)面炎癥細(xì)胞因子，包括TNF-α和IL-6的水平明顯降低，說明該材料本身具有抗炎作用并促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

2.1.2中性粒細(xì)胞 中性粒細(xì)胞是參與創(chuàng)面早期愈合的主要白細(xì)胞。細(xì)菌內(nèi)毒素，例如脂多糖(LPS)，會刺激中性粒細(xì)胞釋放由細(xì)胞毒性蛋白的濃縮染色質(zhì)形成的胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)，NETs的宿主防御機(jī)制主要通過釋放其核和顆粒內(nèi)含物以遏制和殺死病原體[39]。但過量的NETs也可引起組織損傷。WONG等[40]研究發(fā)現(xiàn)，從糖尿病患者和小鼠分離的中性粒細(xì)胞被引發(fā)釋放NETs，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合進(jìn)程延遲，其原因可能與肽染色質(zhì)精氨酸脫亞氨酶4(PAD4，在小鼠中由Padi4編碼)在糖尿病患者的中性粒細(xì)胞中表達(dá)升高，以及糖尿病小鼠創(chuàng)面中瓜氨酸化組蛋白H3(H3Cit，一種NETs標(biāo)記)的含量升高有關(guān)，而以脫氧核糖核酸酶Ⅰ破壞NETs可加速糖尿病患者和正常血糖小鼠的創(chuàng)面愈合。因此，NETs會損害創(chuàng)面的愈合，尤其是在糖尿病慢性皮膚創(chuàng)面中；而抑制NETs的產(chǎn)生或裂解NETs可以改善慢性皮膚創(chuàng)面炎癥，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

有研究者針對中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)和NETs的產(chǎn)生有另外的發(fā)現(xiàn)。與樹突狀細(xì)胞相關(guān)的C型凝集素2(dectin-2)識別α-甘露聚糖在內(nèi)的真菌多糖后會引發(fā)先天免疫應(yīng)答[41]。MIURA等[42]以dectin-2缺陷型小鼠為研究模型確定了dectin-2缺乏癥和α-甘露聚糖的施用如何影響創(chuàng)面愈合過程。NETs含有高濃度的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，α-甘露聚糖給藥可加速中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的合成，用中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑進(jìn)行治療可改善α-甘露聚糖導(dǎo)致的創(chuàng)面愈合延遲。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶不僅是NETs的成分之一，而且是NETs形成的誘導(dǎo)劑。給予甘露聚糖增加的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶可能通過誘導(dǎo)NETs的形成而損害皮膚創(chuàng)面的愈合。這項(xiàng)研究表明，dectin-2介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)對創(chuàng)面愈合和中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)，包括NETs的形成具有深遠(yuǎn)影響。NETs的抗菌防御及其蛋白質(zhì)負(fù)載的機(jī)制仍是未知之?dāng)?shù)。LL-37是一種抗菌肽，由包括中性粒細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型分泌產(chǎn)生，在防御細(xì)菌和真菌感染中具有重要作用[43]。LL-37-DNA復(fù)合物與自身免疫和慢性炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。ATHANASIOS等[44]證明了大環(huán)內(nèi)酯類抗生素克拉霉素可誘導(dǎo)LL-37-DNA復(fù)合物的形成，特別是帶有LL-37的NETs，其具有有效的抗菌活性?？死顾乜赏ㄟ^進(jìn)一步提高NETs上的LL-37水平顯著改善LL-37介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的抗菌活性和皮膚成纖維細(xì)胞的愈合能力。

以上研究表明，改善糖尿病創(chuàng)面延遲愈合的最簡單直接的方法就是減少NETs產(chǎn)生。而抑制PAD4可通過控制組蛋白瓜氨酸化阻礙NETs產(chǎn)生，為推進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合過程提供了可行方法。KAUR等[45]在此思路上選用了Thr-Asp-F-amidine(TDFA)這種三肽(蘇氨酸，天冬氨酸和鳥氨酸)，TDFA是第2代不可逆抑制劑，可修飾PAD4酶的活性位點(diǎn)殘基。隨后，該團(tuán)隊(duì)以藻酸鹽和明膠作為基質(zhì)，開發(fā)了一種包含TDFA的藻酸鹽-明膠甲基丙烯酰胺基支架。用糖尿病大鼠模型實(shí)驗(yàn)證明，與對照組相比，該支架的使用可使創(chuàng)面處的瓜氨酸化減少并抑制創(chuàng)面處的PAD4酶，導(dǎo)致NETs釋放減少。這種抑制NETs的方法加速了高血糖大鼠的創(chuàng)面愈合進(jìn)程。

2.1.3肥大細(xì)胞 肥大細(xì)胞(mast cells,MCs)有助于常規(guī)創(chuàng)面的愈合，在炎癥期，MCs招募中性粒細(xì)胞到損傷部位，并分泌細(xì)胞因子激活組織駐留的巨噬細(xì)胞。在創(chuàng)面愈合進(jìn)程處于增殖階段時，MCs通過分泌IL-4、VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長因子刺激成纖維細(xì)胞增殖[46]。

TELLECHEA等[47]應(yīng)用糖尿病小鼠皮膚損傷模型研究了MCs在糖尿病皮膚愈合中的作用及機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者和糖尿病小鼠中，未受傷的皮膚中脫顆粒的MCs數(shù)量與正常人或非糖尿病小鼠相比明顯增加。皮膚損傷后，非糖尿病小鼠皮膚中的MCs會發(fā)生大量的脫顆粒，而糖尿病小鼠中沒有觀察到MCs脫顆粒現(xiàn)象，這可能與糖尿病小鼠對損傷發(fā)生急性炎癥反應(yīng)的功能障礙有關(guān)。用MCs脫顆粒抑制劑色甘酸二鈉預(yù)處理糖尿病小鼠皮膚，阻斷創(chuàng)傷前MCs脫顆?？筛纳铺悄虿⌒∈蟮膭?chuàng)面愈合并促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化。然而，令研究者意想不到的是，MCs缺陷小鼠無論是否有糖尿病，其創(chuàng)面愈合都受到損害，提示創(chuàng)傷前MCs脫顆粒可能抑制之后的創(chuàng)面愈合，而創(chuàng)傷后MCs的脫顆粒促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，并且MCs分泌的某些調(diào)節(jié)因子，如VEGF對于創(chuàng)面達(dá)到最佳愈合效果是必需的。

TELLECHEA ANA研究團(tuán)隊(duì)在以上研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用藻酸鹽繃帶實(shí)現(xiàn)MCs脫顆粒抑制劑MCS-01在皮膚創(chuàng)面局部的持續(xù)可控性釋放、在糖尿病小鼠促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，其機(jī)制可能是通過改變巨噬細(xì)胞極化、促進(jìn)急性炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞向創(chuàng)面的遷移及活化NK-κB信號通路實(shí)現(xiàn)的。因此，對于皮膚創(chuàng)面局部MCs功能的精準(zhǔn)調(diào)控將有可能促進(jìn)糖尿病足部潰瘍的修復(fù)效果[48]。

2.2獲得性免疫細(xì)胞

2.2.1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 表達(dá)Foxp3的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells,Tregs)駐留在組織中控制炎癥并介導(dǎo)組織特定的功能。小鼠和人類的皮膚含有大量Treg細(xì)胞。NOSBAUM等[49]研究表明Treg細(xì)胞促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合。創(chuàng)面處的Tregs減少了IFN-γ的產(chǎn)生和促炎性巨噬細(xì)胞的積累。此外，皮膚中的Tregs在創(chuàng)傷后早期誘導(dǎo)EGFR表達(dá)，并通過這一途徑減輕創(chuàng)傷相關(guān)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)傷的正常修復(fù)。而Tregs中EGFR的譜系特異性缺失會減少創(chuàng)面處Tregs的聚集和活化，從而導(dǎo)致創(chuàng)面延遲愈合和促炎巨噬細(xì)胞增加。

2.2.2B細(xì)胞 有文獻(xiàn)報(bào)道，B細(xì)胞可作為組織再生的強(qiáng)大調(diào)節(jié)劑[50]。其中創(chuàng)面ECM成分可誘導(dǎo)創(chuàng)面B細(xì)胞中CD19依賴性TLR信號傳導(dǎo)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β產(chǎn)生，直接減少炎癥反應(yīng)[51]。B細(xì)胞產(chǎn)生的IgG1免疫球蛋白有助于損傷部位死亡細(xì)胞的調(diào)理，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的清除功能。SIRBULESCU等[52]把分離得到的成熟天然B細(xì)胞應(yīng)用到糖尿病鼠創(chuàng)面處，在治療后第4天發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面處細(xì)胞凋亡明顯減少，成纖維細(xì)胞增殖增強(qiáng)。在肉芽組織中，主要的活化生長因子(如TGF-β)表達(dá)增加。同時，與鹽水對照組相比，在B細(xì)胞治療的傷口中MMP2(一種衡量慢性傷口的指標(biāo))表達(dá)降低。因此，B細(xì)胞的存在可降低傷口微環(huán)境的蛋白水解特性，防止組織降解，有效地改變創(chuàng)面微環(huán)境中成熟免疫細(xì)胞群體的平衡并加速愈合過程[52]。

3 調(diào)控免疫相關(guān)因子改善慢性皮膚創(chuàng)面免疫微環(huán)境

3.1白介素類 慢性皮膚創(chuàng)面局部存在大量炎癥細(xì)胞因子IL-6。各種類型的細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，都會產(chǎn)生IL-6[53-54]。IL-6是一種M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)的炎癥因子，調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸，參與單核細(xì)胞趨化、血管生成和膠原積累[55]。創(chuàng)傷發(fā)生前和創(chuàng)面愈合早期，非糖尿病和糖尿病小鼠皮膚或創(chuàng)面處IL-6的表達(dá)情況存在顯著差異。創(chuàng)傷前糖尿病小鼠皮膚中IL-6已經(jīng)上調(diào)，提示局部是一種持續(xù)炎癥狀態(tài)。創(chuàng)傷后早期階段，非糖尿病創(chuàng)面IL-6表達(dá)明顯高于糖尿病創(chuàng)面。因此，在創(chuàng)面愈合早期降低的IL-6水平可能會對隨后的創(chuàng)面愈合階段產(chǎn)生不利影響。此外，由于糖尿病創(chuàng)面長期暴露于高水平IL-6的環(huán)境中，IL-6受體(IL-6R)反應(yīng)可能減弱，促使細(xì)胞對傷后IL-6水平的增加脫敏，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合延遲[56]。在非糖尿病鼠創(chuàng)面處，IL-6通過激活p38 MAPK和PI3K/Akt信號通路來刺激成纖維細(xì)胞遷移；但在糖尿病小鼠成纖維細(xì)胞中，這些信號通路都是異常的[57]。

IL-8是一種趨化因子。多形核中性粒細(xì)胞(PMN)和炎癥性單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞不受控制的激活會導(dǎo)致創(chuàng)面組織破壞，進(jìn)而導(dǎo)致包括趨化因子在內(nèi)的炎癥性介質(zhì)大量產(chǎn)生。這種主要基于MCP-1和IL-8的持久趨化因子梯度會促使創(chuàng)面持續(xù)受損，導(dǎo)致慢性皮膚創(chuàng)面形成[58-60]。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)在慢性創(chuàng)傷的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，TLR9是參與先天免疫調(diào)節(jié)的主要受體。TLR9主要在人類的B細(xì)胞和髓系細(xì)胞亞群中表達(dá)，參與系統(tǒng)和局部炎癥反應(yīng)。TLR9的激活可誘導(dǎo)髓系細(xì)胞釋放促炎分子(如IL-8)，IL-8通過氧化應(yīng)激增加，該氧化應(yīng)激導(dǎo)致炎癥細(xì)胞募集，從而進(jìn)一步增加氧化應(yīng)激，導(dǎo)致在高葡萄糖環(huán)境中發(fā)生局部炎癥，引起持續(xù)性傷口炎癥，最終導(dǎo)致糖尿病足潰瘍[61]。

輔助性T細(xì)胞17(Th17)通過釋放IL-17促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集和活化，促進(jìn)炎癥發(fā)生。局部和全身性Th-17免疫反應(yīng)也會導(dǎo)致IL-22水平升高。IL-22通過ERK/MAPK信號傳導(dǎo)增強(qiáng)緊密連接的形成，并在黏膜界面上調(diào)緊密連接蛋白，增強(qiáng)皮膚、肺和腸的屏障功能，從而幫助維持黏膜免疫。Th-17通過這種方式細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫和宿主上皮穩(wěn)態(tài)，尤其是在宿主/環(huán)境界面。雖然Th-17反應(yīng)降低可能會減少細(xì)菌清除并增加上皮細(xì)胞的脆弱性，但不受控制的Th-17效應(yīng)可能會誘發(fā)自身免疫性疾病[62]。有研究者應(yīng)用IL-17缺陷小鼠觀察IL-17在糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合中的作用，研究發(fā)現(xiàn)IL-17缺陷小鼠體內(nèi)表達(dá)促愈合分子CD206的炎癥性巨噬細(xì)胞減少，創(chuàng)面愈合明顯加速，表明糖尿病小鼠體內(nèi)IL-17的抑制可能通過改變巨噬細(xì)胞的極化促進(jìn)創(chuàng)面的愈合[63]。

IL-33作為Th-2型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)劑，在激活Th-2相關(guān)反應(yīng)、加速中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集、誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞和MCs脫顆粒等方面具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能，IL-33治療的糖尿病小鼠再上皮化和新生血管顯著改善，膠原沉積增強(qiáng)，創(chuàng)面愈合明顯加快，同時，創(chuàng)面部位的白細(xì)胞浸潤明顯增加，特別是M2型極化的巨噬細(xì)胞。此外，應(yīng)用IL-33體外擴(kuò)增的M2型巨噬細(xì)胞明顯有助于成纖維細(xì)胞增殖和ECM產(chǎn)生。這些現(xiàn)象表明IL-33在促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合中起至關(guān)重要的作用[64]。

針對炎癥相關(guān)因子的相關(guān)治療手段很多，生物材料的應(yīng)用成為一大熱門。新型水細(xì)胞泡沫敷料(hydrocellular foam dressings，HCFs)是新開發(fā)的適用于中重度創(chuàng)面的敷料，可為創(chuàng)面提供較豐富的創(chuàng)傷相關(guān)組織液的濕潤的微環(huán)境。HCFs與創(chuàng)面的接觸層是非黏附性的，因此不會黏附于創(chuàng)面處；防水外層有助于防止細(xì)菌污染。YAMANE等[65]研究表明，HCFs除了作為敷料自身對創(chuàng)面的保護(hù)作用以外，還能顯著降低大鼠創(chuàng)面周圍皮膚和肉芽組織中炎癥因子IL-1、IL-6和IL-10的基因表達(dá)水平，防止過度炎癥對組織的損傷，并促進(jìn)局部的再上皮化，促進(jìn)了創(chuàng)面的愈合。AMIN等[66]比較了中藥蜂毒與雙氯芬酸水凝膠對慢性皮膚創(chuàng)面的抗炎作用。該團(tuán)隊(duì)利用冷凍融化的方法將蜂毒加入聚乙烯醇(PVA)/殼聚糖(CS)基水凝膠中。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，該蜂毒PVA/CS水凝膠提高了羥脯氨酸和谷胱甘肽的基因表達(dá)水平，降低了IL-6水平，其抗炎作用可與雙氯芬酸水凝膠相媲美。

3.2MCP-1 MCP-1/CCL2是調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞遷移的關(guān)鍵趨化因子之一。早期炎癥反應(yīng)主要由外周血中募集的單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(MoMφs)調(diào)控，而單核細(xì)胞到創(chuàng)面的早期招募依賴于各種受體和信號分子的產(chǎn)生[67]。趨化因子受體2(CCR2)是主要存在于MoMφ上的趨化因子受體，該趨化因子的作用是維持循環(huán)中單核細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)水平，并引導(dǎo)MoMφs募集到組織損傷部位，對于全身性炎癥期間單核細(xì)胞從骨髓中趨化到外周的過程至關(guān)重要[68]。在初始組織損傷時，CCR2的主要配體之一,趨化因子受體配體2(CCL2)，又名MCP-1，在創(chuàng)面局部產(chǎn)生增加，該配體與存在于Ly6Chi單核細(xì)胞上的CCR2受體結(jié)合，將單核細(xì)胞招募到創(chuàng)面局部，標(biāo)志著巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的傷口愈合炎癥階段的開始[69]。高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖狀態(tài)中，肥大脂肪細(xì)胞表面MCP-1/CCL2和受體CCR2表達(dá)增高，MCP-1產(chǎn)生增加，促進(jìn)單核細(xì)胞大量募集，并在局部分化為M1巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞在炎癥狀態(tài)下，90%以上分化為M1巨噬細(xì)胞，并能影響T細(xì)胞免疫。CCL2表達(dá)與Th2細(xì)胞極化反應(yīng)的發(fā)展相關(guān)，CCL2是Th0細(xì)胞向Th2表型極化的有利因素[70]。于是，有研究者提出了一種通過靜電紡絲將姜黃素/明膠混合成納米纖維氈，以充分提高疏水性姜黃素用于創(chuàng)面修復(fù)的生物利用度的方法，在愈合過程中釋放出的姜黃素具有協(xié)同信號傳導(dǎo)作用：①通過激活Wnt信號通路動員創(chuàng)面成纖維細(xì)胞；②通過降低成纖維細(xì)胞MCP-1的表達(dá)持續(xù)抑制炎癥反應(yīng)[71]。

3.3TNF-α TNF-α是一種由脂多糖刺激巨噬細(xì)胞分泌的炎癥細(xì)胞因子，被認(rèn)為是慢性皮膚創(chuàng)面愈合延遲的主要致病因素?？筎NF-α的治療對創(chuàng)面修復(fù)表現(xiàn)出積極作用[72]。TNF-α通過增加黏附分子表達(dá)促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其從血管間隙遷移到炎癥部位[73]。在慢性皮膚創(chuàng)面如糖尿病創(chuàng)面高糖環(huán)境中，大量M1型巨噬細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致過量的TNF-α表達(dá)。而TNF-α的表達(dá)上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞中TIMP1表達(dá)，并促使角質(zhì)形成細(xì)胞遷移受損，最終導(dǎo)致糖尿病狀況下創(chuàng)面愈合受損。因此，靶向TNF-α是促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的重要治療方法[74]。TNF-α介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化對慢性皮膚創(chuàng)面的形成具有重要意義，KUSNADI等[75]應(yīng)用人源原代巨噬細(xì)胞進(jìn)行TNF反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀基因組分析，研究表明TNF刺激激活SREBP2(膽固醇生物合成基因的主要調(diào)節(jié)劑)，并擴(kuò)展了SREBP2的基因譜，包括結(jié)合并激活炎癥和干擾素反應(yīng)的基因組。在腹膜炎和皮膚創(chuàng)傷愈合模型中，SREBP功能的遺傳阻斷可使巨噬細(xì)胞極化平衡從炎癥轉(zhuǎn)變?yōu)樾迯?fù)表型。髓系細(xì)胞中SREBP活性的基因阻斷或皮膚局部SREBP抑制劑的應(yīng)用可以改善炎癥狀況下慢性皮膚創(chuàng)面的愈合。

4 總結(jié)與展望

慢性皮膚創(chuàng)面因原發(fā)疾病的不同具有多種特點(diǎn)，但在皮膚局部免疫微環(huán)境上具有許多共同特征。本文從構(gòu)成慢性皮膚創(chuàng)面獨(dú)特免疫微環(huán)境的免疫細(xì)胞入手，闡述了創(chuàng)面愈合不同階段免疫細(xì)胞及相關(guān)效應(yīng)分子的動態(tài)變化、相互作用及機(jī)制。進(jìn)而對以免疫細(xì)胞功能調(diào)控和效應(yīng)分子分泌調(diào)節(jié)為治療靶點(diǎn)，各種新型生物材料、生物制劑，如納米粒子、抗菌肽、生物敷料、體外活化或誘導(dǎo)分化的免疫細(xì)胞在慢性皮膚創(chuàng)面愈合中的應(yīng)用效果及前景進(jìn)行了綜述。

盡管臨床應(yīng)用及基礎(chǔ)研究的敷料多種多樣，但針對慢性皮膚創(chuàng)面復(fù)雜的局部微環(huán)境，敷料功能化和個性化的研究還略顯不足。慢性皮膚創(chuàng)面的發(fā)生常常源于患者的原發(fā)性基礎(chǔ)疾病，對于原發(fā)病因的明確以及局部創(chuàng)面情況的把握有助于慢性皮膚創(chuàng)面的精準(zhǔn)治療。因此，同時具有診斷和治療功能敷料的開發(fā)是本領(lǐng)域重要的研究方向。具有診斷功能的新型敷料能夠?qū)崟r分析創(chuàng)面的病理狀態(tài)，特別是針對暫時性皮膚完整的皮下組織的早期病理性改變這種情況，該敷料的應(yīng)用可以為治療提供即時準(zhǔn)確的依據(jù)。

再者，因?yàn)榻M織工程研究中所遇到的問題及所使用的研究方法都有很多相似之處，所以用于組織修復(fù)中的新興技術(shù)也可在慢性皮膚創(chuàng)面的治療中加以利用。由于皮膚創(chuàng)面的愈合過程代表了大部分組織的修復(fù)過程，廣泛應(yīng)用于骨科和神經(jīng)外科修復(fù)的技術(shù)，如3D打印，也適用于慢性皮膚創(chuàng)面的修復(fù)。根據(jù)患者創(chuàng)面的個性化特征，如創(chuàng)面的位置、大小、深度、周圍組織等情況，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)可以制作出針對性強(qiáng)、個性化的功能性敷料。

除了材料與方法的創(chuàng)新之外，將針對慢性皮膚創(chuàng)面免疫微環(huán)境的新型藥物一并使用，起到協(xié)同的效果，這樣的設(shè)計(jì)與研究將會大大提高慢性皮膚創(chuàng)面治療的效率。如前所述，糖尿病潰瘍是慢性皮膚創(chuàng)面的主要類別，目前針對糖尿病潰瘍等慢性皮膚創(chuàng)面的新藥層出不窮，如二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑和胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動劑等，這些藥物通過不同降糖機(jī)制達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果。將針對慢性皮膚創(chuàng)面免疫微環(huán)境的藥物包載于功能性生物敷料中，協(xié)同治療慢性皮膚創(chuàng)面將有效提高慢性皮膚創(chuàng)面的治療效果，并將取代更多的臨床侵入性手術(shù)療法。

總之，對于慢性皮膚創(chuàng)面局部免疫微環(huán)境動態(tài)變化的進(jìn)一步精準(zhǔn)和時空全景描繪，以及具有生物活性的無機(jī)或有機(jī)醫(yī)用材料在生物相容性、功能可控性方面的進(jìn)步必將促進(jìn)慢性皮膚創(chuàng)面愈合領(lǐng)域治療難點(diǎn)的逐一攻破，降低治療風(fēng)險(xiǎn)和成本，大大提高患者的生存質(zhì)量。