沙眼衣原體III型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白研究進(jìn)展

張榮榮，高 哲，賈天軍

沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis，Ct)是專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，可導(dǎo)致人類眼部和生殖道疾病，甚至引起失明或者不孕癥[1]。所有的衣原體都具有獨(dú)特的雙相發(fā)育周期，即有感染性的原體(EB)和無感染性的始體(RB)。在接觸宿主細(xì)胞后不久，EBs內(nèi)化并限制在一個(gè)小液泡內(nèi)，稱為包涵體[2]。在包涵體中EBs分化為RBs，RBs經(jīng)二分裂復(fù)制使包涵體不斷擴(kuò)大，隨后RBs開始向EBs轉(zhuǎn)化。為了建立適應(yīng)Ct復(fù)制的細(xì)胞內(nèi)生態(tài)位，Ct需依賴III型分泌系統(tǒng)(T3SS)及T3SS效應(yīng)蛋白操縱宿主細(xì)胞。T3SS是一種由20～35 種蛋白質(zhì)組成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[3]。沙眼衣原體 T3SS橫跨包涵體膜和宿主細(xì)胞內(nèi)、外膜，直接將效應(yīng)蛋白分泌到宿主細(xì)胞質(zhì)。一旦進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)，T3SS效應(yīng)蛋白可與宿主細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系，在Ct的入侵、存活和釋放等方面發(fā)揮重要作用。隨著研究技術(shù)不斷發(fā)展，人們對(duì)T3SS功能的研究日漸深入，本文就目前沙眼衣原體T3SS效應(yīng)蛋白功能的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 沙眼衣原體T3SS

沙眼衣原體T3SS是一種獨(dú)立的多組分分泌系統(tǒng)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其基本組成部分包括：①細(xì)胞質(zhì)輔助蛋白(AC)，由一系列伴侶蛋白和調(diào)節(jié)蛋白構(gòu)成，在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用；②跨越Ct內(nèi)膜、周質(zhì)間隙和外膜的基礎(chǔ)裝置蛋白，在系統(tǒng)中高度保守，是分泌的核心部分；③針尖復(fù)合物蛋白(NC和TC)，它們連接Ct與宿主細(xì)胞膜的空隙；④真核細(xì)胞膜上形成孔的分泌性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Tr)，分泌底物通過這些孔進(jìn)入宿主細(xì)胞漿[4-5]，因此T3SS被稱為“分子注射器”。T3SS不但存在于Ct中，也存在于許多革蘭氏陰性菌中，如耶爾森氏菌屬(Yersiniaspp)、沙門氏菌屬(Salmonella)、福氏志賀氏菌屬(Shigellaflexneri)、衣原體屬(chlamydia)等。但與這些蛋白分泌系統(tǒng)不同的是，沙眼衣原體T3SS效應(yīng)基因既不位于毒力質(zhì)粒上，也不排列形成致病島(PAIs)，而是分散在染色體上，分布在4個(gè)群組中并排列形成多個(gè)操縱子[6]。在感染過程中，EB一旦接觸宿主細(xì)胞，T3SS蛋白及其效應(yīng)蛋白可被激活。效應(yīng)蛋白是T3SS分泌的毒力蛋白，經(jīng)T3SS直接被遞送到宿主細(xì)胞，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能從而使Ct受益。

2 沙眼衣原體T3SS效應(yīng)蛋白及功能

沙眼衣原體T3SS表達(dá)多種效應(yīng)蛋白，主要分為兩個(gè)亞群：①轉(zhuǎn)運(yùn)并插入包涵體膜的效應(yīng)蛋白，也稱為包涵體膜蛋白(inclusion membrane proteins，Inc蛋白)；②在包涵體腔或宿主細(xì)胞內(nèi)分泌的可溶性效應(yīng)蛋白，即非Inc蛋白[7]。它們?cè)贑t發(fā)育以及與宿主細(xì)胞的相互作用中均發(fā)揮重要作用，如IncA、IncE和Cpos可調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞囊泡運(yùn)輸，IncD和IncV調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞非囊泡運(yùn)輸，IPAM、InaC、Tarp、CT694和CT166均可調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞骨架，其中Tarp、CT694和CT166還可促進(jìn)Ct的侵襲。以下將詳述沙眼衣原體 T3SS效應(yīng)蛋白的功能。

2.1調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞骨架和Ct侵襲 衣原體進(jìn)入非吞噬上皮細(xì)胞伴隨宿主細(xì)胞質(zhì)膜的改變。目前已證明Inc蛋白IPAM和InaC參與微管、微絲的破壞和高爾基體的重定位，非Inc蛋白Tarp、CT694和CT166通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架促進(jìn)Ct入侵。

Dumoux等[8]研究表明IPAM可募集并刺激中心體蛋白170(CEP170)重塑微管(MT)網(wǎng)絡(luò)。MT參與胞內(nèi)運(yùn)輸和維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞骨架的重要組成部分，CEP170是維持包涵體形態(tài)、產(chǎn)生感染性子代所必需的蛋白。另有研究表明，在Ct感染的細(xì)胞中，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白(F-actin)聚集在包涵體周圍，對(duì)維持高爾基體形態(tài)有重要作用[9]。通過干擾肌動(dòng)蛋白聚合以及對(duì)比分析InaC突變株和野生株的性狀，發(fā)現(xiàn)InaC參與F-actin在包涵體周圍的積累。InaC還可募集ADP核糖基化因子1 (ARF1)和ARF4到包涵體膜并調(diào)節(jié)二者的激活，誘導(dǎo)MT翻譯后修飾，從而促進(jìn)包涵體周圍高爾基體的重定位[10]。

易位的肌動(dòng)蛋白募集磷蛋白(TarP)、CT694及CT166都可調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白進(jìn)而促進(jìn)Ct侵襲。TarP是衣原體早期的多域效應(yīng)蛋白，介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白的成核和成束。Tarp可招募肌動(dòng)蛋白，包含幾個(gè)與WH2結(jié)構(gòu)域蛋白相似的C末端肌動(dòng)蛋白結(jié)合域[11]；還包含一個(gè)富含脯氨酸的區(qū)域，可增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白的寡聚化。研究表明，酪氨酸磷酸化的Tarp結(jié)合并招募RAC1激活因子(Sos1和Vav2)，使TarP與Arp2/3復(fù)合物協(xié)同作用，提高肌動(dòng)蛋白聚合速率并促進(jìn)Ct侵襲[12]。Ghosh等[13]使用熒光報(bào)告等位基因交換誘變(FRAEM)技術(shù)，表明F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)結(jié)合域的C末端對(duì)Tarp介導(dǎo)的Ct入侵宿主細(xì)胞有重要作用。對(duì)TarP的研究通常集中在Ct蛋白的同源物。鼠衣原體(C.muridarum，Cmu)、豚鼠衣原體(C.caviae)和肺炎衣原體(C.pneumoniae，Cpn)中的TarP同源基因沒有磷酸結(jié)構(gòu)域，但均可招募肌動(dòng)蛋白，表明Tarp的磷酸化區(qū)域不是肌動(dòng)蛋白募集的必要條件[14]。易位膜相關(guān)效應(yīng)蛋白A(TmeA)即CT694，由T3SS分泌并存在于EBs中。CT694不直接與肌動(dòng)蛋白相互作用，而是與人AHNAK蛋白的重復(fù)區(qū)和C末端相互作用，并影響宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白應(yīng)激纖維的形成[15]。使用FRAEM技術(shù)構(gòu)建CT694突變株[16]， 表明CT694的缺失可導(dǎo)致小鼠感染率降低以及對(duì)宿主細(xì)胞侵襲水平下降。無論是否敲除AHNAK蛋白，CT694突變株對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲均減弱，然而野生型Ct對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲沒有缺陷[17]，表明Ct有效入侵宿主細(xì)胞需要CT694，但與CT694和AHNAK的相互作用無關(guān)。TarP和CT694是目前與侵襲相關(guān)最具特征的效應(yīng)蛋白，另有CT166也具有同樣的作用。CT166只存在于Ct生殖生物型，與艱難梭菌毒素的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GGTs)的N末端具有同源性[18]。使用高感染復(fù)數(shù)(MOI)的沙眼衣原體D型感染宿主細(xì)胞，可導(dǎo)致宿主細(xì)胞變圓和肌動(dòng)蛋白重組，這可能下調(diào)RAC1介導(dǎo)的信號(hào)從而導(dǎo)致衣原體侵襲所需的宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架變化[19]。

2.2影響宿主細(xì)胞免疫反應(yīng) 衣原體感染宿主細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生多種效應(yīng)因子，使宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)。目前已證明Inc蛋白Cap1(CT442)和CrpA(CT529)刺激機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)，CT143刺激促炎因子分泌，非Inc蛋白TepP調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞固有免疫信號(hào)。

易位早期磷酸化蛋白(TepP)即CT875，是Ct感染早期分泌最豐富的效應(yīng)蛋白。Tarp、CT694和TepP均與T3SS伴侶蛋白-SycE樣伴侶1(Slc1)相互作用并促進(jìn)分泌，被傳遞到宿主細(xì)胞質(zhì)后定位在新生包涵體附近[20]。TepP一旦轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞，便在多個(gè)酪氨酸和絲氨酸殘基處磷酸化。研究表明，TepP可通過四肽重復(fù)序列1(IFIT1)和IFIT2下調(diào)IFN誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)[21]。Carpenter等[22]研究表明TepP對(duì)宮頸上皮細(xì)胞中衣原體的復(fù)制、I型IFN基因的激活以及I類磷酸肌醇3激酶(PI3K)和CrkL向新生包涵體的募集具有重要作用。雖然TepP是Src激酶酪氨酸磷酸化的靶點(diǎn)，但這些修飾似乎不影響PI3K或CrkL的募集。TepP的易位與細(xì)胞內(nèi)磷酸肌醇(3,4,5)-三磷酸的增加有關(guān)，而與生存前激酶Akt的激活無關(guān)[22]，提示TepP介導(dǎo)的PI3K激活僅限于包涵體早期?？傊?，Ct可通過TepP限制PI3K來調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路和膜轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制INF的產(chǎn)生，從而在感染早期顛覆宿主細(xì)胞固有免疫，這可能是衣原體生長(zhǎng)所必需。Inc蛋白Cap1和CrpA可引起機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫，同時(shí)二者均可被MHC I類分子提呈給CD8+T細(xì)胞，刺激機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)感染小鼠體內(nèi)Ct的清除[23]。CT143可通過激活THP-1細(xì)胞中的p38/MAPK信號(hào)通路刺激促炎因子分泌，這與Ct感染過程中的炎癥反應(yīng)有關(guān)[24]。

2.3調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞囊泡和非囊泡運(yùn)輸 由于Ct缺乏所需的生物合成酶，因此需要與各種宿主途徑進(jìn)行復(fù)雜的相互作用來獲取鞘磷脂、膽固醇和甘油磷脂等，包括囊泡運(yùn)輸和非囊泡運(yùn)輸途徑。囊泡運(yùn)輸可通過宿主可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著受體(SNARE)蛋白的募集來調(diào)節(jié)，是細(xì)胞內(nèi)融合機(jī)制的關(guān)鍵組成部分。至少有3個(gè)Inc蛋白(IncA、IPAM和InaC)含有SNARE基序，它們能夠像SNARE蛋白一樣發(fā)揮作用從而抑制囊泡融合。其中，IncA的SNAREs樣結(jié)構(gòu)域(SLD-1)和SLD-2可抑制二者介導(dǎo)的內(nèi)吞性膜融合，從而避免包涵體與有害囊泡融合[25]。此外，IncE可與逆轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體中的SNX5和SNX6結(jié)合，調(diào)控宿主的逆向囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，使Ct感染性子代增加[26]。Rab GTPases也是控制真核細(xì)胞囊泡運(yùn)輸?shù)闹饕蛩?。Faris等[27]證明CpoS靶向多個(gè)Rab GTPases及其同源效應(yīng)蛋白至包涵體，并且攔截來自循環(huán)途徑的宿主囊泡，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)鐵蛋白和甘露糖-6-磷酸受體(CI-M6PR)的轉(zhuǎn)運(yùn)。它們的活性對(duì)于Ct攝取營(yíng)養(yǎng)、避免包涵體與溶酶體融合和穩(wěn)定包涵體膜具有重要作用。

目前已知Inc蛋白IncD和IncV參與非囊泡運(yùn)輸。Ct可通過包涵體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成的膜接觸位點(diǎn)(MCS)獲取脂質(zhì)。神經(jīng)酰胺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CERT)是MCS的功能性成分，參與神經(jīng)酰胺從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)。然后經(jīng)鞘磷脂合酶2(SMS2)將神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化為鞘磷脂，鞘磷脂對(duì)Ct的生長(zhǎng)至關(guān)重要[28]。研究表明，IncD可與CERT相互作用并將其招募至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-包涵體MCS處，從而調(diào)控宿主細(xì)胞非囊泡運(yùn)輸[29]。CERT中的FFAT基序介導(dǎo)了其與VAMP相關(guān)蛋白A(VAPA)和VAPB的相互作用，間接導(dǎo)致VAPA/B的募集。VAPA/B在包涵體周圍的募集也與IncD相關(guān)。IncV同樣可與VAPA/B的相互作用[30]，這種相互作用依賴于IncV所含的FFAT基序。IncV是建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-包涵體MCS的重要因素，但不是唯一因素，提示還有其他分子參與此過程。

2.4參與染色質(zhì)的重塑 目前已發(fā)現(xiàn)非Inc蛋白NUE和CT460參與染色質(zhì)的重塑。蛋白質(zhì)核效應(yīng)因子(NUE)是含有SET結(jié)構(gòu)域的衣原體蛋白，此結(jié)構(gòu)域主要存在于控制基因表達(dá)和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶中[31]。體外甲基化實(shí)驗(yàn)證明NUE能夠使組蛋白H2B、H3和H4甲基化，可能參與染色質(zhì)的重塑。CT460是最新發(fā)現(xiàn)的T3SS效應(yīng)蛋白，含有一個(gè)可能參與染色質(zhì)重塑的SWIB/MDM2結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白與嗜線粒體華診體(Waddliachondrophila)蛋白Wcw_0377同源，并且具有相同的SWIB/MDM2結(jié)構(gòu)域[32]。SWIB/MDM2結(jié)構(gòu)域主要存在于真核生物，可到達(dá)宿主細(xì)胞核從而與宿主細(xì)胞蛋白相互作用[21]，表明含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白可能與宿主細(xì)胞的相互作用有關(guān)。Kebbi-Beghdadi等[32]證明CT460與NUE相似，定位在感染細(xì)胞的細(xì)胞核中并在染色質(zhì)重塑中發(fā)揮作用。

2.5調(diào)控衣原體EBs的產(chǎn)生及釋放 衣原體可通過細(xì)胞裂解或擠壓的方式將EBs從宿主細(xì)胞釋放。溶解釋放導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡，涉及半胱氨酸蛋白酶及細(xì)胞質(zhì)膜的破裂；相反，擠出過程使宿主細(xì)胞保持完整，宿主細(xì)胞膜收縮然后排出EBs。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，Inc蛋白CT228、MrcA和非Inc蛋白CT622參與此過程。

CT622可調(diào)控EBs的產(chǎn)生。研究表明，CT622可被T3SS抑制劑N′-4-硝基苯并酰肼阻斷[33]。Cossé等[34]證明CT622基因表達(dá)的缺失可導(dǎo)致Ct生長(zhǎng)缺陷，構(gòu)建CT622突變株表明EBs減少，這與Ct侵襲宿主細(xì)胞和EB-RB轉(zhuǎn)化的缺陷有關(guān)。通過X射線晶體學(xué)測(cè)定了CT622 C末端的三維結(jié)構(gòu)，揭示了其與香葉基轉(zhuǎn)移酶(GGTases)和合成酶具有結(jié)構(gòu)相似性[35]。擠出過程需要肌動(dòng)蛋白聚合及RhoA、神經(jīng)性Wiskott-Aldrich綜合征蛋白(N-WASP)、肌球蛋白II和肌球蛋白磷酸酶途徑的組成部分，如肌球蛋白磷酸酶靶亞基1(MYPT1)。Lutter等[36]證明CT228與MYPT1相互作用并將其招募至包涵體周圍微區(qū)，調(diào)節(jié)EBs的擠壓釋放。MYPT1介導(dǎo)的肌球蛋白輕鏈II(MLC2)磷酸化有利于擠壓釋放，而MLC2的缺失或去磷酸化有利于溶解釋放。Nguyen等[37]確定了MrcA與Ca2+通道肌醇1,4,5-三磷酸3型受體(ITPR3)之間的相互作用，并證明Ca2+信號(hào)通路參與EBs釋放的調(diào)節(jié)。Ca2+的增加可以促進(jìn)MLC2的磷酸化激活肌球蛋白II活性，從而促進(jìn)EBs的擠壓釋放。最終，原始細(xì)胞的完整可防止炎癥物質(zhì)釋放，保護(hù)EBs免受宿主細(xì)胞免疫，從而促進(jìn)感染的持續(xù)。

2.6調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡 Ct為維持其完整的發(fā)育周期，在Ct復(fù)制的早期階段通過抑制促凋亡途徑和激活促存活途徑抑制細(xì)胞凋亡，在復(fù)制的中后期則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡使其得以繁殖。沙眼衣原體 T3SS效應(yīng)蛋白在此過程中發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，沙眼衣原體 Inc蛋白中的CpoS、IncC 和 CT383抑制宿主細(xì)胞凋亡，非Inc蛋白CADD參與宿主凋亡機(jī)制從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Sixt等[38]證明Cpos通過與GTPaes Rab4分子相互作用靶向干擾素基因刺激因子(STING)，抑制宿主細(xì)胞過早死亡以利于包涵體在宿主細(xì)胞內(nèi)完成發(fā)育周期。包涵體的過早破裂可導(dǎo)致自噬體的識(shí)別、內(nèi)在凋亡的激活以及衣原體發(fā)育周期的過早終止。Weber等[39]通過inc基因的插入誘變，證明CpoS、IncC和CT383在維持包涵體膜穩(wěn)定性方面起著重要作用。它們的缺失導(dǎo)致包涵體不穩(wěn)定，細(xì)菌及其細(xì)菌成分釋放到胞漿中從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡增加。衣原體蛋白相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(CADD)在Ct感染的晚期表達(dá)[40]，與腫瘤壞死因子(TNF)受體共同定位于包涵體附近。CADD與TNF受體家族TNFR1、Fas、DR4和DR5的死亡域相互作用，但不與相應(yīng)的下游銜接因子相互作用。并且CADD能夠結(jié)合多種含有TNF受體的死亡結(jié)構(gòu)域，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系時(shí)以caspase依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[41]。它的凋亡誘導(dǎo)作用可被caspase抑制劑阻斷，提示其通過參與宿主凋亡機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞死亡；表明CADD可調(diào)節(jié)感染細(xì)胞的凋亡途徑，揭示了宿主與病原體相互作用的新機(jī)制。

3 總結(jié)與展望

T3SS作為衣原體與宿主細(xì)胞重要的連接媒介，是有力的抗毒力靶點(diǎn)。大約10%的衣原體基因組編碼T3SS效應(yīng)蛋白[42]，從而使Ct有效侵襲宿主細(xì)胞、獲取營(yíng)養(yǎng)和逃逸固有免疫反應(yīng)。目前對(duì)T3SS效應(yīng)蛋白的功能有了一定的了解，但迄今為止尚未闡明所有功能。例如，對(duì)于調(diào)控衣原體EBs釋放機(jī)制的了解甚少。由于Ct的生存和增殖依賴于效應(yīng)蛋白的選擇性相互作用，因此對(duì)Ct更廣泛的了解將是設(shè)計(jì)或優(yōu)化抗菌藥物的有力工具。幸運(yùn)的是，最近分子遺傳學(xué)的發(fā)展使科學(xué)家更深入地分析Ct的感染生物學(xué)。通過研究Ct的發(fā)病機(jī)制和生命周期對(duì)Ct的預(yù)防和治療有重要的科學(xué)意義。

利益沖突：無