脫膠條件對繭層絲膠蛋白性質(zhì)的影響

彭若鉉 黃添就 鐘楊生 何鏡新 林健榮 陳芳艷

摘要： 為了探討脫膠條件對繭層絲膠蛋白性質(zhì)的影響，文章以水為溶劑，在不同的溫度、時間和浴比條件下進行脫膠實驗。結(jié)果表明：溫度、時間和浴比均對絲膠蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。在100 ℃脫膠，3 h內(nèi)絲膠的質(zhì)量濃度和相對黏度均顯著增加，3 h后變化不大;在浴比2.5～15 （g︰100 mL）內(nèi)，絲膠的質(zhì)量濃度呈直線上升的趨勢顯著增加，而在浴比達到7.5 （g︰100 mL）后，相對黏度才顯著上升。絲膠質(zhì)量濃度在70 ℃已開始顯著增加，而相對黏度高于100 ℃才顯著增加。溫度越高，浴比越大，越有利于凝膠的形成。

關(guān)鍵詞： 桑蠶繭層;脫膠條件;絲膠溶液;質(zhì)量濃度;相對黏度;膠凝效果

Abstract： To study the influence of degumming conditions on some properties of cocoon layer sericin， water was used as solvent to separate sericin from cocoon layer under different temperatures， time and bath ratios. The results showed that temperature， time and bath ratio all had a significantly impact on the properties of sericin protein. When degumming at 100 ℃， the mass concentration and relative viscosity of sericin grew significantly within 3 h， but changed little after 3 h; When the bath ratio was 2.5～15 （g︰100 mL）， the mass concentration of sericin grew significantly perpendicularly， when the bath ratio reached 7.5 （g︰100 mL）， the relative viscosity increased significantly. The mass concentration of sericin began to increase dramatically at 70 ℃， while relative viscosity didnt increase dramatically until 100 ℃. The higher temperature and the greater bath ratio， the more easily the gel formed.

Key words： silkworm cocoon layer; degumming conditions; sericin solution; mass concentration; relative viscosity; gelling effect

絲膠包圍在絲素的外面，約占繭層質(zhì)量的25%，對絲素起保護作用[1-2]。近年來，隨著生物醫(yī)學的迅速發(fā)展，絲膠的性質(zhì)和功能越來越受到關(guān)注。絲膠易溶于水，便于加工利用，有良好的吸濕性[3]，成膜性[4]，并且無毒、低（無）免疫原性[5-6]，具有促進細胞增殖能力[7]及抗菌[8]、抗酪氨酸酶和抗凝血[9]、抗癌[10]等功能特性，因而在藥物載體、傷口敷料和組織工程中具有廣闊的應用前景[11]。用再生桑蠶絲蛋白水凝膠負載小牛軟骨細胞后，不僅能促進軟骨細胞的增殖和分化，而且物理化學和力學性能、可降解性和免疫原性均較瓊脂糖等材料優(yōu)秀[12-14]。在絲素溶液中添加絲膠比例越高，制備的3D海綿楊氏模量就越高，應變和應力也越好，相比于不添加絲膠的對照更有利于成骨細胞的生長，且不會產(chǎn)生炎癥反應[15]。絲膠可顯著降低2型糖尿病小鼠空腹血糖值，同時降低空腹血漿胰島素水平和糖基化血清蛋白水平;改善口服葡萄糖耐量和胰島素耐量，并增強抗氧化活性[16]。

繭層絲膠由9種多肽或蛋白質(zhì)所構(gòu)成，其相對分子質(zhì)量為24 000～400 000 Da，是一類蛋白質(zhì)的混合物[17]。包覆在絲素外層的絲膠蛋白由中部絹絲腺前區(qū)的細胞分泌合成，內(nèi)層絲膠蛋白由中部絹絲腺后區(qū)細胞分泌合成。組成外層絲膠蛋白的親水氨基酸殘基較多，因而結(jié)晶度低，最易溶于水中，而組成內(nèi)層絲膠蛋白的氨基酸殘基含親水基團相對少些，因而結(jié)晶度較高，較難溶于水中。相比于外層絲膠，內(nèi)層絲膠蛋白從絲素中分離需要更多的能量。脫膠的過程中，絲膠蛋白受到溶劑、熱或者酸和堿的作用，氫鍵被打斷，肽鍵受破壞，導致其相對分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[18]。目前大多數(shù)研究是探討脫膠方法、脫膠條件和脫膠劑對絲素性質(zhì)的影響[19-20]，而針對脫膠條件與絲膠性質(zhì)的研究報道較少。鑒于脫膠方法和條件會直接影響到脫膠的效率、絲膠的相對分子質(zhì)量分布及絲膠的物理化學性質(zhì)和生物學特性，對后續(xù)的開發(fā)應用會產(chǎn)生影響[21]。本文以水為溶劑，探索繭層脫膠條件對絲膠溶液質(zhì)量濃度、相對黏度和膠凝特性的影響，為桑蠶絲膠的分離及開發(fā)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料：桑蠶繭層（華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院蠶絲科學系）。

藥品：牛血清白蛋白為電泳純（Sigma公司），考馬斯亮藍G-250、85%磷酸、95%乙醇等均為分析純試劑（市售）。

1.2 方 法

1.2.1 脫膠方法

1）不同脫膠時間的影響。以去離子水為溶劑分離繭層絲膠，按浴比[繭層質(zhì)量（g）與溶劑（mL）]5.5︰100的比例，將剪碎后的繭層110 g和2 000 mL去離子水加入3 000 mL圓底燒瓶中。首先30 ℃預熱3 min，待繭層完全浸入水中后，在100 ℃條件下冷凝回流脫膠，分別于開始脫膠后的0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0 h時間點取樣20 mL，測定絲膠蛋白質(zhì)量濃度、相對黏度，觀察放置一段時間后的膠凝現(xiàn)象，重復3次。

2）不同溫度的影響。固定浴比，精確稱取5.5 g繭層6份，將6份繭層和100 mL蒸餾水分別加入6個250 mL圓底燒瓶中，30 ℃預熱3 min，使繭層完全浸入水中。分別在50 ℃、70 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、130 ℃的溫度條件（100 ℃以上采用油浴控溫）下冷凝回流處理3 h后，過濾得到絲膠溶液，然后取樣測定絲膠蛋白質(zhì)量濃度、相對黏度，觀察放置一段時間后的膠凝現(xiàn)象，重復3次。

3）不同浴比的影響。按浴比（g︰mL）為2.5︰100、5︰100、7.5︰100、10︰100、12.5︰100、15︰100的比例分別將剪碎的25、5、7.5、10、12.5、15 g繭層和100 mL去離子水裝入6個250 mL圓底燒瓶中，30 ℃預熱3 min，然后在溫度為100 ℃的條件下冷凝回流提取3 h后過濾，取樣測定絲膠蛋白質(zhì)量濃度、相對黏度，觀察放置一段時間后的膠凝現(xiàn)象，重復3次。

1.2.2 絲膠蛋白質(zhì)量濃度的測定

采用Bradford法[22]，以牛血清白蛋白為標準蛋白質(zhì)。根據(jù)標準曲線y=0.004 4x+0.030 6，R2=0.995 0，計算絲膠蛋白的質(zhì)量濃度。y為A595nm吸光度，x為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（μg/mL）。

1.2.3 絲膠黏度的測定方法

參考羅艷華等[23]的方法，采用烏氏黏度計（上海申誼玻璃制品有限公司）進行測定，記錄樣品溶液流出時間，誤差不能超過0.2 s。以溶劑作為對照，根據(jù)下式計算相對黏度值：

1.2.4 絲膠膠凝度的判定

取絲膠提取液置于4 ℃冰箱中靜待膠凝，24 h后取出，橫置觀察樣品膠凝情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫膠時間對絲膠蛋白性質(zhì)的影響

以去離子水為溶劑，在溫度為100 ℃，浴比為5.5 g︰100 mL條件下，比較脫膠時間對絲膠蛋白性質(zhì)的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，絲膠溶液的質(zhì)量濃度隨脫膠時間的增加而增加，以3 h為轉(zhuǎn)折點，在3 h內(nèi)絲膠的質(zhì)量濃度隨時間的增加呈線性增加的趨勢快速上升（線性方程y=216.21x，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 6）;3 h后，雖然絲膠的質(zhì)量濃度仍在增加，但是上升緩慢。絲膠溶液的相對黏度亦隨著脫膠時間的增加而增加，在0.5～1.0 h相對黏度增加最快，1.0～3.0 h較快，3.0 h后增加最慢。絲膠溶液的質(zhì)量濃度和相對黏度均在7.0 h達到最高，分別是727.42 μg/mL和121.12%。

將7個不同時間段脫膠得到的絲膠溶液（質(zhì)量濃度14644～727.42 μg/mL，相對黏度103.39%～121.12%）放置在4 ℃的冰箱中連續(xù)觀察14 d，均沒有出現(xiàn)膠凝的現(xiàn)象。

2.2 脫膠溫度對絲膠蛋白性質(zhì)的影響

固定浴比和脫膠時間，比較脫膠溫度對絲膠溶液的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，70 ℃以前絲膠質(zhì)量濃度變化不大，因為此階段為絲膠膨潤階段，所以絲膠溶解量很少;在脫膠溫度達到70 ℃時，進入了溶解階段，絲膠質(zhì)量濃度開始顯著上升。溫度達90 ℃以上時，絲膠的質(zhì)量濃度隨溫度的增加呈線性增加的趨勢快速上升（線性方程y=33.53x-2 714.1，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 4）。在溫度為130 ℃時，絲膠的質(zhì)量濃度達1 612.42 μg/mL。

絲膠相對黏度在溫度為100 ℃以下時變化不大，100 ℃以上時黏度顯著增加，在130 ℃時相對黏度達260.17%。從絲膠質(zhì)量濃度和相對黏度兩條曲線的變化趨勢來看，在130 ℃均未達到極限值，繼續(xù)升高溫度，質(zhì)量濃度和相對黏度還會繼續(xù)上升。受實驗條件制約，最高溫度設計在130 ℃。絲膠質(zhì)量濃度和相對黏度在何溫度下達到最大值平臺，仍需要進一步實驗闡明。將不同溫度條件下分離制備的絲膠溶液置于4 ℃條件下放置12 h，110 ℃以上條件制備的絲膠溶液（質(zhì)量濃度≥619.09 μg/mL，相對黏度≥116.11%）出現(xiàn)凝膠化現(xiàn)象（圖3），凝膠顏色呈淡黃色。兩組凝膠均呈現(xiàn)半透明狀，凝膠貼于玻璃儀器內(nèi)壁，無坍塌現(xiàn)象。傾斜玻璃儀器，凝膠會沿內(nèi)壁下滑，且有液體出現(xiàn)，但整體依舊保持完整。而低于100 ℃條件分離的絲膠均未出現(xiàn)膠凝現(xiàn)象。

2.3 浴比對絲膠蛋白性質(zhì)的影響

固定脫膠溫度和時間，比較不同浴比對絲膠蛋白性質(zhì)的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，絲膠的質(zhì)量濃度隨浴比的增加幾乎呈線性增加的趨勢快速上升（線性方程y=65.164x+154.32，相關(guān)系數(shù)R2=0.968 9）。絲膠溶液的相對黏度在小浴比的情況下增加不大，在浴比達7.5 （g︰100 mL）以后，相對黏度呈線性趨勢快速上升（線性方程y=14.857x+3.412 8，相關(guān)系數(shù)R2=0995）。在最高浴比15 （g︰100 mL）時，絲膠的質(zhì)量濃度和相對黏度分別為1 156.82 μg/mL和227.57%，從圖4可知，兩者均未達到極限值。受繭層體積的影響，15 （g︰100 mL）已經(jīng)是最大浴比。

將不同浴比條件下分離的絲膠溶液置于4 ℃條件下放置12 h后，取出橫置于桌面上，觀察膠凝現(xiàn)象，浴比大于等于10 （g︰100 mL）（絲膠質(zhì)量濃度≥818.33 μg/mL，相對黏度≥155.97%）的絲膠溶液，在4 ℃條件下放置12 h后，出現(xiàn)凝膠化現(xiàn)象，如圖5所示。

綜上所述，脫膠時間、溫度和浴比對絲膠質(zhì)量濃度、相對黏度及絲膠溶液的凝膠化效果均會產(chǎn)生影響。在100 ℃條件脫膠，3 h內(nèi)絲膠溶液質(zhì)量濃度增加顯著，3 h后增加緩慢，分析主要有兩方面的原因：1）脫膠過程是絲膠在熱和溶劑等的作用下經(jīng)歷膨潤溶化的漸進過程，初期經(jīng)過膨潤階段之后絲膠溶出較快，絲膠溶出過程后期繭絲上的絲膠減少，脫膠率隨之下降;2）根據(jù)日本學者小松計一[1]的研究，繭絲外包覆著四層絲膠，組成這四層絲膠的氨基酸組成雖然相同，但氨基酸種類不同，四層絲膠由外層到內(nèi)層溶解度逐漸降低，最初溶解下來的是含親水基團多的分布在外層的易溶性絲膠，隨著時間的延長，絲膠越來越難溶解，因此一定時間后絲膠的溶解速度會降低。溫度越高越有利于打斷分子間的作用力，因而提高溫度有利于絲膠的溶解[24]。本文研究發(fā)現(xiàn)，溫度升至70 ℃以后，絲膠溶液質(zhì)量濃度會顯著增加，70 ℃以前是絲膠膨潤階段，此后絲膠才逐漸溶出;在油浴溫度升高至100 ℃以后，絲膠質(zhì)量濃度仍會急劇地增高，分析原因，雖然溶劑——水的沸點是100 ℃，但實際上隨著絲膠的不斷溶解，溶質(zhì)質(zhì)量濃度增加，水-絲膠溶液共沸點的溫度也隨之上升，因此在常壓狀態(tài)下也能達到100 ℃以上的溫度。浴比越大，絲膠溶液的質(zhì)量濃度越高，但并不意味著脫膠效率也越高。

對不同脫膠條件下的絲膠膠凝效果比較發(fā)現(xiàn)，在溫度100 ℃的條件下所獲得的絲膠，當絲膠溶液的質(zhì)量濃度≥818.33 μg/mL，相對黏度≥155.97%時出現(xiàn)明顯的膠凝現(xiàn)象;而在溫度≥110 ℃條件下分離獲得的絲膠，當絲膠溶液的質(zhì)量濃度≥619.09 μg/mL，相對黏度≥116.11%即出現(xiàn)明顯的膠凝現(xiàn)象。影響膠凝的因素包括質(zhì)量濃度、溫度及絲膠的相對分子質(zhì)量，同樣放置于4 ℃條件下膠凝，采用高溫提取獲得的絲膠，形成膠凝過程要求的質(zhì)量濃度卻低一些，這可能與不同溫度條件下，溶解下來的絲膠種類不同有關(guān)，其原因仍有待進一步研究。

采用不同的條件分離絲膠，會影響絲膠的質(zhì)量濃度、絲膠的物質(zhì)組成，進而影響到絲膠相對黏度。黏度受高分子物質(zhì)的相對分子質(zhì)量、質(zhì)量濃度和環(huán)境溫度的影響，分析不同脫膠條件的絲膠質(zhì)量濃度與相對黏度的關(guān)系（圖6），發(fā)現(xiàn)絲膠質(zhì)量濃度在達到一定的數(shù)值后相對黏度就會顯著上升，而低于此數(shù)值則黏度變化不大。相對黏度與質(zhì)量濃度之間的這種變化趨勢有待進一步研究。

3 結(jié) 論

脫膠溫度、時間和浴比對絲膠蛋白的質(zhì)量濃度、黏度和膠凝特性會產(chǎn)生影響。時間在3 h內(nèi)的影響比較大，絲膠的質(zhì)量濃度和相對黏度在3 h內(nèi)都顯著增加，之后變化不大。在70 ℃以前為絲膠膨潤階段，在溫度低于70 ℃脫膠，對絲膠質(zhì)量濃度影響不大;70 ℃以后隨著溫度的上升，絲膠質(zhì)量濃度顯著增加;100 ℃以前分離的絲膠相對黏度變化不大，100 ℃以后分離的絲膠相對黏度顯著增加。浴比2.5～15 （g︰100 mL）對絲膠質(zhì)量濃度產(chǎn)生顯著影響，隨著浴比的增加，絲膠的質(zhì)量濃度幾乎呈直線上升的趨勢;而在浴比上升到7.5 （g︰100 mL）后，才對絲膠的相對黏度產(chǎn)生顯著的影響。100 ℃分離的絲膠，形成膠凝的質(zhì)量濃度要求是大于等于818.33 μg/mL，而110 ℃以上高溫條件分離的絲膠形成膠凝的質(zhì)量濃度要求是大于等于619.09 μg/mL。

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