“免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)牛初乳免疫球蛋白方法建立”項(xiàng)目方案

王明利，周珍輝，張 浩

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系 102442）

1 項(xiàng)目研究背景、目的與意義

初生犢牛的主動(dòng)免疫系統(tǒng)尚未成熟，處在發(fā)育階段，同時(shí)，由于牛胎盤結(jié)構(gòu)的特殊性結(jié)構(gòu)，母源性抗體難以通過(guò)胎盤屏障進(jìn)入胎兒血液循環(huán)系統(tǒng)，導(dǎo)致?tīng)倥３錾皼](méi)有獲得被動(dòng)免疫能力[1]，因此，剛出生的犢牛對(duì)外界任何病原微生物的抵抗力幾乎是零抵抗。初乳，即奶牛分娩后第一次擠出的乳，含有豐富的免疫球蛋白，也就是母源性抗體，初乳中含有如胰島素等生物活性物質(zhì)、激素及生長(zhǎng)因子[2]，是初生犢牛在產(chǎn)后2個(gè)月健康成長(zhǎng)、建立被動(dòng)免疫系統(tǒng)唯一物質(zhì)。犢牛出生后對(duì)免疫球蛋白的吸收與時(shí)間關(guān)系密切相聯(lián)，最初幾個(gè)小時(shí)免疫球蛋白的吸收率最高，平均為30%，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)免疫球蛋白的吸收率急劇下降，尤其出生24h后無(wú)法吸收完整的免疫球蛋白抗體。如果犢牛出生24h飼喂初乳，那么將導(dǎo)致50%以上的犢牛因缺乏免疫力而難以成活[3]。充足高質(zhì)量初乳可以幫助新生犢牛盡快建立起被動(dòng)免疫系統(tǒng)，從而提高成活率、增加日體重。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)[4]。

免疫膠體金技術(shù)隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展而快速發(fā)展，免疫膠體金技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速出結(jié)果且結(jié)果易于判定、特異性好、不需要任何復(fù)雜的儀器、適用現(xiàn)場(chǎng)操作等特點(diǎn)，所以廣泛地應(yīng)用在獸醫(yī)臨床診斷中，本研究旨在建立免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)初乳中免疫球蛋白含量的快速測(cè)定方法，并在奶牛生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

2 主要研究?jī)?nèi)容及預(yù)期目標(biāo)

2.1 主要研究?jī)?nèi)容

2.1.1 兔抗牛免疫球蛋白抗血清的制備及抗體的純化

試驗(yàn)兔抗牛免疫球蛋白抗血清的制備包括兔的免疫及血清分離；抗體純化包括DEAE-纖維素的活化、裝柱、加樣、洗脫和測(cè)定[4]。

2.1.2 免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)初乳免疫球蛋白方法的推廣應(yīng)用

將通過(guò)上述步驟建立的免疫膠體金測(cè)定初乳免疫球蛋白方法在奶牛場(chǎng)推廣應(yīng)用，進(jìn)一步摸索應(yīng)用條件和檢測(cè)條件，并制定相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 免疫膠體金檢測(cè)牛初乳免疫球蛋白含量方法的建立

2.2.1 膠體金顆粒制備采用檸檬酸三鈉還原法 用超純水把1%氯金酸溶液稀釋100倍，濃度為0.01%，用微量移液器吸取0.01%氯金酸溶液50mL于三角瓶，置于電熱板煮沸，準(zhǔn)確量取一定量1%檸檬酸三鈉溶液加入三角瓶中，輕輕搖勻繼續(xù)煮沸，直至氯金酸溶液由藍(lán)色變成紅色，繼續(xù)加熱4min[5]。冷卻至室溫加超純水至原體積，無(wú)菌密封保存。在電鏡下觀察，如果顆粒大小均勻、近似圓形，說(shuō)明制作的膠體金顆粒合格，通過(guò)調(diào)節(jié)l%檸檬酸三鈉的用量，實(shí)現(xiàn)直徑為2Onm的膠體金制備。

2.2.2 膠體金標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)牛免疫球蛋白的制備 通過(guò)試管法確定蛋白最小標(biāo)記量以及膠體金標(biāo)記蛋白最適宜的pH值[6]。將標(biāo)準(zhǔn)牛免疫球蛋白溶液加入膠體金溶液中，加入終濃度的牛血清白蛋白。采用超速低溫離心法純化金標(biāo)蛋白[7]。

2.2.3 檢測(cè)膜片的制備 用包被緩沖液把兔抗牛免疫球蛋白稀釋成6種不同濃度，在每個(gè)硝酸纖維素膜片上選擇6個(gè)不同的點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)滴10μL，室溫陰干，在封閉液中封閉2h，再用PBS洗滌2次[8]，室溫陰干，4℃保存?zhèn)溆谩缓玫南跛崂w維素膜與金標(biāo)蛋白反應(yīng)，觀察硝酸纖維素膜上點(diǎn)的顏色，確定硝酸纖維素膜膜上抗體最佳包被濃度[9]。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)參照物的制備 將檢測(cè)膜片分別與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛免疫球蛋白反應(yīng)洗滌。取出用濾紙吸干，再與金標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)牛免疫球蛋白反應(yīng)5min后洗滌[10]。觀察與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛免疫球蛋白反應(yīng)的硝酸纖維素膜膜上紅色點(diǎn)的個(gè)數(shù)及顏色深淺變化，作為標(biāo)準(zhǔn)參照樣以判定待檢樣品的濃度[9]。

2.2.5 樣品的檢測(cè) 將牛初乳樣品離心，取中間層，將乳清適當(dāng)稀釋與檢測(cè)膜片反應(yīng)。取出膜片洗滌，再與金標(biāo)蛋白反應(yīng)，與標(biāo)準(zhǔn)參照物對(duì)比[11]，確定待測(cè)樣品的濃度。

2.3 預(yù)期目標(biāo)

本研究采用免疫膠體金技術(shù)測(cè)定牛初乳免疫球蛋白，通過(guò)試驗(yàn)建立起免疫膠體金半定量檢測(cè)牛初乳以及乳制品中免疫球蛋白含量的方法，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)、快速、簡(jiǎn)便易行的牛場(chǎng)初乳免疫球蛋白含量測(cè)定。

3 研究方法、技術(shù)路線及實(shí)施方案

3.1 兔抗牛lgG抗血清的制備及抗體的純化

3.1.1 兔抗牛免疫球蛋白抗血清的制備

第一次免疫用弗氏完全佐劑抗原，在兔子皮下選沒(méi)有重復(fù)的6個(gè)點(diǎn)進(jìn)行注射，3周后進(jìn)行第二次注射，選擇弗氏不完全佐劑抗原注射，第4周進(jìn)行第3次注射，7d后采兔子耳靜脈血，測(cè)定血清效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)1∶16的效果，可以進(jìn)行心臟采血，分離血清，-20℃凍存[12]。

3.1.2 抗體純化

取1O deae-纖維素浸泡在1000 mL蒸餾水中攪勻，靜置、取細(xì)顆粒，用1000mL氫氧化鈉溶液洗滌大約1h，再用蒸餾水沖洗至pH值接近7，做為緩沖液備用，采用重力沉降的原理裝柱子，柱子選用直徑2cm，長(zhǎng)20cm的玻璃柱。血清用洗脫緩沖液透析，微孔膜過(guò)濾，4℃離心，加樣，洗脫，測(cè)定獲取的蛋白的純度[13]。

3.2 免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)初乳免疫球蛋白方法的推廣應(yīng)用

將通過(guò)上述步驟建立的免疫膠體金測(cè)定初乳免疫球蛋白方法在奶牛場(chǎng)推廣應(yīng)用，進(jìn)一步摸索應(yīng)用條件和檢測(cè)條件，并制定相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

4 重點(diǎn)、難點(diǎn)和創(chuàng)新之處

本研究將免疫膠體金技術(shù)引入定量測(cè)定牛初乳免疫球蛋白，通過(guò)試驗(yàn)建立起免疫膠體金半定量檢測(cè)牛初乳及制品中免疫球蛋白含量的方法，實(shí)現(xiàn)適合牛場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)、快速、簡(jiǎn)便易行的牛場(chǎng)初乳免疫球蛋白含量測(cè)定。重點(diǎn)在于兔抗牛免疫球蛋白的制備和純化、膠體金標(biāo)記蛋白最適標(biāo)記量和最適PH值的確定、檢測(cè)膜片與金標(biāo)蛋白最佳反應(yīng)時(shí)間的確定等。

5 實(shí)現(xiàn)本項(xiàng)目預(yù)期目標(biāo)已具備的條件

作者近年來(lái)主要從事動(dòng)物性食品衛(wèi)生檢驗(yàn)的教學(xué)與研究工作，在奶牛營(yíng)養(yǎng)代謝病的防治和犢牛健康保健技術(shù)方面做了較為廣泛的研究，對(duì)奶牛營(yíng)養(yǎng)，特別是犢牛飼養(yǎng)管理方面的營(yíng)養(yǎng)管理方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。

項(xiàng)目的實(shí)施依托“現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系北京市奶牛創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)農(nóng)職院綜合試驗(yàn)站”和北京市奶牛產(chǎn)業(yè)科技資源站。近年來(lái)，項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)已承擔(dān)并完成多項(xiàng)項(xiàng)目研發(fā)與技術(shù)推廣工作。以北京農(nóng)職院為第一完成單位奶牛健康養(yǎng)殖技術(shù)創(chuàng)新與集成推廣”項(xiàng)目榮獲2013年度北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)。項(xiàng)目的“團(tuán)隊(duì)成員學(xué)歷層次高，學(xué)術(shù)背景好，研發(fā)能力強(qiáng)，專業(yè)涉及臨床獸醫(yī)、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)等方面，完全有能力承擔(dān)并完成該項(xiàng)研究任務(wù)。項(xiàng)目申請(qǐng)單位已建立起專業(yè)化的“牛病診治實(shí)驗(yàn)室”平臺(tái)，有Bio-Rad酶標(biāo)儀、全自動(dòng)生化檢測(cè)儀、全自動(dòng)乳成分分析儀等設(shè)備。因此，本項(xiàng)目的實(shí)施具備了必須的儀器設(shè)備和試驗(yàn)條件。