1株重組H6N2禽流感病毒全基因組特征分析

曹 藍(lán)，夏 丹，劉艷慧，曾 慶，陳藝韻，陸劍云，李魁彪，張周斌，狄 飚

禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒，根據(jù)病毒表面抗原血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，分為不同亞型：H1～H16；N1～N9[1]，2011—2016年我國家禽禽流感病毒監(jiān)測顯示，近年我國H6亞型禽流感病毒的流行呈上升趨勢[2]，同時(shí)該亞型也是我國南方地區(qū)家禽常見的禽流感病毒亞型之一[3]。研究顯示，我國早期H6亞型禽流感病毒主要為H6N1和H6N2[4]，近期主要流行亞型為H6N2和H6N6[5]。前期監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，近年來廣州地區(qū)H6亞型禽流感病毒雖為禽源本地化病毒，但HA基因已出現(xiàn)較大變異，同源性在81.0%～99.1%之間[6]，其中大部分毒株分布在ST2853-like分支，僅有1株病毒分布在ST339-like分支。因此，本研究選取ST339-like分支的A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)病毒進(jìn)行全基因組序列分析，對(duì)全面掌握廣州地區(qū)H6亞型禽流感病毒的流行和變異情況有著重要的公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1.1毒株來源 A/EN/Guanghzou/13565/2018(H6N2)毒株于2018年分離自廣州活禽市場外環(huán)境，通過雞胚接種進(jìn)行病毒的分離和純化，通過熒光定量RT-PCR方法對(duì)禽流感病毒各亞型進(jìn)行核酸檢測，鑒定為H6N2亞型禽流感病毒，將雞胚尿囊液分裝于-80 ℃冰箱長期保存。

1.2基因測序 參考NCBI數(shù)據(jù)庫中H6N2亞型禽流感病毒HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS全基因組序列，應(yīng)用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)各基因片段全長擴(kuò)增引物(表1)，引物由廣州天一輝遠(yuǎn)生物公司合成。通過反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)毛細(xì)管電泳對(duì)基因片段大小進(jìn)行鑒定后，將陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣州天一輝遠(yuǎn)生物公司，利用ABI 3730測序儀對(duì)毒株基因組進(jìn)行一代(毛細(xì)管)測序。

1.3遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用DNA Star7.1軟件拼接各基因序列。應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行各基因BLAST比對(duì)，分析基因(氨基酸)最大相似性毒株。采用MEGA 4.0軟件，以基因ORF為基本單元，參照參考文獻(xiàn)[7]選取禽流感代表株作為參比序列，繪制HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS各基因片段基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。繪制方法為Neighbor-joining法(參數(shù)設(shè)置為1000 replications)及Maximum composite likelihood model比對(duì)核苷酸序列。

表1 H6N2禽流感病毒各基因片段擴(kuò)增引物Tab.1 Amplification primers for gene fragments of the avian influenza A (H6N2) virus

1.4分子特征分析 應(yīng)用BioEdit軟件對(duì)HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M1、M2、NS1蛋白重要氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變分析。

2 結(jié) 果

2.1同源性比較 經(jīng)BLAST比對(duì)，A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)毒株各基因片段核苷酸最大相似度毒株均為國內(nèi)H6N2禽流感病毒，最大相似性在96.85%～98.22%之間。氨基酸最大相似性毒株大部分為華南地區(qū)的H6N2、H6N6毒株，其中PB2蛋白與A/duck/Guangdong/W12/2011(H3N2)同源性最高，各蛋白氨基酸最大相似性在96.30%～99.30%之間，見表2。

表2 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)各基因核苷酸和氨基酸最大相似性毒株列表Tab.2 List of strains with the greatest nucleotide and amino acid similarity for each gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

2.2遺傳進(jìn)化特征 H6N2禽流感病毒各基因片段均屬于歐亞譜系(Eurasian Lineage)，HA基因與A/duck/Shantou/339/2000(H6N2)親緣關(guān)系較近，歸屬于ST339-like分支；NA基因與A/duck/Guangdong/S1328/2010(H6N2)親緣關(guān)系較近，在HxN2不同亞型基因中歸屬于H6N2分支；PB2基因與A/duck/Guangxi/2281/2007(H6N6)親緣關(guān)系較近，歸屬于ST339-like分支；PB1基因與A/duck/Shantou/2962/2007(H6N6)親緣關(guān)系較近，歸屬于ST339-like分支；PA基因與A/duck/Shantou/7429/2006(H6N6)親緣關(guān)系較近，歸屬于ST339-like分支；NP基因與A/duck/Shantou/2962/2007(H6N6)親緣關(guān)系較近，歸屬于HN573-like分支；M基因與A/duck/Shantou/339/2000(H6N2)親緣關(guān)系較近，歸屬于ST339-like分支；NS1基因與A/duck/Guangxi/3574/2006(H6N2)親緣關(guān)系較近，歸屬于ST339-like分支，見圖1～8。

圖1 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)HA基因遺傳進(jìn)化樹Fig.1 Genetic evolution analysis of the HA gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖2 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)NA基因遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Genetic evolution analysis of the NA gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖3 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)PB2基因遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Genetic evolution analysis of the PB2 gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖4 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)PB1基因遺傳進(jìn)化樹Fig.4 Genetic evolution analysis of the PB1 gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖5 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)PA基因遺傳進(jìn)化樹Fig.5 Genetic evolution analysis of the PA gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖6 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)NP基因遺傳進(jìn)化樹Fig.6 Genetic evolution analysis of the NP gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖7 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)M基因遺傳進(jìn)化樹Fig.7 Genetic evolution analysis of the M gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖8 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)NS1基因遺傳進(jìn)化樹Fig.8 Genetic evolution analysis of the NS1 gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

2.3分子特征 在HA蛋白226和228位受體結(jié)合位點(diǎn)上，表現(xiàn)為226Q和228G，顯示該病毒優(yōu)先結(jié)合禽源受體，在HA1和HA2連接處的裂解位點(diǎn)序列為RQIETR/GLF，只有一個(gè)堿性氨基酸，符合低致病性禽流感病毒基因序列。NA蛋白274和292位耐藥位點(diǎn)上，表現(xiàn)為274H和292R，提示該病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感。NA基因共編碼469個(gè)氨基酸，頸部未發(fā)生與毒力變化相關(guān)的氨基酸缺失。在PB2蛋白89位，該病毒發(fā)生與增加小鼠致病性相關(guān)的L89V突變，在增加對(duì)哺乳動(dòng)物傳播能力的627和701位，未發(fā)生突變。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制相關(guān)的PB1蛋白368和473位，該病毒只發(fā)生L473V突變。在增加小鼠體內(nèi)復(fù)制的PB1-F2蛋白中，該病毒表現(xiàn)為34個(gè)氨基酸的截短突變。在種屬特異性相關(guān)的PA蛋白100、356和409位，該病毒只發(fā)生S409N突變。在增加對(duì)小鼠致病性相關(guān)的M1蛋白30和215位，該病毒發(fā)生N30D和T215A突變。在M2蛋白耐藥位點(diǎn)上，該病毒未發(fā)生S31N耐藥突變，提示對(duì)金剛烷胺類藥物敏感。在增加對(duì)小鼠致病性相關(guān)的NS1蛋白42和205位點(diǎn)，該病毒發(fā)生P42S和N205S突變。

3 討 論

自1965年首次從美國火雞體內(nèi)分離到H6亞型禽流感病毒以來[8]，該亞型病毒陸續(xù)在野禽和家禽體內(nèi)分離到[9]。2013—2015年廣西活禽市場H6亞型禽流感病毒陽性率為5.93%，且呈逐年上升趨勢[10]。2016—2017年廈門市活禽市場低致病性禽流感病毒陽性率高達(dá)40.4%，主要為H9和H6亞型[11]。2002—2010年華東地區(qū)的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示H3和H6亞型是主要流行的低致病性禽流感病毒亞型[12-14]。由于H6亞型禽流感病毒多為低致病性，對(duì)其研究也相對(duì)較少。2000年2月，低致病性H6N2亞型禽流感在美國加利福尼亞暴發(fā)，從散養(yǎng)的家禽和商品雞均可分離出禽流感病毒[15-16]。近年研究發(fā)現(xiàn)，H6亞型禽流感病毒可以感染人發(fā)生跨種間傳播，如2013年臺(tái)灣報(bào)道了首例人感染H6N1禽流感病毒病例[17]。血清學(xué)研究也顯示，早在2007年廣西健康人群中檢測到了H6亞型禽流感病毒抗體[18]。上述研究均提示H6亞型禽流感病毒具有突破種間屏障直接感染哺乳動(dòng)物甚至感染人的潛能，這對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅。本研究對(duì)2018年分離于廣州禽類市場外環(huán)境中的1 株H6N2禽流感病毒進(jìn)行全基因組測序，并進(jìn)行了分子遺傳特征分析，這對(duì)持續(xù)監(jiān)測H6亞型禽流感病毒的變異和預(yù)警有著重要意義。

表面基因分子特征分析顯示，該H6N2禽流感病毒優(yōu)先結(jié)合禽源受體，裂解位點(diǎn)氨基酸序列也提示符合低致病性禽流感病毒分子特征，說明該病毒尚未發(fā)生較大變異，發(fā)生跨宿主傳播的風(fēng)險(xiǎn)較低。NA蛋白和M2蛋白耐藥位點(diǎn)顯示，該病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑和金剛烷胺類藥物敏感，與大部分禽源流感病毒的耐藥特點(diǎn)一致。NA蛋白未發(fā)生頸部氨基酸缺失，提示該病毒自然宿主可能源自于水禽，與H6亞型禽流感病毒易于感染鴨鵝等水禽[19]、不易感染雞的生物學(xué)特點(diǎn)相符。進(jìn)一步對(duì)內(nèi)部基因分子特征分析顯示，該病毒在PB2-89位、PB1-473位、PB1-F2蛋白、PA-409位、M1-30/215位、NS1-42/205位均發(fā)生對(duì)哺乳動(dòng)物致病性增強(qiáng)的氨基酸變異，提示該毒株存在發(fā)生跨宿主傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

研究顯示，H6亞型禽流感病毒可以為人感染H5亞型禽流感病毒提供基因骨架，進(jìn)而增加禽流感病毒跨物種傳播風(fēng)險(xiǎn)[18]，如1997年出現(xiàn)的人感染H5N1禽流感[20]、2014年和2015年先后在我國四川和廣東出現(xiàn)的人感染H5N6禽流感[21]。本研究中遺傳進(jìn)化分析提示，該病毒NA基因來源于國內(nèi)的H6N2禽流感病毒，未發(fā)現(xiàn)與H1N2、H3N2、H4N2、H5N2、H9N2等其他HxN2禽流感病毒重組的現(xiàn)象。全基因遺傳進(jìn)化特征顯示，NP基因來源于HN573-like分支，其余基因均來源于ST339-like分支，表明該H6N2禽流感病毒為多分支進(jìn)化來源的重組病毒，提示廣州市禽類市場外環(huán)境H6N2亞型禽流感病毒存在基因重組，但重組發(fā)生的時(shí)間和環(huán)節(jié)需要進(jìn)一步的研究。

本研究率先對(duì)廣州地區(qū)禽類市場外環(huán)境H6N2亞型禽流感病毒進(jìn)行全基因組遺傳特征分析，發(fā)現(xiàn)病毒存在基因重組現(xiàn)象，該病毒雖為禽源低致病性病毒，但存在發(fā)生跨宿主傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)持續(xù)加強(qiáng)對(duì)H6N2亞型禽流感病毒的流行和變異監(jiān)測。

利益沖突：無