狂犬病治療方法及抗病毒藥物應(yīng)用的研究進(jìn)展

劉 茜，朱武洋

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的一種以侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System，CNS)為特征的高致死性的人獸共患傳染病[1]。目前狂犬病已經(jīng)在150多個國家被發(fā)現(xiàn)，并且每年約有4～7萬人死亡。在99%以上的病例中，RABV都是通過家犬傳播到人類身上[2]?？袢∨R床癥狀主要表現(xiàn)為兩種：第1種為狂躁型，表現(xiàn)為過度活躍興奮，并伴有恐水、唾液分泌較多、吞咽困難以及心律不齊等癥狀，最后以心跳呼吸停止而死亡；第2種為麻痹型，約占病例總數(shù)的30%，主要表現(xiàn)為患者的肌肉逐漸麻痹，隨后發(fā)展為昏迷、死亡。由于第2種類型經(jīng)常被誤診，導(dǎo)致了狂犬病在流行病學(xué)上數(shù)據(jù)的不完整[3-5]?？袢≡跐摲跊]有任何癥狀，一旦出現(xiàn)臨床癥狀，其病死率幾乎100%，所以，在暴露前或暴露后注射狂犬病疫苗，狂犬病的發(fā)病率會大大降低，可以起到有效預(yù)防的效果。截止目前，仍然沒有有效藥物和療法治療狂犬病，因此本文對狂犬病治療相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述和展望。

1 狂犬病治療方法

1.1古老的狂犬病治療方法 歷史上關(guān)于狂犬病的記載經(jīng)歷了幾個世紀(jì)，在此期間人類一直同狂犬病做斗爭。在公元前1世紀(jì)時期，羅馬的醫(yī)生塞利烏斯[6]就對狂犬病的發(fā)病過程進(jìn)行了較詳細(xì)和精確的記錄。他通過觀察和試驗(yàn)推測狂犬病的發(fā)病可能是由于瘋狗分泌唾液中的某些物質(zhì)傳播到被咬傷口上導(dǎo)致的，所以他嘗試采用腐蝕瓶、火罐、灼燒和吮吸等方法處理瘋狗咬傷的傷口。希臘醫(yī)生狄奧斯科里迪斯[7-8]嘗試過截肢術(shù)來治療狂犬病。到了中世紀(jì)前后，一些西方國家的醫(yī)生開始通過凈化、輸液、放血療法及藥物來治療狂犬病[9]。在中國古代，最早記錄狂犬病的書籍來自于《左傳》，人們那時已經(jīng)意識到瘋狗對人的危害極大，他們通過驅(qū)逐瘋狗來降低危害。在我國古代相關(guān)醫(yī)書的記載中，人們嘗試采用內(nèi)服和外治的方法來治療狂犬病。值得一提的是，外治的方法是使用酒來清洗被瘋狗咬傷的傷口，這個方法在現(xiàn)代療法中仍然適用。晉朝的葛洪通過觀察狂犬病的發(fā)病過程，嘗試通過使用咬傷人的狗的腦組織敷在傷口處來阻止狂犬病的發(fā)作[10]?，F(xiàn)代中國的民間醫(yī)生也有采用草藥或復(fù)方中草藥來治療狂犬病，比如采用白芷、天麻等植物外敷，之后使用防風(fēng)、羌活和紫草等進(jìn)行內(nèi)服，盡管出現(xiàn)這樣的藥方，但是效果都無從考證[11]。在印度，一些農(nóng)村醫(yī)生曾在瘋狗咬傷的傷口涂上紅辣椒來治療狂犬病[12]。

1.2密爾沃基療法 密爾沃基療法是2004年由美國的Wisconsin醫(yī)學(xué)院兒科醫(yī)院羅德尼副教授創(chuàng)建[13]。當(dāng)時該兒科醫(yī)院接收了一名15歲患狂犬病的女孩，此女孩在入院前一個月左右時左手被蝙蝠咬傷，并且前期沒有進(jìn)行暴露后預(yù)防(postexposure prophylaxis，PEP)處置，在術(shù)前檢測時發(fā)現(xiàn)該小女孩的血清和腦脊液中存在具有中和性的抗RABV抗體。隨后羅德尼醫(yī)生對小女孩采取以下的治療方案：首先以氯胺酮進(jìn)行誘導(dǎo)昏迷，之后給予抗病毒藥物利巴韋林和金剛烷胺輔助治療，最后給予患者鎮(zhèn)靜劑咪達(dá)唑侖和防止腦痙攣的苯巴比妥鎮(zhèn)靜。通過該方法成功搶救了此女孩，后來這種治療方法被稱為密爾沃基療法[1]。盡管該小女孩成為此方法治療成功的第一個案例，但是直到目前為止，關(guān)于該小女孩存活的具體原因仍然不明。在隨后使用該方法治療的其他6名發(fā)病后幸存的患者中，所有人之前都曾接種過狂犬病疫苗，并在后續(xù)觀察過程中發(fā)現(xiàn)這6名幸存者都存在一些嚴(yán)重的后遺癥，甚至出現(xiàn)死亡[14]。自從使用密爾沃基療法以來，至少有26份類似治療方法失敗的報告，甚至可能還有更多治療失敗的案例沒有被報道。其中在該療法中提到的咪達(dá)唑侖、氯胺酮和利巴韋林等藥物后來都被證實(shí)具有免疫抑制等副作用[15-16]。所以，最新的在線臨床治療中已不建議使用密爾沃基療法。

1.3狂犬病被動免疫療法 被動免疫療法是指通過輸入外源免疫效應(yīng)物質(zhì)來治療疾病的一種療法[17]，目前在狂犬病的被動免疫療法中應(yīng)用最廣的免疫效應(yīng)物質(zhì)是狂犬病免疫球蛋白(Rabies Immunoglobulin，RIG)。但由于RIG大多數(shù)來源于動物和人的血液，存在供應(yīng)不足、成本較高、半衰期短、批次不同影響穩(wěn)定性等缺點(diǎn)，人們逐漸將焦點(diǎn)放在了單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)上。近年來隨著重組單克隆抗體的不斷發(fā)展及其在腫瘤學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，單克隆抗體逐漸成為人們解決血液來源RIG局限性的可行且有前途的選擇[18]。單克隆抗體具有特異性高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)并且可以避免血液傳播等優(yōu)點(diǎn)，越來越成為抗病毒治療上的有效生物制劑[19]。目前已經(jīng)有5種候選產(chǎn)品的狂犬病病毒的單克隆抗體進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。研發(fā)最先進(jìn)的產(chǎn)品是Rabishield，它由印度PVT.LTD.血清研究所(SIIPL)生產(chǎn)，經(jīng)過2期、3期臨床試驗(yàn)評估，于2016年在印度獲得許可，并于2017年推出[20]。該產(chǎn)品是一個單一的人IgG型單抗，可以結(jié)合到RABV糖蛋白的構(gòu)象表位來中和RABV。此單抗的潛在缺點(diǎn)在于它只含有一種單克隆抗體，無法中和在秘魯蝙蝠[21-23]中發(fā)現(xiàn)的一種罕見的RABV變種。所以，該產(chǎn)品的具體實(shí)用性還有待進(jìn)一步的調(diào)查。另外還有Rabimabs和SYN023也作為兩種RABV的單克隆抗體進(jìn)入到臨床試驗(yàn)階段[23]。盡管狂犬病單克隆抗體具有醫(yī)療需求和公共衛(wèi)生益處，但產(chǎn)品要獲得批準(zhǔn)倫理上仍然充滿挑戰(zhàn)。

2 潛在抗狂犬病病毒藥物

狂犬病的治療仍然是一個世界難題，人們在不斷探索中發(fā)現(xiàn)了很多潛在抗RABV藥物和靶點(diǎn)[24-25]。與只能用作預(yù)防的疫苗相比，抗病毒藥物不僅可以用作治療，并且還具有易保存、易生產(chǎn)以及成本適中的優(yōu)點(diǎn)。另外，狂犬病的治療性抗體成本高、不易保存以及審核程序復(fù)雜，所以對于RABV自身來說，找到抗RNA病毒藥物要比疫苗和治療性抗體更加簡便。

已知對RABV具有抑制活性的主要藥物有利巴韋林、金剛烷胺和干擾素IFN-α，也有其他文獻(xiàn)報道過的T-705、香豆素和PGG等藥物。

2.1利巴韋林 利巴韋林是一種嘌呤類似物和RNA誘變劑，它可以以相同的效率摻入胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的模板中來誘導(dǎo)突變[26]。利巴韋林是一種廣泛的抗病毒劑，目前用于治療人的HCV[27]、拉沙熱病毒[28]和呼吸道合胞病毒[29]感染。有研究表明利巴韋林具有抗RABV感染的體外活性[30-31]，但是在腦內(nèi)注射利巴韋林后發(fā)現(xiàn)其對RABV街毒株感染的小鼠沒有功效。著名的密爾沃基療法中的抗病毒藥物就包括利巴韋林[1]，但是由于利巴韋林對于狂犬病患者的治療缺乏療效和存在不良反應(yīng)，致使密爾沃基療法出現(xiàn)了失敗。所以，關(guān)于利巴韋林是否可以治療狂犬病，仍然需要更多的研究和探討。

2.2干擾素 干擾素尤其是I型干擾素(IFN-α/β)，是抵抗病毒感染的重要防御手段。在包括Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)和細(xì)胞質(zhì)視黃酸誘導(dǎo)基因I(Retinoic acid-induced gene I，RIG-I))識別病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)之后，它們幾乎在所有細(xì)胞中產(chǎn)生，并誘導(dǎo)激活級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生I型干擾素。RABV進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)后會觸發(fā)先天性免疫應(yīng)答，包括I型干擾素應(yīng)答。最近的研究表明，這種應(yīng)答會限制RABV在接種部位的肌肉中傳播，并減慢向脊髓的轉(zhuǎn)移從而延緩小鼠的死亡。目前有實(shí)驗(yàn)證明用外源性干擾素治療可防止RABV在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制，尤其是在感染之前或感染后進(jìn)行治療[32]。用外源干擾素或干擾素誘導(dǎo)劑(poly I：C)進(jìn)行治療，可以部分或完全抑制小鼠和恒河猴模型中的RABV感染[33]。當(dāng)在病毒感染之前或之后大劑量使用這種化合物并盡可能靠近病毒接種部位時，療效更高。

2.3金剛烷胺 金剛烷胺是一種合成的抗病毒藥物，也是一種弱的非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)拮抗劑，它可以抑制病毒在細(xì)胞中的復(fù)制[34]。有兩項(xiàng)體外研究評估了金剛烷胺在RABV感染中的作用。其中之一是金剛烷胺可干擾CER細(xì)胞中RABV固定株(CVS-11)的復(fù)制，其劑量依賴性的抑制作用范圍從25 μg/mL抑制10%到250 μg/mL抑制99.9%[35]。當(dāng)藥物與細(xì)胞預(yù)溫育后并在病毒感染前移出時，或在吸附過程中將金剛烷胺添加到病毒中時，金剛烷胺不會抑制病毒復(fù)制，這表明病毒的附著和滲透可能不受藥物的影響，因此金剛烷胺可能會阻礙病毒的脫殼[36]。

2.4T-705 目前在抑制RNA病毒復(fù)制的分子策略中經(jīng)常將病毒酶(特別是聚合酶)作為抗病毒藥物的潛在靶標(biāo)[37]。在這樣的條件下，T-705(favipiravir)作為一種新型的廣譜RNA聚合酶抑制劑被人們廣泛關(guān)注。其顯著優(yōu)勢在于它并不干擾細(xì)胞中DNA和RNA的合成[38]。有體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明這種藥物可以抗流感病毒[39]、沙粒病毒[40]等。而Banyard AC等團(tuán)隊(duì)也評估了T-705藥物的抗RABV作用，發(fā)現(xiàn)該藥在體外實(shí)驗(yàn)中可以有效減少病毒的復(fù)制，但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中該藥在RABV暴露前和暴露后治療中效果有限[41]。所以，關(guān)于T-705抗RABV的具體作用機(jī)制，應(yīng)鼓勵研究人員去評估。

2.5香豆素 香豆素(coumarin，CM)是一類重要的含苯并α-吡喃酮結(jié)構(gòu)的芳香氧雜環(huán)化合物，其主要存在于植物的根莖葉中，也可以存在于細(xì)菌、真菌的代謝物中。根據(jù)其官能團(tuán)的不同，可以分為9種，分別命名為CM-1～9，這些化合物具有多種功能，包括抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化以及抗病毒等特點(diǎn)。在抗病毒方面，香豆素對HIV、皰疹、肝炎等具有顯著的抗病毒作用，并且有些已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[42-44]。而徐夢嫻等人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CM-3可以有效抑制RABV在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，但不能直接滅活病毒，不能阻止RABV對宿主細(xì)胞的吸附。之后通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)CM-3可將感染RABV的小鼠的存活率由0提升到12.5%[45]。因此，關(guān)于香豆素化合物是否能成為治療狂犬病的潛在藥物還有待進(jìn)一步研究。

2.61,2,3,4,6-五沒食子?；咸烟?penta-O-galloyl-beta-D-glucose，PGG) PGG屬于水解鞣質(zhì)多酚類化合物，廣泛存在各種草藥中，如鹽膚木屬、牡丹屬和芍藥屬。它具有多種生物學(xué)活性，包括抗癌、消炎、抗氧化作用，同時它還具有廣泛的抗病毒作用[46-47]，涂忠忠等人發(fā)現(xiàn)PGG 不僅可以直接滅活RABV、抑制病毒的吸附和侵入，而且可以在病毒感染后抑制病毒基因和蛋白的表達(dá)。其中體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 PGG 可緩解感染RABV小鼠的臨床癥狀，并且可降低 27.3%的死亡率[48]。未來需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來證實(shí)它的可靠性。

3 展 望

狂犬病的病死率幾乎100%的原因有4點(diǎn)。第一，從RABV傳播途徑可知它并不像其他病毒那樣通過自身強(qiáng)大的復(fù)制能力抵御機(jī)體的免疫系統(tǒng)或者通過攻擊免疫能力下降的宿主來繁殖，它主要是通過免疫豁免的神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行傳播和復(fù)制，這樣不僅為該病毒傳播提供了充足的時間，并且也正好逃避了人免疫系統(tǒng)的攻擊，因此RABV的嗜神經(jīng)特性是導(dǎo)致狂犬病致死的主要原因[49]。第二，RABV在感染機(jī)體后并不能引起足夠的天然免疫反應(yīng)來反抗病毒，所以狂犬病在潛伏期缺乏明顯的癥狀，阻礙狂犬病早期診斷也成為狂犬病高度致死的原因之一[50]。第三，RABV可以被狂犬病毒抗體中和，但是有效的抗體無法通過血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這也是狂犬病致死的一大原因[51]。第四，當(dāng)前沒有有效的用于體內(nèi)殺滅或抑制RABV的藥物。因此，本文也對未來狂犬病治療方面的研究進(jìn)行展望。

3.1血腦屏障的突破 RABV抗體可在體外或病毒進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)前高效中和RABV[52]。然而，一旦病毒進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這些抗體就被限制通過具有免疫特權(quán)的血腦屏障，從而不能中和感染的病毒[53-54]。雖然從理論上講，這種抗體可以在腦內(nèi)注射，但它絕對不是一種實(shí)用的治療方法，所以提高血腦屏障的通透性至關(guān)重要。已有報道稱RABV的弱毒株、細(xì)胞因子MCP-1等物質(zhì)可以增強(qiáng)血腦屏障的通透性使免疫細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)消滅病毒[55]。另外，有人在小鼠實(shí)驗(yàn)中通過使用細(xì)胞因子MCP-1增強(qiáng)血腦屏障的通透性后，靜脈注射病毒中和抗體可以清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)的RABV，并且延長了感染RABV小鼠的生存時間[56]。此研究正好為狂犬病的臨床治療提供了基礎(chǔ)，例如可以采用提高血腦屏障通透性的藥物或弱毒株等打開血腦屏障，之后通過注射抗體或抗病毒藥物中和或殺滅病毒。

3.2神經(jīng)或免疫細(xì)胞相關(guān)信號通路 有研究發(fā)現(xiàn)在感染RABV實(shí)驗(yàn)小鼠的大腦中，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡相較于免疫細(xì)胞并不明顯，這種差異是由于RABV通過將其自身基因表達(dá)維持在閾值水平以下來干擾促凋亡因子，從而保證了受感染神經(jīng)元的存活[57]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)RABV通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其途徑包括線粒體膜電位的改變、細(xì)胞色素C的釋放，這些結(jié)果提示RABV在不同感染階段利用線粒體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，從而為病毒復(fù)制和傳播提供條件[58]。所以未來在治療狂犬病方面，神經(jīng)細(xì)胞中的線粒體相關(guān)信號通路的變化以及免疫細(xì)胞的凋亡相關(guān)問題可以是進(jìn)一步研究的方向[59]，通過找到相關(guān)靶點(diǎn)來篩選特定藥物以達(dá)到治療的目的。

3.3狂犬病病毒G蛋白 有報道稱RABV誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞凋亡依賴于糖蛋白的限制性表達(dá)，其中包括G蛋白羧基端PDZ域結(jié)合基序的4個氨基酸。G蛋白表達(dá)量越低，狂犬病的致病性越強(qiáng)，因此，未來以降低G蛋白的表達(dá)為策略尋找相關(guān)治療方法也可以作為治療狂犬病的一個重要手段[60]。

3.4治療性疫苗 在狂犬病治療方面也有一些其他的探索，例如狂犬病的治療性疫苗，傅振芳團(tuán)隊(duì)利用無致病力的5型副流感病毒(PIV5)表達(dá)RABV的G蛋白，作為RABV感染的治療方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PIV5-G可以在RABV感染后的6 d之內(nèi)保護(hù)小鼠。因此該P(yáng)IV5-G可以用于預(yù)防和治療RABV感染的候選疫苗[61]。未來開展治療性疫苗與治療性抗體相結(jié)合的方法也是一種治療狂犬病的策略。

4 總 結(jié)

狂犬病當(dāng)前仍然是沒有治愈方案的傳染病，人們嘗試通過不同方法去治療，但是療效甚微，而抗病毒療法是目前開發(fā)有效的人類狂犬病治療的重要組成部分。開發(fā)包括具有廣譜活性的T-705等抗病毒藥物，盡管會存在不同缺點(diǎn)，但是通過優(yōu)化使用條件或者聯(lián)合使用對治療狂犬病仍然具有重大意義。最后，通過新的靶向方法，包括RABV的G蛋白的表達(dá)、線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、神經(jīng)元的氧化損傷等都是未來可以研究探討的內(nèi)容。隨著我們對RABV致病機(jī)制的進(jìn)一步深入研究，將會發(fā)現(xiàn)更為有效的狂犬病治療方法。

利益沖突：無