非洲豬瘟病毒免疫逃逸特性

謝春芳，于瑞嵩，董世娟，陳冰清

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程實(shí)驗(yàn)室，上海 201106)

非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)侵染細(xì)胞后，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)泡小體，內(nèi)泡小體內(nèi)的酸性環(huán)境可以破壞ASFV 的外膜和蛋白衣殼，暴露內(nèi)膜，使ASFV 內(nèi)膜上的跨膜肽得以與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，待病毒內(nèi)膜與細(xì)胞膜融合后，病毒核質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，從而感染宿主細(xì)胞，啟動(dòng)病毒復(fù)制周期[1-4]。

被ASFV 感染的細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(Pattern Recognition Receptors，PRRs) 檢測(cè)病原體相關(guān)分子模式(Pathogenassociated Molecular Patterns，PAMPs)，啟動(dòng)先天性免疫，分泌細(xì)胞免疫因子。為了逃避宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答，ASFV 編碼相應(yīng)的病毒蛋白用于免疫逃逸或抑制[5-6]。

ASFV 很難清除，目前非洲豬瘟的滅活苗、亞單位苗和弱毒苗都不能誘導(dǎo)豬產(chǎn)生足夠安全且有效的抗體來(lái)控制非洲豬瘟[7-8]。

1 宿主細(xì)胞感染ASFV 后的免疫應(yīng)答

ASFV 主要侵染單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞。免疫細(xì)胞感染ASFV后，迅速產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在被ASFV 刺激的免疫細(xì)胞外周血單核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC) 中，干 擾 素(Interferon，IFN) 陽(yáng)性淋巴細(xì)胞群以CD4+/CD8+T 細(xì)胞表型為主，還有一部分為記憶輔助性T 細(xì)胞。體外試驗(yàn)證明，豬IFN 可降低豬巨噬細(xì)胞中ASFV 的復(fù)制，在病毒感染早期IFN 可能直接影響感染ASFV宿主細(xì)胞的相互作用[9-10]。

細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)對(duì)抵御細(xì)胞內(nèi)病原體，特別是病毒起重要作用。ASFV 強(qiáng)毒株與弱毒株或無(wú)毒株的發(fā)病機(jī)制和免疫誘導(dǎo)不同。感染弱毒或無(wú)毒的ASFV 時(shí)，被感染豬體內(nèi)T 細(xì)胞、自然殺傷(Natural Killer，NK)細(xì)胞的活性增強(qiáng)，NK 細(xì)胞可以通過(guò)直接與被病毒感染的細(xì)胞結(jié)合殺死病毒，也可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子如干擾素和趨化因子等抵抗病毒感染，感染細(xì)胞分泌的干擾素還可以增強(qiáng)NK 細(xì)胞的活性；弱毒或無(wú)毒的ASFV 會(huì)誘導(dǎo)表達(dá)穿孔素的T 細(xì)胞分化增殖為CD4+T 細(xì)胞或CD4+/CD8+T 細(xì)胞。弱毒或無(wú)毒的ASFV 感染能誘導(dǎo)記憶性T 細(xì)胞的增殖，抵抗再次感染同源性病毒株[11-15]。

哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞至少有13 種不同的Toll 樣受體(Toll-like Receptor，TLR)，病毒的脂類或糖蛋白與TLR 的胞外域結(jié)合后會(huì)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子、趨化因子的共同效應(yīng)，還能誘導(dǎo)產(chǎn)生具有增強(qiáng)抗病毒作用的IFN-β，并參與細(xì)胞先天性免疫應(yīng)答中TLR 依賴和非依賴途徑，誘導(dǎo)抗病毒作用[16-18]。

2 ASFV 抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答

當(dāng)ASFV 侵染細(xì)胞后，為了避免被細(xì)胞的免疫因子降解，ASFV 會(huì)編碼多種病毒蛋白用于逃避宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答。ASFV 主要通過(guò)抑制TLR、干擾素調(diào)節(jié)因子3 (Interferon Regulation Factor 3，IRF3) 和核因子?B(Nuclear Factor ?B，NF-?B)等細(xì)胞免疫因子逃避細(xì)胞免疫，從而在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中生存。

ASFV 抑制TLR 免疫信號(hào)途徑的蛋白目前只發(fā)現(xiàn)一種，即ASFV pI329L。該蛋白高度糖基化，是一種跨膜蛋白，具有與TLR3-Toll/Interleukin-1 受體(TLR3-TIR) 結(jié)構(gòu)域同源的區(qū)域，通過(guò)作用于β-干擾素TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing Adaptor Inducing Interferon-β，TRIF) 抑制TLR3信號(hào)途徑，抑制雙鏈RNA 刺激的NF-?B 和IRF3 的激活，從而抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)[19-20]。

ASFV 多基因家族蛋白(Multiogenes Family，MGF) 中的MGF360 和MGF505/530 也可以通過(guò)抑制IRF3 和NF-?B 轉(zhuǎn)錄因子抑制誘導(dǎo)和影響Ⅰ型干擾素的作用，阻斷感染細(xì)胞Ⅰ型干擾素的免疫應(yīng)答。ASFV pDP96R 有4 段10 個(gè)氨基酸串聯(lián)重復(fù)序列(10-amino acid tandem repeats)，C-末端有結(jié)構(gòu)域，可以抑制TANK 結(jié)合酶1(TANK Binding Kinase 1，TBK1)的磷酸化，從而抑制下游干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon Regulation Factor 3，IRF3)的活性，阻斷干擾素刺激基因(Stimulator of Interferon Gene，STING)參與的STING-TBK1-IRF3 或STING-TBK1-IKKβ 信號(hào)途徑，抑制干擾素的表達(dá)，而干擾素是恒定自然殺傷T(Invariant Nature Killer T，iNKT) 細(xì)胞激活的有效電感器，干擾素的阻斷可能會(huì)影響iNKT 細(xì)胞的活化[21-24]。

ASFV pA238L 可以抑制NF-?B 和活化T 細(xì)胞核因子(Nuclear Factor of Activated T Cells，NFAT) 免疫途徑。pA238L 與細(xì)胞組氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶p300/CBP 共作用，通過(guò)直接結(jié)合鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制NF-?B 轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制宿主鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶依賴途徑，抑制宿主免疫調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性[6]。

3 ASFV 抑制細(xì)胞凋亡和自噬

自噬和凋亡是細(xì)胞重要的生物學(xué)特征，破壞程序性細(xì)胞死亡的宿主防御系統(tǒng)是大DNA 病毒感染的一個(gè)顯著特征。為了在宿主細(xì)胞中有足夠的時(shí)間復(fù)制增殖，ASFV 會(huì)抑制細(xì)胞的過(guò)早凋亡。

ASFV pA179L 定位于細(xì)胞線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，能夠與B 細(xì)胞淋巴瘤2 (B-cell Lymphoma-2，Bcl-2) 或Bcl-2 同源物包括促凋亡的Bcl-2 蛋白家族成員和自噬調(diào)節(jié)因子Beclin 相結(jié)合。pA179L 與Beclin 結(jié)合時(shí)使用的是與促凋亡Bcl-2 結(jié)合的同一典型配體結(jié)合槽，pA179L 具有與促凋亡的Bcl-2 蛋白相似的α 螺旋結(jié)構(gòu)配體結(jié)合槽，Beclin BH3 肽與pA179L 的α 螺旋2～5 形成的表面凹槽結(jié)合，Beclin BH3 基序與pA179L 配體結(jié)合槽的結(jié)合模式和Bid BH3 基序與pA179L 配體結(jié)合槽的結(jié)合模式非常相似，Beclin 利用3 個(gè)典型的疏水殘基L110、L114 和F121 以及T117來(lái)結(jié)合pA179L 配體結(jié)合槽，pA179L 配體結(jié)合槽與Bcl-2 促凋亡蛋白家族成員及自噬調(diào)節(jié)因子Beclin BH3 基序結(jié)合：pA179L D80 和pA179L 與Beclin K115 之間的離子相互作用以及pA179L N83 與Beclin D119 之間的氫鍵、pA179L G85 與Beclin D122 之間的氫鍵和pA179L Y46 與Beclin L114 主鏈之間的氫鍵相互作用，抑制細(xì)胞自噬；pA179L 的α 螺旋2～5 形成配體結(jié)合槽，與Bcl-2 BH3 基序配體結(jié)合，從而與促凋亡蛋白Bcl-2 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合促凋亡蛋白，抑制細(xì)胞凋亡[25-27]。

DP71L 作用于宿主蛋白磷酸化酶1(Protein Phosphatase 1，PP1) 的去磷酸化，從而防止通過(guò)雙鏈RNA 依賴性蛋白激酶R(Double-stranded RNA-dependent Protein Kinase，PKR) 或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Protein Kinase R-like ER Kinase，PERK)磷酸化誘導(dǎo)的蛋白合成關(guān)閉[28]。

入侵的ASFV 可以抑制細(xì)胞自噬和凋亡的發(fā)生或過(guò)早發(fā)生，從而為ASFV 的復(fù)制和表達(dá)裝配爭(zhēng)取足夠的時(shí)間，傳播并繁殖下一代病毒。

4 小結(jié)

ASFV 抗原多樣性是阻礙ASFV 疫苗發(fā)展的關(guān)鍵因素，天然和基因缺失的減毒活毒株可抵御同源的毒株，誘導(dǎo)抗體起保護(hù)作用。誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL) 可能是完全保護(hù)的關(guān)鍵，依賴于CTL 靶點(diǎn)識(shí)別的亞單位疫苗可誘導(dǎo)商品豬ASFV 抗原特異性CTL 反應(yīng)，但仍需要進(jìn)一步的評(píng)估[29-30]。

ASFV 在家豬上可引起致命的出血病，死亡率高達(dá)100%。ASFV 可以在蜱蟲體內(nèi)存活，在環(huán)境中的耐受力強(qiáng)，一系列預(yù)防和控制非洲豬瘟的措施是提高飼養(yǎng)技術(shù)、改善飼養(yǎng)環(huán)境、改善生態(tài)環(huán)境和控制豬肉安全的首要條件。同時(shí)，研究ASFV 與細(xì)胞的相互作用可以為人類相似病毒的免疫防控提供一些啟示，但是關(guān)于非洲豬瘟疫苗的研究仍然存在許多問(wèn)題，需要去克服、去完善。